孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒B3活性

孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒B3活性 孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯 萨奇病毒B3活性 时珍国医国药2010年第21卷第5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5 量,精密称定,按"2.2.1"项下制备供试液,照分光光度法在250 nm处测定紫外吸光度,测定结果按外标法计算.结果见表4. 表3加样回收率试验结果 3讨论 前期实验中发现,不同厂家的葛根样品,葛根素含量相差较 大,2005年版《中国药典》规定葛根应为野葛的干燥根,粉葛另为 甘葛藤的干燥根,两者的葛根素含量差别较大,为了保证本品临 床疗效,故选择野葛投料. 取对照品溶液1.0ml置25ml的量瓶中,加30%乙醇至刻 度,摇匀,在200—400nm波长范围内测定葛根素的紫外吸收光 谱,结果显示在250nm处有最大吸收.另取供试品溶液在200 , 400nm波长范围内测定紫外吸收光谱,结果也显示250am处 有最大吸收.同时空白溶剂在此处几乎无吸收,说明溶剂对测定 无干扰.因此,选择250nm作为检测波长. 采用高效液相色谱法和紫外分光光度法测定葛根提取物中 葛根素和总黄酮的含量,方法简便,准确,可靠,重复性良好,可为 葛根提取物的质量提供检测. 参考文献: [1]国家药典委员会.中国药典,I部[S].北京:化学工业出版社, 2005:233. [2]李海丽葛根的现代研究[J].世界今日医学杂志,2007,8(1): 57. [3]张彤,郑彩美,陶建生,等.水提一壳聚糖澄清一大孔树脂纯化法 制备葛根总黄酮工艺研究[J].时珍国医国药,2008,19(6):1324. 孔石莼抗病毒蛋白多糖的 提取分离及抗柯萨奇病毒B3活性 罗振宇,陈薪研,王小燕,瞿畅,张美英,安卫征,熊盛h (1.广州暨南大学生物医药研究开发基地,广东广州510632;2.广东药学院,广东广州510006) 摘要:目的从绿藻孔石莼中分离具有抗病毒活性蛋白多糖提取物.方法新鲜孔石莼经pH7.0的磷酸盐缓冲液提取和 硫酸铵沉淀得到粗提取物,大孔树脂层析分离得到蛋白多糖.经紫外扫描,高温高压处理(121?,15rain)和糖苷酶水解 测定提取物的性质.Mrr法检测蛋白多糖对Hela细胞的毒性,细胞病变法(CPE)检测蛋白对柯萨奇病毒B3(CVB3)引 起的细胞病变抑制作用.通过样品对细胞的保护作用,对CVB3增殖的影响,对CVB3感染细胞的综合作用,初步研究了 样品抗病毒作用的机理.结果从孔石莼中提取了蛋白多糖,得率为0.5%.毒性试验结果表明,孔石莼蛋白多糖对He- 工Ja细胞的半数中毒浓度1,C50大于8mg?ml,.孔石莼蛋白多糖具有显着的抗CVB3活性,通过试验测得孔石莼蛋白多糖 对CVB3主要是预防作用和直接杀灭作用,其Ic.为3.71xg?ml,.结论从孔石莼中分离到具有抗病毒活性的蛋白多 糖,具有很好的抗CVB3活性. 关键词:孔石莼;提取;纯化;孔石莼蛋白多糖;抗病毒活性;CVB3 中图分类号:R284文献标识码:A文章编号:1008—0805(2010)05.1090-04 ExtractionandPurificationofAnti——viralProteoglycanfromUlvaPertusaanditsActivity aganinstCoxsackieVirusB3 ZHENYu—luo,XINYan—chen,XIAOYan—wang,CHANGQu,MEIYing—zhang,WEIzhen—an.,SHENG Xiong (1.BiomedicalResearch&DevelopmentCenter,.nUniversity,Guangzhou,Guangdon