【doc】RNA干扰技术在对虾抗病毒感染中的应用研究进展

【doc】RNA干扰技术在对虾抗病毒感染中的应用研究进展 RNA干扰技术在对虾抗病毒感染中的应用 研究进展 第29卷增刊1 2011年11月 海洋科学进展 ADVANCESINMARINESCIENCE Vo1.29Supp1.1 November.2O11 RNA干扰技术在对虾抗病毒感染中 的应用研究进展 朱斐 (浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江杭州311300) 摘要:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象,作为 近年兴起的一项新兴技术,被认为有抑制病毒复制的功能.目前运用RNA干扰技术在对虾抗病毒感染的研 究进展,发现序列特异性的dsRNA在对虾体内能诱导产生强烈的抗病毒反应,表明与RNAi相似的机制存在于对 虾的抗病毒反应中.这为免疫进化和控制对虾病毒病提供了科学依据. 关键词:RNA干扰;双链RNA;小干扰RNA;对虾;抗病毒 中图分类号:894文献标识码:A文章编号:1671-6647(2011)s1—0156-04 RNA干扰(RNAi)是指特异性双链RNA(dsRNA)介导的,特异性降解内源性或外源性mRNA,导致靶 基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象,被《Science}和《Nature}评为2002年度最重要的科技成 果之一_1.].RNA干扰属于转录后的基因沉默机制PTGS(post—transcriptionalgenesilencing).1998年 Fire等在线虫中首次发现RNA干扰现象,其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解,产生干扰siRNA (smallinterferingRNA),这些siRNA与同源的靶RNA互补结合,特异性酶降解靶RNA,从而抑制,下调 基因表达,导致基因沉默j. 1RNA干扰的机理 RNA干扰是从植物到人类的真核细胞进化过程中被保存下来的使基因表达沉默的一个机制[3].整个 过程包括3个阶段:起始阶段,效应阶段和循环放大阶段.起始阶段是由外源导入或病毒感染等各种方式进 入机体的dsRNA,在细胞内Argonaute蛋白的协助下与核酸内切酶RNaseIII家族的Dicer结合,逐步将外 源dsRNA切割成长度为2l,23bp的小片段,即siRNAl2].RNAi的效应阶段是在siRNA引导下由 RNA诱导的沉默复合体RISC(RNA—inducedsilencingcomplex)将内源与siRNA序列相同的靶mRNA降 解成21,23bp的片段.siRNA与活性RISC结合而解旋成为单链的siRNA,单链siRNA以同源互补的方 式寻找到内源靶mRNA,RISC将mRNA切割.RNAi的循环放大机制是siRNA可以类似于PCR的机制 使mRNA转变成dsRNA,新的dsRNA被降解,在消除靶mRNA同时又产生更多的siRNA,如此构成一个 循环,所以RNA干扰的特点之一是高效性,极少量的dsRNA就足以引起整个机体的基因沉默. 2RNA干扰在对虾抗病毒感染中的研究现状 RNA干扰(RNAi)迅速地发展为防治疾病提供了有效的方法,尤其适用于治疗病毒感染,很多研究表明 收稿日期:2011-1108 资助项目:国家自然科学基金青年基金项目——小G蛋白(Rab,Ran)在对虾抗病毒 细胞吞噬中的作用(C190601) 作者简介:朱斐(1979一),男,江苏南通人,助理研究员,博士,主要从事水产动物病害方面研究.Email:zhufei@zju.edu.cn (陈靖编辑) 增刊1朱斐:RNA干扰技术在对虾抗病毒感染中的应用研究进展 RNAi在活体内或活体外都能阻止多种类型的病毒复制.由dsRNA引起先天性(非特异)抗病毒免疫反 应长期被认为只有脊椎动物才拥有,但近年来研究发现由特异性的dsRNA引起的RNA干扰为无脊椎动物 尤其是对虾提供了抗病毒的功能,同时非特异性的长链dsRNA也被证明能在对虾体内诱导强烈的抗病毒 反应.这些研究发现为防治对虾病毒病和研究甲壳动物免疫提供了新的思路. 2.1RNA干扰抗对虾病毒感染机理的研究 Robalino等证实通过注射非特异性dsRNA(与已知的对虾基因,wSSV和TSV的基因均无相似性) 可以在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中诱导抗病毒保护.当用dsRNA治疗凡纳滨对虾时,可诱导产 生对白斑综合症病毒wssV(whitespotsyndromevirus)和桃拉综合症病毒TSV(Taurasyndromevirus) 这2种不相关病毒的抗病毒免疫反应,死亡率分别比对照组降低50和75,但是如果攻毒剂量上升死亡 率也会相应上升.