慢性阻塞性肺疾病急性加重痰热证与痰湿证动物模型炎症因子表达的比较研究（可编辑）

慢性阻塞性肺疾病急性加重痰热证与痰湿证动物模型炎症因子达的比较研究（可编辑） 中华危重病急救医学 2013年 6月第 25卷第 6期 Chin Crit Care Med,June 2013,Vol.25,No.6 ? 343? ?论著? 慢性阻塞性肺疾病急性加重痰热证与痰湿证 动物模型炎症因子表达的比较研究 梅雪 李建生 周红艳 乔翠霞 李素云 张艳霞 【摘要】 目的 从炎症因子表达方面揭示慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)痰热证与痰湿证动物 模型的特点。 方法 按随机数字表法将48只Wistar大鼠分为正常对照组、AECOPD组、AECOPD痰热证组和 AECOPD痰湿证组,每组12只。 采用免疫组化法测定肺组织白细胞介素(IL-1茁、IL-6、IL-10)、肿瘤坏死因 子-α(TNF-α)的蛋白表达,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织IL-1茁、IL-10的mRNA表达。 结果 AECOPD组、AECOPD痰热证组和AECOPD痰湿证组炎症因子mRNA及蛋白表达均显著高于正常对照 组。 与AECOPD组比较,AECOPD痰热证组、AECOPD痰湿证组肺组织IL-1β、TNF-琢、IL-6蛋白和IL-1茁 mRNA表达显著升高(IL-1茁蛋白:6.26?2.43、8.20?2.61比4.30?2.38,TNF-琢蛋白:10.28?2.64、10.67? 2.68比7.47?2.90,IL-6蛋白:8.13?3.03、10.45?3.37比5.66? 3.18,IL-1茁mRNA:0.41?0.03、0.48?0.05比 0.35?0.04, 均P<0.01),IL-10的蛋白和mRNA表达显著降低(IL-10蛋 白:7.00?1.89、4.70?2.31比9.33? 2.58,IL-10 mRNA:0.43?0.05、0.35?0.03比0.52?0.06,P<0.05或 P<0.01)。 与AECOPD痰热证组比较, AECOPD痰湿证组的IL-1茁蛋白和mRNA、IL-6蛋白表达明显增加,IL-10蛋 白和mRNA表达明显减弱(均 P<0.05)。结论 AECOPD痰湿证较AECOPD痰热证IL-1茁、IL-6表达增 强,IL-10表达减弱,这可能是痰湿证 肺组织损伤严重且临床恢复缓慢的主要原因,有待于进一步研究。 【关键词】 肺疾病,阻塞性,慢性; 急性加重期; 痰湿证; 痰热证; 炎症因 子 A comparative study of inflammatory factor expression of phlegm-heat syndrome and phlegm-dampness syndrome model with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease MEI Xue*, LI Jian- sheng, ZHOU Hong-yan, QIA0 Cui-xia, LI Su-yun, ZHANG Yan-xia. * Institute of Geriatrics, Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, Henan, China Corresponding author: LI Jian-sheng, Email: li_ js8@163 【 】 Abstract Objective To reveal characteristic of phlegm-heat syndrome and phlegm-dampness syndrome of acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (AECOPD) from expression of inflammatory factor. Methods Forty-eight Wistar rats were randomly divided into four groups (each n=12): normal control group, AECOPD group,phlegm-heat syndrome of AECOPD group (PHs group)and phlegm-dampness syndrome of AECOPD group (PDs group). The expressions of interleukins (IL-1茁, IL-6, IL-10), tumor necrosis factor-α(TNF-α) proteins in lung tissue were detected by immunohistochemical staining method. IL-1茁 mRNA and IL-10 mRNA expressions were measured by reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The mRNA and protein expressions of inflammatory factors in lung tissue in AECOPD group,PHs