gChina510632:2. GuangdongPharmeceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong,China) Abstract:ObjectiveToisolateantivirusproteoglycanfromthegreenalgae,Ulvapertusa.MethodsFreshUlvapertusawasex. tractedbyphosphatebuffer,andthetotalproteinwasprecipitatedwithammoniumsulfateandthenpurifiedbymacroporousresin. Thetoxicityandantiviralbioactivitywereevaluatedbycytopathiceffect(CPE)andMTYeolorimetrieassay.ResultsTheTC50 收稿日期:2009—10.13;修订日期:2010-01-28 基金项目:广东省自然科学基金团队项目(No.2004E039213);教育部新世纪优秀人 才支持(No.NCET一07—0376) 作者简介:罗振宇(1984一),男(汉族),湖南娄底人,现任广州暨南大学生物医药研究 开发基地在读硕士研究生,学士学位,主要从事新药研发工作. 通讯作者简介:熊盛(1972-),男(汉族),湖北黄冈人,现任广州暨南大学生物医药研 究开发基地副研究员,博士学位,主要从事生物技术药物研发 工作. ? 1090? L1SHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.2lNO.5时 珍国医国药2010年第21卷第5期 (50%toxicityconcentration)ofproteoglycanpurifiedfromUlvalactucaL.ismorethan8000~g?mlandtheIC50((50%in— hibitoryconcentration)inhibitoryconcentration)was3.7g?ml,TI(therapeuticindex)was2162.2.ConclusionIsolated antiviralproteinsfromtheUlvalactucaL.exhibitspotentanti—CVB3activityinvitro. Keywords:UlvalactucaL.;Extract;Purify;Antiviraleffect;ProteoglycanfromUlvalactueaL;CoxsackievirusB3 (CVB3) 柯萨奇病毒B(coxsackievirusB,CVB)属小核糖核酸科肠道 病毒属,是引起病毒性心肌炎最主要的病原体,其中以CVB3对 心肌的亲和力最强,可导致心律失常,急,慢性心功能不全,扩张 性心肌病甚至猝死,严重威胁人类健康….柯萨奇B3病毒是典 型的溶细胞病毒,目前尚无理想有效的药物.临床常用病毒唑作 为治疗药物,但存在毒性较大,常出现白细胞减少,头痛,不可逆 贫血,血清胆红素升高,致畸等副作用.因此筛选,研制新的抗 CVB3药物就显得尤为重要. 近年来,病毒感染性疾病呈现快速上升的趋势,而且新病毒 种类不断出现,但长期以来抗病毒的药物发展缓慢.陆地生物药 源越来越少,海洋生物为抗病毒新药的发现提供了广阔资源.第 一 个抗病毒海洋药物为阿糖胞苷(Ara—C,Cyt~a—bine),在 1955年被美国FDA批准用于治疗人眼单纯疱疹病毒.海洋 药物学的迅速发展.为药学研究开辟了广阔的前景,目前了解到 红藻和褐藻具有很多抗病毒,抗菌,增强抵抗力和提高.免疫力等 的生物活性作用.,但绿藻研究方面比较少;孔石莼是海藻中蛋 白质含量最高的一种藻体,本文初步研究了从孔石莼中提取蛋白 多糖的方法,并研究了孑L石莼蛋白多糖抗病毒活性及其初步作用 机制.目前海藻多糖抗病毒报道较多,但少见关于海藻糖蛋白或 者蛋白多糖抗病毒的报道,本文从含蛋白质丰富的绿藻孔石莼中 提取到具有抗病毒活性的蛋白多糖. 1材料与仪器 1.1材料新鲜孔石莼(UlvaLactucaL.):广东湛江南海海域, 一 70~C保存.自来水反复冲洗,以除去泥沙和盐分等杂质,蒸馏 水洗3次,阴干表面的水分. 1.2试剂与仪器浓硫酸,浓盐酸,氯化钡,硫酸铵,氯化钠,氯 化钾,磷酸二氢钾,磷酸氢二钠,硫酸钾等,以上试剂均为广州化 学试剂厂分析纯.DMEM培养基(Hyelone公司);CO:培养箱 (日本Sanyo公司);超净工作台(苏州净化设备公司);相差显微 镜(德国Laiea公司);酶标仪(美国BIO—RAD公司);MTY(四甲 基偶氮唑蓝)Sigma公司产品. 1.3细胞株和病毒Hela细胞株引自美国ATCC公司,由本室 保存.