这种抗病毒反应与使用的dsRNA的序列无关,可以是脊椎动物免疫球蛋白基因,鱼类非 编码基因或细菌载体基因,因此与由特异性dsRNA介导的基因干扰现象截然不同.这是第一次证实无脊 椎动物的免疫系统和脊椎动物一样,能识别dsRNA作为病毒相关的分子特征,造成先天性抗病毒反应的激 活.在凡纳滨对虾中先天性抗病毒反应也可由非特异性序列的dsRNA(RR2)诱导产生,而病毒序列特异性 的dsRNA(VP19和VP28)在体内试验中能诱导对虾产生强烈的抗病毒反应,暗示与RNAi相似的机制存 在于对虾的抗病毒反应中].在对虾的抗病毒免疫中,病毒的dsRNA不仅诱导先天性免疫途径而且以类 似RNA干扰的机制在体内诱导强烈的抗病毒反应,由于dsRNA是病毒感染的一个标志,因此免疫系统已 经进化出识别dsRNA并对其做出抗病毒反应的能力. Su等口o]发现肌肉注射与斑节对虾(Penaeusmonodon)的Dicer(PmDcr1)基因序列一致的dsRNA可以 在未感染和感染鳃病毒(GAV)的对虾体内抑制PmDcrlmRNA的表达,而抑制PmDcrl的表达造成了对 虾更迅速死亡以及更高的病毒负荷量.斑节对虾Dicer(PmDcr1)cDNA的全长为7629bp,编码RNAase IIDicer,是RNA干扰途径的一个重要组成部分.定量RT—PCR的分析指出PmDcrlmRNA在血淋巴和 淋巴器官组织中得以大量表达,而这些器官正是被广泛认为是虾的主要免疫器官.因此,对虾体内可能存在 类似RNAi的先天性抗病毒免疫系统. 2.2RNA干扰抗白斑综合症病毒感染的研究 WSSV为双链环状DNA杆状病毒,由其引发的白斑综合症是在对虾养殖中危害最大的一种病毒性疾 病,具有发病快,病程短,死亡率高,宿主范围广等特点.由于生产中养殖密度大和水环境恶化,导致该病毒 病频发且难以有效防治.中国对虾(Penaeuschinensis)被肌肉注射特异性长链dsRNA(VP28,VP281和 WSSV蛋白激酶基因)和非特异性长链dsRNA(含GFP),结果表明所有注射长链dsRNA的对虾均比注射 的对虾拥有更高的存活率,而注射VP28和蛋白激酶dsRNA的对虾相PBS缓冲液 比注射VP281和GFP dsRNAs的对虾有更高的存活率,序列特异性dsRNA对对虾的保护程度与所用病毒基因的作用 有关"]. Westenberg等n分别给斑节对虾注射长度同样是21bp的VP15,VP28和GFPsiRNA,24h后 WSSV攻毒,VP15和VP28组的相对存活率分别为42和50%,而GFPsiRNA的相对存活率也达到了 33.Xu等口胡将21bp的特异性VP28一siRNA注射日本对虾也取得了显着的抑 . 制WSSV复制的效果 wu等口用序列特异性的siRNA在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)体内特异性地使5个WSSV的基 因(DNA聚合酶,核糖核苷酸还原酶亚单位,胸苷激酶和胸苷酸激酶,VP24和VP28)沉默,在攻毒后第6天 5组对虾的相对存活率分别达到了5O,50,66,33和33.这5个WSSV基因的特异性siRNA(2O bp)可以抑制目的基因表达并减少病毒的增殖.作为阴性对照,非序列特异性的siRNA(突变siRNA,20 bp)却无法抑制这5个基因的表达和病毒的增值.结果表明,注射序列特异性的siRNA可以有效地在对虾 中诱导抗WSSV感染的活性. 158海洋科学进展 细胞凋亡通常被认为是WSSV感染并导致对虾死亡的一个重要因素.如果将诱导细胞凋亡的主要蛋 白质Caspase一3沉默掉,可能会提高wSSV攻毒时对虾的存活率.如果将来自凡纳滨对虾的Caspase一3同 系物(cap一3)在wssV攻毒之前利用RNA干扰使cap一3的表达沉默口,在高剂量的wssV攻毒压力下,沉 ,在低剂量的默cap一3对由WSSV引起的对虾死亡没有显着的保护效果.然而WSSV攻毒压力下,沉默 cap一3使对虾死亡率低于对照组,结果表明细胞凋亡更可能在对虾被WSSV攻毒时使病毒感染恶化而不是 减少死亡率. 注射与WSSV感染关键基因序列相关的长链dsRNA或siRNA,对阻止WSSV在对虾体内感染增殖均 十分有效,说明特异性dsRNA引起的RNA干扰为对虾提供了抗病毒的功能,同时dsRNA诱导的抗病毒保 护作用是跨对虾品种的一个共同特征口].这为对虾白斑综合征的防治提供了科学依据. 2.3RNA干扰抗黄头病毒感染的研究 黄头病毒YHV(Yellowheadvirus)是单链RNA弹状病毒,由其引发的黄头病发病快,病程短(3,5 d),死亡率高.YHV主要感染斑节对虾和白对虾的幼虾,对对虾养殖业造成巨大的经济损失口.Tiraso— phonI1将在体外转录的YHV解旋酶,聚合酶,蛋白酶,gpl16和gp64的dsRNA转染对虾原代培养淋巴细 胞能阻止YHV在虾细胞中复制,抑制水平与dsRNA的靶向和长度有关.