group and PDs group were remarkably enhanced compared with those in normal control group. Compared with AECOPD group, the protein expressions of IL-1茁,TNF-琢and IL-6 and the mRNA expression of IL-1茁in lung tissue in PHs group and PDs group were markedly enhanced (IL-1茁protein:6.26?2.43,8.20?2.61 vs. 4.30?2.38,TNF- 琢protein:10.28?2.64,10.67?2.68 vs. 7.47?2.90,IL-6 protein: 8.13?3.03, 10.45?3.37 vs. 5.66?3.18, IL-1茁 mRNA: 0.41?0.03, 0.48?0.05 vs. 0.35?0.04,all P<0.01),and the expressions of IL-10 protein and IL-10 mRNA were obviously weakened (IL-10 protein:7.00?1.89,4.70?2.31 vs. 9.33?2.58,IL-10 mRNA:0.43?0.05,0.35?0.03 vs. 0.52?0.06,P<0.05 or P<0.01). The protein expressions of IL-1茁and IL-6 proteins and the mRNA expression of IL-1茁in PDs group were significantly higher than those in PHs group,while the expressions of IL-10 protein and IL-10 mRNA were evidently lowered (all P<0.05). Conclusions There were more strong expressions of IL-1茁 and IL-6 and more weaken expressions of IL-10 in phlegm-dampness syndrome than in phlegm-heat syndrome, which may be one of the main reason of serious damage in lung tissue and delayed recovery of the patient with phlegm-dampness syndrome of AECOPD. All the above findings need further investigation. 【Key words】 Chronic obstructive pulmonary disease; Acute exacerbation; Phlegm-dampness syndrome; Phlegm-heat syndrome; Inflammatory factor DOI:10.3760///.n.2095-4352.2013.06.007 基金项目:国家自然科学基金项目(81202658,30772797) 作者单位:450008 郑州,河南中医学院老年医学研究所(梅雪、李建生、李 素云、张艳霞);450004 郑州,河南省中医药 研究院(周红艳、乔翠霞) 通信作者:李建生,Email:li_js8@163? 344? 中华危重病急救医学 2013年 6月第 25卷第 6期 Chin Crit Care Med,June 2013,Vol.25,No.6 痰热壅肺证和痰湿阻肺证是慢性阻塞性肺疾病 每次1 h,连续 9 d,于第 13周第 6日经鼻滴菌 [1] 14 急性加重期(AECOPD)最为多见的两种证型 。本课 液(6×10 CFU/ml)0.3 ml, 每日2次,连续4 d,制备 [ ] 3 组前期成功建立了AECOPD痰热证和痰湿证大 AECOPD痰湿证模型 。于第14周第3日取材进行 鼠模型,并从炎症反应、激素水平等方面评价了这两 指标检测。 [2-3] 种模型的异同点 。 在此基础上,本研究从促炎因 本实验动物处置方法符合动物伦理学。 子和抗炎因子表达方面寻找两种模型的异同和特 1.3 检测指标与方法 点, 为揭示中医证候的科学内涵和制定治疗策略提 1.3.1 肺组织病理观察:苏木素-伊红(HE)染色, 供依据。 光镜下观察。 1 材料与方法 1.3.2 炎症因子蛋白表达测定: 采用免疫组化过 1.1 实验动物及主要试剂:Wistar大鼠48只,雌雄 氧化物酶标记的链霉卵白素法(SP法)检测肺组织 各半,体质量(200?20)g,由河南省实验动物中心 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10蛋白表达,光镜下观察 提供,动物合格证号:SCXK(豫)2005-0001。 肺炎克 细胞膜和细胞质染成棕色为阳性。 每张切片随机选 雷伯杆菌(菌号46114,中国生物制品检验鉴定所提 取5个视野, 使用Image pro plus 5.1图像采集与分 8 14 供)使用时调整为6×10 CFU/ml、6×10 CFU/ml。 