细胞生长液为含10%新生小牛血清的DMEM,细胞维持 液为含2%新生小牛血清的DMEM,常规加入青霉素100U? ml,,链霉素100U?ml.柯萨奇B3病毒(CVB3)武汉大学医 学院病毒研究所引进. 2方法 2.1孔石莼蛋白的提取与纯化取新鲜海藻孔石莼100g剪碎, 用预冷磷酸盐缓冲液(pH=7.0)匀浆,超声破碎.4?提取过 夜.高速冷冻离心(10000r?min,,30min),取上清.用DEAE — Sepharose填料装柱,去离子水洗至柱子流出液无乙醇;用0.01 mol/LpH7.0PBS平衡层析柱,流速1ml/min,打开紫外检测仪 和仪,至基线平直,稳定,上样.用0.01mol/LpH7.0PBS 缓冲液洗回至基线.按顺序用以0.01mol/LpH7.0PBS为母液 配制成的0.05,0.1,0.15,0.2,0.3,0.5,1mol/L氯化钠溶液洗 脱,收集各峰,SDS—PAGE电泳分析结果,冻干样品测活性. 取新鲜海藻孔石莼100g剪碎,用预冷的磷酸盐缓冲液(pH = 7.0)匀浆,超声破碎.4?提取过夜.高速冷冻离心 (10000r?rain,30min),取上清,加硫酸铵盐至溶液浓度 60%,4?沉淀过夜,高速冷冻离心(12000r?rain,,30min),沉 淀溶于0.01mol?L的磷酸盐缓冲液中.在上清中加硫酸铵盐 至溶液浓度为80%,4?沉淀过夜,高速冷冻离心(15000r? min,,30min),离心沉淀溶于0.0lmo!?L的磷酸盐缓冲液中. 两次离心的沉淀用0.0lmol?L的磷酸盐缓冲液透析,至溶液 中无硫酸根离子存在. 取大孔树脂101充分溶胀好,装柱,去离子水洗至柱子流出 液无乙醇,上样,同时连接蛋白检测仪和记录仪,分别用体积分数 为20%,40%,60%的甲醇洗脱3个柱体积,再用95%乙醇洗脱3 个柱体积,收集各个蛋白峰,冻干,测活.收集活性峰. 2.2孔石莼蛋白的稳定性研究 孔石莼蛋白多糖常温下放置24h,进行冻干,测定样品抗病 毒活性. 孔石莼蛋白多糖121?高压高温灭菌15rain,进行抗病毒活 性测定. 孔石莼蛋白多糖用特异性N一糖苷酶酶解,超滤除去酶解缓 冲液,进行活性测定. 孔石莼蛋白多糖与体积分数为95%乙醇室温下共作用24h 透析除去乙醇,测抗病毒活性. 2.3样品的毒性和抗病毒活性测定 2.3.1细胞毒性测定JHela细胞经消化后,加入96孑L培养 板中,每孔100Ixl,细胞密度达到2X10个?ml'..待细胞长满 单层后,分别加入60%硫酸铵沉淀的样品,80%硫酸铵沉淀的样 品,经过大孔树脂纯化后的两个样品(上样峰和2号洗脱峰),检 测其细胞毒性.参考Mosmannl9建立的M1Tr法,样品采用维持 液培养基(含1%小牛血清)稀释,加入样品48h后每孔加人5 mg?ml,MIT10l,继续培养4—6h,黄色的MrI1被活细胞的 线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶.小心吸出MTT,每孔加 入DMSO(二甲基亚砜)100~1,振荡混匀,15rain后甲簪结晶被 溶解,在波长570nm下测定吸光度OD值.计算细胞存活率,药 物对细胞的半数毒性浓度(50%cytotoxicconcentration,TC50). 细胞存活率(%)=实验组A570/对照组A570×100%. 2.3.2样品抗病毒活性测定Hela细胞经消化后,加入96孔培 养板中,每孔100l,细胞密度达到2×10个?ml,.待其生长 为单层细胞,弃去培养液,将不同稀释度的药物和100TCID病 毒各5Ol混合后直接加到单层Hela细胞上,每个浓度设4个复 孔,继续培养24,36h,待病毒对照组细胞病变达到75%以上 时,每孑L加人5mg?ml的MTT10l,继续培养4—6h,黄色 的MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶.小心 吸出MTT,每孔加入DMSO(二甲基亚砜)100~1,振荡混匀,15 min后甲簪结晶被溶解,在波长570nm下测定吸光度OD值. OD值与活细胞的数量呈正相关. 2.4孔石莼蛋白多糖抗病毒机理的初步研究 长成单层的Hela细胞,用100TCID100的C\q33感染,在感 染前后不同时间加入经过大孔树脂纯化得到的孔石莼蛋白多糖. 2.4.1孔石莼蛋白多糖对C~B3病毒的直接杀灭作用将 100TCID50bd的CVB3与不同浓度的药品等量混合,药物的终 浓度分别为24,12,6,3,1.5txg?ml,,37?