植物叶绿素含量测定

植物叶绿素含量测定----无水乙醇提取法 摘要： 本文是主要是用无水乙醇提取法提取叶绿素以及用比色法测定叶绿素的含量实验的综述。 关键词：叶绿素的提取、含量测定、无水乙醇、比色法 前言：高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 正文： 一、原理     叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。     利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为：A=K*b*c（式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度）；叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g•L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g•L-1），的关系可分别用下列方程式表示： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 解方程（1）和（2）得： Ca=12.7 A663—2.59 A645 (3) Cb=22.9 A645—4.67 A663 (4) Ca十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) 二、实验的材料、仪器、药品 1．材料：植物绿色叶片。 2．仪器：分光光度计、比色皿、天平、研钵、滤纸、漏斗、滴管、剪刀、50ml容量瓶。 三、实验步骤 1．叶绿素的提取：用洗衣粉先将叶片表面的油迹和灰尘清洗干净，晾干后，用电子天平准确称取1.0g九里香叶子（0.5g紫背草叶子），剪碎后放入研钵中。向研钵中加入2~3ml 95%乙醇，再少许CaCO3和石英砂，研磨成匀浆，再加入10ml 无水乙醇，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min。取1张滤纸于漏斗中，用无水乙醇湿润，将研磨液沿玻璃板导入漏斗中过滤，用无水乙醇冲洗研钵、研棒以及滤渣数次，滤液移至50mL容量瓶，最后用无水乙醇定容至50mL，即为提取液。 2．吸光度的测定：取洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有无水乙醇的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645nm处，以无水乙醇做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用无水乙醇调透光率100%。 四、结果计算 1．结果计算：将663、645nm处测得的吸光度代入上述原理中的公式（3）、（4）、（5）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。并将实验结果如下： A645吸光值 A663吸光值 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总含量 九里香 稀释前 0.837 1.731 19.719 11.066 30.785 稀释5倍后 0.168 0.377 4.335 2.082 6.417 紫背叶 0.313 0.688 7.896 3.948 11.884 五、结果分析与实验总结 1.叶绿素提取液所使用的样品总质量不同，所称取的九里香的样品质量为1g导致测得其吸光度大于1，用该组数据计算会导致实验最终结果误差较大，故现将该种（九里香）的叶绿素提取液先稀释五倍，再测定，得到了正常的吸光度数值。 2.叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂如乙醇、丙酮或二甲基亚砜等研磨提取或者浸泡提群法提取叶绿素。本实验使用的分析纯是乙醇，相对于丙酮乙醇混合液来说，其效果相对较低。 3.对叶绿素含量测定的影响因素可能有：取样的时间地点、选取的材料、选取的部位、研磨时是否有放入石英砂防止叶绿素被破坏、研磨是否充分、制取提取液期间是否有避光处理等等。 参考文献：上网查阅资料