析软件拍照并测其积分吸光度(A)值。 白细胞介素(IL-1茁、IL-6、IL-10)、肿瘤坏死因子-琢 1.3.3 炎症因子基因表达测定:采用逆转录 -聚 (TNF-琢)单克隆抗体(单抗)试剂盒为武汉博士德生 合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织 IL-1茁、 IL-10 物有限公司产品。逆转录(RT)试剂盒购自立陶 mRNA表达。PCR扩增产物经2%琼脂糖电泳后,用 宛Fermentas公司。 IL-1茁、IL-10和内参照茁-肌动 Bio2VT凝胶成像系统成像。Quantity one 软件对图像 蛋白(茁-actin)的引物序列及扩增片段长度见表1, 进行半定量分析, 以待测基因与β-actin的电泳带 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。 灰度值比值反映该基因的相 对表达量。 1.4 统计学方法: 采用SPSS 13.0统计分析软件进 表 1 炎症因子引物序列及扩增片段 行分析,计量资料以均数?标准差(x?s)表示,各组 基因 扩增片段 间比较方差齐时采用单因素方差分析, 方差不齐时 引物序列 名称 (bp) 采用非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。 IL-1茁 上游5'-GCAACTGTCCCTGAACTCAAC T-3' 249 2 结 果 下游5'-AAGCTCCACGGGCAAGACAT-3' IL-10 上游5'-CACTGCTATGTTGCCTGCTCTT -3' 411 2.1 肺组织病理改变:正常对照组大鼠肺组织结构 下游5'- CTGCTCCACTGCCTTGCTTTTAT -3' 正常。 AECOPD组可见气管周围大量中性粒细胞弥 茁-actin 上游5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3' 454 漫浸润,气管、支气管黏膜纤毛上皮倒伏、脱落,局部 下游5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3' 注:IL-1β:白细胞介素-1β,IL-10:白细胞介素-10,β-actin: 变性坏死,黏膜内腺体肥大、增生,肺泡管、肺泡囊扩 β-肌动蛋白 张,间隔变窄,肺泡间孔扩大,部分肺泡壁间隔断裂, 1.2 动物分组及不同证型AECOPD模型制备:按照 肺泡融合,间质毛细血管扩张、充血。 AECOPD痰热 随机数字表法将大鼠分为正常对照组、AECOPD组、 证组气管壁内以中性粒细胞为主的炎性细胞弥漫浸 AECOPD痰热证组和AECOPD痰湿证组4组,每组 润,气管、支气管黏膜上皮层次变薄,杯状细胞增多, 8 12只。吸取肺炎克雷伯杆菌菌液(6×10 CFU/ml) 肺泡管、 肺泡囊明显扩大, 扩张的肺泡融合形成囊 0.1 ml滴入大鼠鼻腔,每5 d 1次,连续12周,并将 腔,可见肺大泡,肺泡毛细血管床减少。 AECOPD痰 大鼠置于烟熏箱内(烟雾浓度约为5%),每日2次 湿证组气管黏膜层、 黏膜下层中性粒细胞、 淋巴细 (间隔3 h),每次30 min,连续12周,制备慢性阻塞 胞、浆细胞等弥漫浸润,管腔内充满中性粒细胞、巨 [4] 性肺疾病(COPD)稳定期大鼠模型 。 于第13周开 噬细胞及黏液,气管、支气管黏膜上皮脱落,多见肺 始将大鼠置于鼓风干燥箱〔温度(39?1)?、湿度 大泡,部分血管内膜呈纤维素性增厚。 50%、风速1.0 m/s〕中,每日2次,每次30 min,连续 2.2 肺组织IL-1β、 TNF-α、IL-6、IL-10的蛋白表 14 9 d,于第13周第6日经鼻滴菌液(6×10 CFU/ml) 达(表2):与正常对照组比较,AECOPD组、AECOPD 0.3 ml,每日2次,连续4 d,制备AECOPD痰热证模 痰热证和痰湿证组肺组织 IL-1β、TNF-α、IL-6、 [ ] 2 型 。 第13周开始将大鼠置于寒冷环境(温度为 IL-10蛋白表达均显著增强(P<0.05或P<0.01)。 -8 ?,湿度为75%,风速为0.6 m/s)中,每日2次, 与 AECOPD组比较,AECOPD痰热证和痰湿证组中华危重病急救医学 2013年 6月第 25卷第 6期 Chin Crit Care Med,June 2013,Vol.25,No.6 ? 345? 表 2 不同证型AECOPD大鼠肺组织炎症因子蛋白及基因表达比较(x?s) 蛋白表达(A值) mRNA表达 组别 动物数 IL-1茁 TNF-琢 IL-6 IL-10 IL-1茁 IL-10 正常对照组 12 0.53?0.45 2.22?1.40 1.70?0.54 1.80?1.96 0.24?0.01 0.20?0.02 a a a a a a AECOPD组 12 4.30?2.38 7.47?2.90 5.66?3.18 9.33?2.58 0.35?0.04 0.52?0.06 ac ac ac ac ac ac AECOPD痰热证组 12 6.26?2.43 10.28?2.64 8.13?3.03 7.00?1.89 0.41?0.03 0.43?0.05 ade ac ade bde ade ade AECOPD痰湿证组 12 8.20?2.61 10.67?2.68 10.45?3.37 4.70?2.31 0.48?0.05 0.35?0.03 注:AECOPD:慢性阻塞性肺疾病急性加重期,IL-1茁:白细胞介素-1茁,IL-6:白细胞介素-6,IL-10:白细胞介素-10,TNF-琢:肿瘤坏死 a b c d e 因子-琢;与正常对照组比较,P<0.01,P<0.05;与AECOPD组比较,P<0.05,P<0.01;与AECOPD痰热证比较,P<0.05 IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达升高,而IL-10蛋白 显示,AECOPD组、AECOPD痰热证组、AECOPD痰 表达降低(P<0.05或P<0.01)。