培养2h后将各浓度 药物与病毒的混合液加入到单层Hela细胞中,同时设病毒对照 ? 】091? 时珍国医国药2010年第2l卷第5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATER1AMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5 组和正常细胞对照组.逐日观察细胞病变情况,待病毒对照组病 变达到75%以上时,记录CPE.MTI"法测吸光值: 2.4.2孔石莼蛋白多糖对CVB3病毒引起细胞凋亡的阻止作用 将100TCID100p~l的CVB3病毒加入到长成单层的Hela细胞 中,2h以后,弃其上清,再加入样品至其终浓度.逐日观察CPE, 待病毒对照组病变达到75%以上时,记录各组CPE,并用MTT法 测其吸光值. 2.4.3孔石莼蛋白多糖对CVB3病毒引起细胞凋亡的保护作用 Hela细胞经胰酶(V+E)消化后,加入96孑L培养板中,每孑L100 l,细胞密度达到2X10个?ml.待细胞长满单层后,先加入 孔石莼蛋白多糖至终浓度于37?的细胞培养箱中孵育2h后,弃 上清,再加入将100TCID./100~1的CVB3病毒,逐日观察CPE, 待病毒对照组病变达到75%以上时,记录各组CPE,并用MrI'法 测其吸光值. 3结果 3.1孔石莼蛋白的分离提取通过前期预试验,我们发现孔石莼 中蛋白类物质兼具蛋白质和多糖特性,通过对孔石莼c:N比分 析所得产物是蛋白多糖,因此我们采用了两种技术路线,一是粗 提物直接上样阴离子交换树脂DEAE—Sepharose,进行分离纯 化;二是粗提物先进行硫酸胺分级分离,然后用大孔树脂对活性 组份进一步纯化.以活性为导向,评价纯化方法的可行性.由图 I和表1可以看出DEAE—Sepharose无法将粗提物很好的分离, 抗病毒活性主要集中在上样峰和1.0mol/LNaC1溶液洗脱峰中, 其Ic.相对较高,而60%,80%硫酸铵沉淀的样品活性比60% 硫酸铵沉淀的样品要好3O倍,所以进一步纯化60%,80%硫酸 铵沉淀的蛋白.把硫酸铵质量浓度60%,80%沉淀的孔石莼蛋 白粗提物经大孑L树脂101层析,用体积分数20%,40%,60%的甲 醇和95%的乙醇洗脱,出现如图2所示的2号峰: SDS—PAGE电泳分析DEAE—Sepharose各峰的结果如下. 1,2,3,4,5,6,7,8分别代表Marke*', 穿透峰,0.2,0.3,0.5,1.0,0.1,0.05mol/L 氯化钠溶液洗脱组分的条带 图1孔石莼蛋白粗提物经分离纯化后电泳结果 表1盐沉淀样品的抗病毒活性比较 分离方法活性结果(1C.) 60%硫酸铵沉淀样品 60%一0%硫酸铵沉淀样品 DEAE—Se?曲arose(fastflow)上样峰 0.05mol/LNaC1溶液洗脱组分 0.1mol/LNaCI溶液洗脱组分 0.15mol/LNaCI溶液洗脱组分 0.2mol/LNaCI溶液洗脱组分 0.3mol/LNaC1溶液洗脱组分 0.5mol/LNaC1溶液洗脱组分 1.0mol/LNaC1溶液洗脱组分 200p,g/m1 6p.g/ml 88.36txg/ml 无活性 无活性 无活性 无活性 无活性 无活性 227.27g/ml 取100ml蛋白质浓度为80~g/ml的60%,80%硫酸铵沉淀 组份,进行蛋白质纯化后得到各组分的干重和活性,见表2: ? 1092? 图2大孔树脂101洗脱曲线图 表2大孔树脂纯化前后各样品物质得率和抗病毒活性 3.2孔石莼蛋白提取物的稳定性研究蛋白质因受物理因素或 化学因素的影响,改变了分子内部的特有结构,导致理化性质改 变,生理活性丧失,如果是蛋白多糖或者糖蛋白,因为糖基的保护 作用而使得蛋白质的性质更加稳定.蛋白多糖的生物活性多数 会因为糖苷键的水解而失活,因此本实验采用不同条件处理孔石 莼蛋白提取物,发现孔石莼蛋白提取物在常温下放置24h,其抗 病毒活性不改变.孔石莼蛋白提取物经过高压高温处理后,抗病 毒活性的有效浓度将由原来的ng数量级上升到mg数量级,抗病 毒活性损失严重. 60%,80%硫酸铵沉淀样品和95%乙醇共作用24h,抗病毒 活性基本没有影响,故用大孔树脂纯化蛋白时95%乙醇的洗脱 峰没有活性,并非说明是因95%乙醇作用使样品抗病毒活性,而 说明样品中抗病毒活性的成分保留在上样峰中. 