另外,靶向为非结构基因(蛋白 酶,聚合酶和解旋酶)的dsRNA可以有效阻止YHV的复制,而那些靶向为结构基因(gpl16和gp64)的 dsRNA效果最差.相比结构蛋白,非结构蛋白基因的mRNA在受感染的细胞中存在的量相对较少,病毒复 制的过程又需要少量包括这些酶在内的复制酶,因此抑制效果较好. Yodmuang等_1.向斑节对虾体内注射与YHV蛋白酶序列相关的全长400bp的dsRNA(pro)可以完 全抑制YHV的复制,dsRNA的抑制效果可以持续至少5d口.注射相似大小不相关序列的dsRNA(GFP) 或dsRNA(TsV—pod也在一定程度上抑制了YHV的复制.未注射dsRNA的对虾的死亡率在YHV攻毒 后第8天达到90,而那些注射了dsRNA(pro)的对虾却没有死亡,注射dsRNA(GFP)或dsRNA(TSV— po1)的对虾部分死亡. 3RNA干扰抗病毒作用的问题与展望 RNA干扰技术作为一种全新的抑制靶基因表达的技术,在对虾抗病毒感染方面显示出广阔的应用前 景,因为它与其他抗病毒手段相比有高效性和特异性等优点.但是RNA干扰技术在对虾抗病毒中的应用 也存在问题,最重要的是在实际生产中采用肌肉注射显然是不可行的,因为养殖对虾数量大,个体小,捕捉和 注射还会引起应激反应,降低成活率.其次是dsRNA的稳定性问题,体外合成的dsRNA导入细胞后易被 RNase降解,效率不高.随着RNA干扰抗病毒机制研究的深入和导入RNA技术的进步,RNA干扰有望 成为对虾抗病毒感染的一种新方法. 参考文献(References): [1]FIREA,XUS,MOBPGOMERYMK,eta1.Potebpandspecificgeneticinterferencebydo uble—strandedRNAinCaenorhabditiselegans [J].Nature,1998,391:806811. E2]CULLENBR.RNAinterference:antiviraldefenseandgenetictool[J].NatureImmuno1. ,2002,(3):597—599. E3]HANNONGJ.RNAinterference[J].Nature,2002,418:244251. [4]MARTINEZJ,PATKANIOWASKAA,URLAUHH,eta1.SinglestrandedantisensesiR NAguidetargetRNAcleavageinRNAiEJ]. Cell,2002,110:5631. I-s]SHARPPA.RNAinterference--2001[J].GeneDev.,2001,15:485—490. r6]ELBASHIRSM,HARBORTHJ,LENDECKEIW,eta1.Duplexesof21一nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmam— 增刊1朱斐:RNA干扰技术在对虾抗病毒感染中的应用研究进展159 maliancells_J].Nature,2001,411:494—498. [7]LENARDJN,SCHAFFERDV.AntiiviralRNAitherapy:emergingapproachesforhittingamovingtarget[J].GeneTher.,2006 13:532—540. [8]ROBAIINOJ,BROWDYCL,PRIORS,eta1.InductionofAntiviralImmunitybyDouble—StrandedRNAinaMarineInvertebrate[J] J.Viro1.,2004,78:1044210448. [9] [1O] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [172 [182 ROBALINOJ,BARTIETTT,SHEPARDE,eta1.Double— StrandedRNAInducesSequence-SpecificAntivira1SilencinginAdditi.nto NonspecificImmunityinaMarineShrimp:ConvergenceofRNAInterferenceandInnateImmunityintheInvertebrateAntivira1ResD0nse [J].J.Viro1.,2005,79:I356113571. SUJG,OANHDTH,LYONSRE,eta1.AkeygeneoftheRNAinterferencepathwayintheblacktigershrimp,Penaeusmonod0n: IdentificationandfunctionalcharacterisationofDicer一 1[J].FishShellfishImmuno1.,2008,24:223—233. KIMCS,KOSUKEZ,NamYK,eta1.Protectionofshrimp(Penaeuschinensis)againstwhitespotsyndromevirus(WSSV)challenge bydouble—strandedRNA[J].FishShellfishImmuno1.,2007,23:242—246. WESTENBERGM,HEINHUISB,ZUIDEMAD,eta1.siRNAinjectioninducessequence —independentDrotectioninPenaeusmon.don againstwhitespotsyndromevirus[J].Virus.Res.,2005,114:133—139. XUJY,HANF,ZHANGXB.Silencingshrimpwhitespotsyndromevirus(WSSV)genesbysi RNA[J].AntiviralRes.,2007,73: 246-131. WUY,LUL,YANGLS,eta1.InhibitionofwhitespotsyndromevirusinLitopenaeusvannam eishrimpbysequence—specificsiRNA [J].Aquaculture2007;271:21—30. RIJIRAVANICHA,BROWDYCL,WITHYACHUMNARNKULB.Knockingdowncasp ase一3byRNAireducesm0rtalityinPacific whiteshrimpPenaeus(Litopenaeus)vannameichallengedwithalowdoseofwhite— spotsyndromevirus[J]. FishShellfishImmuno1., 2008,24:308—313. NADALAJrECB,TAPAYLM,LOHPC.Yellow—headvirus:arhabdovirus— likepathogenofpenaeidshrimp[J].Dis.Aquat. Org.,1997,31:141-146. TIRASOPHONW,ROSHORMY,PANYIMS. SilencingofyellowheadvirusreplicationinpenaeidshrimpcellsbydsRNA_J].Bio— chem.Bioph.Res.Co.,2005,334:102—107. YODMUANGS,TIRASOPHONW,ROSHORMY,eta1.YHV— proteasedsRNAinhibitsYHVreplicationinPP"nP"o.."and preventsmortality[J].Biochem.Bioph.Res.C0.,2006,341.351—356 ProgressofRNAInterferenceinApplication ofAntiviralInfectioninShrimp ZHUFei (CollegeofForestryandBiotechnologySciences,ZhejiangAgricultureandForestryUniver sity Hangzhou311300,China) Abstract:RNAinterference(RNAi)isakindofpost— transcriptionalgenesilencingphenomen.nofthespe— clhcnucleotidesequenceineukaryoticorganisms,andisconsideredtohavetheinhibitioncapacitvofvirus replication?Recentstudiesshowedthatsequence—specificdouble— strandedRNAmayinducestrongantivira1 responseinshrimp,whichindicateakindofmechanismlikeRNAimayexistinshrimp.Theapplication developmentofRNAitechniquetoinhibitshrimpvirusreplicationissummarized ,theDossibilitvofantivi raltherapybasedontheRNAiisprospected. Keywords:RNAinterference;double— strandedRNA;smallinterferingRNA;shrimp;antivira1 Received:November8,20l1