大肠杆菌的纯化

大肠杆菌的纯化 大肠杆菌纯化 一、 制作细菌培养基 1、LB培养基配方:1L内含 胰氏蛋白胨10g 酵母提取液5g NaCl 10g PH7.0 2、培养基的分装 选用500ml毫升锥形瓶，分别倒入300ml培养基(固体培养基先放入一定比例的琼脂再倒液体)，用棉塞封口，等待灭菌。 3、 培养基的灭菌 培养基采用湿热法灭菌。(湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。)使用高压蒸汽灭菌锅，利用电热丝加热水产生蒸汽，并能维持一定压力的装置。主要有一个可以密封的桶体，压力，排气阀，安全阀，电热丝等组成。 原理:利用高压蒸汽穿透力强，灭菌效果好的特点的。:?湿热中蛋白吸收水份，更易凝固变性;?水分子的穿透力比空气大，更易均匀传递热能;?蒸汽有潜热存在，每1克水由气态变成液态可释放出529卡热能，可迅速提高物体的温度。湿热灭菌法一般采用121摄氏度，灭菌20-30min。 二、 微生物接种技术 方法:(一)接种准备 清洁超净工作台，把乙醇灯及已灭菌的培养基和接种工具放到台面上，开启鼓风机，紫外灯灭菌30min。于工作台前用稀释乙醇擦手灭菌，点燃乙醇灯，剥去接种工具外包装，放在台面内侧备用。 (二)接种 平板接种(1)到平板 将培养基融化，冷却到50~60?(不烫手)，在火焰胖，右手持盛培养基的锥形瓶，用左手将棉塞轻轻拔出，瓶口在火焰上均匀过火灭菌，然后左手将无菌培养皿在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约12~15ml，加盖后轻轻摇动培养皿使培养基分布均匀，平放于桌面上，待凝固后即成平板。用记号笔注明菌种名、接种者、接种日期。操作时在火焰侧面，皿盖不要打开过大，注意玻璃器皿勿被火焰烤裂。 (2)接种 用接种环在火焰外侧烧红3次，冷却后挑取菌种，划线接种，分三个区域划线，划A区:将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。划其他区:将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。 (3)恒温培养:将划线平板倒置，于37?(或28?)培养，24h后观察 三、染色分离法 基本原理:革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这 是染色反应的主要依据。 操作步骤: 在此操作中只进行初染进行观察——草酸铵结晶紫(1—2min)后镜检 观察结果时，请师兄和师姐帮忙验证。