孔石莼蛋白经过特异性的N一糖苷酶酶解后,抗病毒活性消 失,说明孔石莼蛋白中具有抗病毒活性的物质不是单纯的多糖或 者蛋白质,有可能是蛋白多糖或者糖蛋白. 表3样品稳定性研究 处理方式处理前IC50/p.g-ml一处理后IC50 3.3各提取物的细胞毒性及抗病毒活性结果孔石莼分离提取过 程中的各样品的Hela细胞毒陛和抗病毒'衙陛结果见表4.结果表明, 孔石莼几种提取成分都有一定的抗病毒活性,尤其是粗提物经过大 孑L树脂分离纯化后,所得上样峰中孑L石莼蛋白多糖抗病毒活性得到 显着提高(IC50=3.7g/m1),同时其治疗指数(TI=TCS0/IC60)也得 到了提高.陔样品抗病毒活性的具体结果见表4. 表4不同样品的Tc5o,Ic50和治疗指数(TI) 蛋白样品TC50/mg?ml,IC5o/p,g?ml一rrI 3.4孔石莼蛋白提取物抗病毒机理研究的结果孔石莼蛋白多 糖(大孔树脂分离所得的上样峰样品)的抗病毒活性机理初步研 究发现,样品的预防效果比较明显,其IC.=400ng/ml,同时样品 c乜具有直接灭活病毒的作用,其IC.:19~g/ml,其CPE观察结 果见图3 LISH1ZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5 时珍国医国药2010年第21卷第5期 l20 l00 一 一 80 = 三 一 一 0 20 0 l0e5dI{l 样胜,ugml' 图3大子L树脂上样峰对病毒的抑制作用 4讨论 大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体,加入乙烯苯为交 联剂,甲苯,二甲苯为致孔剂,它们相互交联聚合形成了多孔骨架 结构.树脂是一类含离子交换集团的交联聚合物,它的理化性质 稳定,不溶于酸,碱及有机溶剂,不受无机盐类及强离子低分子化 合物的影响.树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质) 之间的范德华引力,通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作, 使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗 脱分开而达到分离,纯化,除杂,浓缩等不同目的.本试验采用大 孑L树脂进行生物大分子活性物质的分离纯化少有报道,试验过程 中曾尝试用离子交换的方法分离抗病毒活性成份但未成功失败, 用凝胶柱的方法也未能较好分离活性物质成分,因此,采用大孔 树脂进行分离,虽然大孔树脂分离粗提物也没有得到单一的物 质,但可得到活性更强的较纯提取物,为下一步的研究工作提供 了方便. 本试验以抗病毒活性为导向,应用盐析沉淀,大孔树脂层析, 离子交换层析等多种方法,从孔石莼中分离到了具有明显抗病毒 活性的蛋白多糖.目前抗病毒药物中大多是小分子化合物或者 是中药复方制剂,糖蛋白或者蛋白多糖具有抗病毒活性的报道并 不多,生物大分子抗病毒活性在将来的药物研发中应该更具有专 一 性.因为生物大分子对人体的副作用小,所以开发具有抗病毒 药物的生物活性大分子将是以后药物发展的重要方向.因此本 试验所研究的生物活性大分子对新药研究将提供一定的帮助. 近年来多糖,糖蛋白或者蛋白多糖抗病毒活性的研究开始增 多,其主要原因可能有多种.海藻多糖是重要的抗病毒活性物 质.也因为目前没有很好的方法来分离蛋白质和多糖或者糖蛋 白和蛋白多糖,所以很多研究是停留在多糖或者蛋白抗病毒活性 研究的层面上.AdhikariU,MandalPl0等研究了从褐藻中提 取的多糖抗疱疹病毒,且这些多糖对细胞没有毒性.Filho"等 人在从高粱属植物中分离纯化得到一种抗病毒的多肽.也有人 从多叶奇果菌子实体中分离得到一种分子量大约为29.5KD的 新型抗病毒蛋白.体外抗病毒活性的Ic.为4.1~g/ml.这些 多糖和蛋白或者是糖蛋白大多都是抗疱疹病毒的,抗CVB3的糖 蛋白或者蛋白多糖不多见,通过本实验室的前期工作发现,从孔 石莼中分离得到的这一抗CVB3活性的蛋白多糖,目前本实验室 正在进行进一步的分离纯化与鉴定,并将继续研究这物质抗病毒 活性的机理. 参考文献: [1]幸建华,杨占秋.柯萨奇病毒与病毒性心肌炎[J].数理医药学杂 志,2004,17(3):260. 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