与AECOPD痰热证 湿证组肺组织促炎因子IL-1茁、TNF-琢、IL-6的蛋白 组比较,AECOPD痰湿证组IL-1β、IL-6蛋白表达 及基因表达均较正常对照组显著升高, 表明这些促 增加,IL-10蛋白表达降低(均P<0.05)。 炎因子参与了AECOPD、AECOPD痰热证、AECOPD 2.3 肺组织IL-1β、IL-10的mRNA表达(表2): 痰湿证的发生发展。AECOPD痰热证组、AECOPD痰 AECOPD组、AECOPD痰热证和痰湿证组肺组织 湿证组IL-1茁、TNF-琢、IL-6 表达水平较AECOPD IL-1β、IL-10的mRNA表达均较正常对照组显著 组明显升高, 且AECOPD痰湿证组IL-1茁、IL-6表 增强(均P<0.01)。 与AECOPD组比较,AECOPD 达强于痰热证组, 这可能是导致肺组织炎症损伤在 痰热证和痰湿证组IL-1βmRNA表达增强,IL-10 AECOPD痰湿证组>AECOPD痰热证组>AECOPD mRNA表达减弱(P<0.05或P<0.01)。与AECOPD 组的原因。 此外,本课题组以往的研究结果证实,肺 痰热证组比较,AECOPD痰湿证组IL-1βmRNA表 功能的损伤程度由重到轻依次是痰湿证、 痰热证、 [3] 达较强,IL-10 mRNA表达较弱(均P<0.05)。 AECOPD 。 结合本实验结果可以推测,炎症因子的 3 讨 论 表达与肺功能损伤呈正相关,与文献[9]结果一致。 COPD已成为造成人类死亡的主要原因。 研究 IL-10是机体主要的抗炎因子, 在AECOPD、 [5] 表明,中医辨证治疗AECOPD效果明显,廖文生等 AECOPD痰热证和痰湿证情况下,TNF-α等促炎 给予AECOPD患者具有益气温阳作用的参附注射 因子大量合成和释放, 刺激IL-10大量生成并参与 液治疗发现, 其可通过调节细胞因子TNF-琢、IL-2 负反馈调节炎症反应的过程。 另外, 本研究发现, [6] 而明显改善患者症状。李建生等 临床研究发现:采 AECOPD痰热证和痰湿证组大鼠肺组织IL-10的 用活血化瘀方药治疗AECOPD血瘀证患者临床疗 mRNA及蛋白表达较AECOPD组显著降低,其中痰 效明显,可明显改善患者的临床症状和肺功能,促进 湿证组尤为明显; 表明抗炎因子IL-10表达减弱以 炎症吸收,提高氧合和降低CO 潴留,最终提高生活 及上述促炎因子表达增强导致的炎症失衡可能是 2 [7] 质量。 张楚明等 较长时间应用中西医结合法治疗 AECOPD痰湿证模型肺组织损伤较AECOPD痰热 73例COPD合并呼吸衰竭(呼衰)并机械通气的患 证重的原因, 也可能是临床上痰湿证患者恢复缓慢 [ ] 8 者,其疗效明显优于单纯西医治疗组。赵巍等 研究 的主要因素,其机制有待进一步探讨。 亦发现: 在常规西医综合治疗基础上针对患者证候 参考文献 [1] 余学庆,李建生,李力. 慢性阻塞性肺疾病(COPD)中医证候分 的不同加用中药治疗,其血气分析指标、总有效率均 布规律研究. 河南中医学院学报,2003,18:44-46. 高于对照组。 本课题组基于已成功建立的AECOPD [2] 李建生,周红艳,乔翠霞,等. 慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰 热证模型的建立与评价. 中国中医基础医学杂志,2010,16: 痰热证和痰湿证模型, 从IL-1β、TNF-α、IL-6、 553-556. IL-10表达方面比较两种证型的特点, 为临床辨证 [3] 李建生,李素云,张艳霞,等. 慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰 热证与痰湿证模型生物学指标的比较研究. 中国危重病急救 分型提供参考。 医学,2010,22:267-270. IL-1β、TNF-α、IL-6在炎症发生发展过程中 [4] 许浒,熊密,黄庆华. 细菌感染导致慢性阻塞性肺疾病大鼠模 型的探讨. 中华结核和呼吸杂志,1999,22:739-742. 起关键的作用。 IL-1β、TNF-α作为关键细胞因子 [5] 廖文生,李卫青,陈世伟,等. 参附注射液对慢性阻塞性肺疾病 [ ] 9 激活炎症级联反应可导致慢性炎症的加剧 。 研究 急性加重期患者炎症细胞因子和肺功能的影响. 中国中西医 证实,IL-1β、TNF-α水平是反映肺部感染及损伤 结合急救杂 志,2008,15:149-151. [6] 李建生,李彬,余学庆,等.活血化瘀方药治疗血瘀证慢性阻塞 [10] 程度的良好指标 。另有研究证实:COPD患者痰液 性肺疾病急性加重期的临床疗效评价.中国中西医结合急救杂 [ ] 11 中TNF-α、IL-6含量增加预示病情恶化 。本研究 志,2011,18:9-13.