【doc】IL-1β对体外培养不同时期的小鼠早期胚胎发育的影响

【doc】IL-1β对体外培养不同时期的小鼠早期胚胎发育的影响 IL-1β对体外培养不同时期的小鼠早期胚 胎发育的影响 中国煤炭工业医学杂志2006年2月第9卷第2期?187? ? 基础论着? 文章编号1007—9564(2006)020187—03 IL一1I3对体外培养不同时期的小鼠早期胚胎发育的影H向 467000河南省平顶山市第一人民医院妇产科丁月红 华北煤炭医学院袁丽杰 昆明医学院第二附属医院妇产科马兰苏莹杜玲周红林 关键词IL1口;胚胎;体外培养;囊胚率;孵化率;小鼠 摘要目的研究白细胞介素I~(IL—ip对体外培养不同时期的小鼠早期胚胎发育的影响.方法收集ICR小鼠2细胞胚胎, 连续培养96h,观察IL—lB对不同发育时期的早期胚胎的影响结果在胚胎发育的4细胞期,8细胞期加入IL—l口可以提高囊胚发 育率(P<0.05).但不增加孵化率(P>0.05);在胚胎发育的8细胞期加入ILl口,囊胚发育率高于在胚胎发育的2细胞期,4细胞期 时加入ILl口的囊胚发育率(P<O.05),但孵化率也不增加(P>0.05).结论在着床前不同发育阶段的胚胎,对IL1日的需要是 不同的,并随着胚胎的逐渐发育对IL—l口的需要有增加的趋势. EFFECTOFINTERLEUKIN一1BONEARLYMOUSEEMBROINVARIoUSSTAGESINYITRoDingYuehong, YuanLijie,MaLan,eta1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,TheFirstPeopleHospit al0,Pingdingshan, Pingdingshan467000,China KeywordsIL18;embryo;invitro;blastocystrate;hatchedblastocystrate;mouse Abstract0bjectiveTostudytheeffectsof1L一113ontwo— cellmouseembryosculturedinvitroinvariousstages. MethodsTWO—eel1embryoscollectedfromICR—micewereculturedfor96hours,thentheeffectsof1L一1Gondevel— opmentofembryosinvariousstageswereobserved.ResultsAdministrationofIL—ll3in4一cel1and8一cellstagesof embryosincreasedblastocystrates(P<O.05),butdidnotenhancehatchedblastocystrates( P>0.05);blastocystrates of1L—l~?in8一cellstagesembryosweresignificantly(P<O.05)higherthanthatofIL一1Gin2一celland4一cellstages embryos,butdidnotalsoenhancehatchedblastocystrates(P>0.05).ConclusionDemand ofIL一1/~inpreimplanta— tionembryosinvariousstagesisdifferent,andthereisanincreasingtrendwiththedevelopme ntofembryos. 中图分类号I{一332文献标识码A 目前,由于各种各样的原因,不孕症有逐年增加的趋势. 辅助生育技术(俗称试管婴JL)是解决这一难题的重要手段之 一 但是目前试管婴儿技术成功率较低,在全世界范围仍仅 为25,34岁后成功率下降.如何提高成功率是各个辅助生 殖中心所要解决的问题.解决这一问题需涉及许多方面,如 超排技术,体外胚胎质量和胚胎移植技术的提高等等,其中提 高体外胚胎质量是提高辅助生育技术的关键之一目前在体 外培养大多数胚胎(约75)发育不能超越2,8个分裂球 期,因此大多数辅助生殖中心是将此阶段的胚胎移植至子 宫内.近年来研究表明在囊胚期胚胎移植可增加种植率], 尤其对以前反复种植失败的妇女?.对于在囊胚期移植胚 胎,有许多优点,如能保持子宫内膜与胚胎发育之间在时问上 的一致性,能在较K的培养期间选择更好的胚胎等].如何 使体外培养的胚胎更多的从2,8个分裂球期发育到囊胚期, 关键是如何改变体外胚胎培养体系使体外环境更接近体内的 内环境.在化学成分明确的培养基中增加或去除某些成分, 有利于探讨胚胎的体外发育机制,并有可能使胚胎体外发育 环境更接近体内情况.其中在培养基中加入细胞因子是目前 的研究方向之一.本项目拟研究白细胞介索一10对不同时 期小鼠早期胚胎体外发育的影响. 1材料和方法 1.1选取动物及饲养选取8,12周龄,体重为25,3Og的 雌性未交配的ICR小鼠(昆明医学院动物科提供).喂普通 小鼠饲料,自由饮水,摄食,自然光照. 1.2化学试剂和药品白细胞介索一IB(IL—ip购自美国 R&D公司;无菌磷酸盐缓冲液(PBS)由中科院医学生物所提 供;孕马血清促性腺激素(PMSG)购自天津华孚高新生物技 术公司;绒毛膜促性腺激素(HCG)购自丽珠集团;牛血清白 蛋白(BSA),矿物油,配M16液和BM—HEPES液的各试剂 均购自美国Sigma公司. 1.3实验所用液体的配制 1.3.1M16培养液及BM—HEPES液的配制在电子天平 秤上按M16培养液及BM—HEPES液中所含各组分称取各试 剂所需量,依次加入Mini—Q纯水中溶解,即得M16培养液及 BM—HEPES液.溶解后用0.22m孔径的微孔膜过滤. 1.3.2IL—ip培养液的配制将IL18加入M16培养液 中配成浓度为0.1ng/ml的含IL一18的培养液. 1.4各种皿的准备放入37C,5c()湿润培养箱平衡至 少2h待用. 1,5胚胎的收集和培养将每只雌鼠腹腔注射PMSG 10IU,造成超排卵刺激,48h后腹腔再注射hCGIOIU,促卵泡 成熟,注射hCG后,按雌:雄鼠比例1:1合笼交配,第二天 将雌雄鼠分笼,发现阴栓者认为妊娠第一天.在妊娠第二天 用颈椎脱臼法处死雌鼠.迅速将已处死的小鼠放在处理台 ? 188? 上,在无菌条件下剪开腹壁进人腹腔,取出双侧输卵管放人含 BMHepes的皿中,移人体视显微镜下,将受精后达2细胞期 的鼠胚冲人含M16液的皿中,用微量吸管收集发育正常的2 细胞期胚胎,放人含M16液的皿中漂洗二遍后,将每只小鼠 收集到的2细胞期胚胎按随机分组的原则分别放人4个培养 液滴中培养,每个培养液滴中胚胎数5,15个.实验共分四 组:对照组为不加IL一1B的M16培养液滴.三个实验组(即 实验组1,实验组2,实验组3)分别在胚胎发育到2细胞期,4 细胞期,8细胞期换成浓度为0.ing/ml的IL一1B培养液滴, 24h后换成不加IL一1B的M16培养液滴,更换培养液时小心 胚胎的遗失将培养皿放人37?5CO湿润培养箱中连续 培养共96h,观察胚胎生长情况.分别统计四组鼠胚囊胚数和 孵出数.本实验采用微滴法培养. 1.6统计学方法采用SPSSIO.0统计学软件包.对数据进 行检验. 2结果 实验共收集2细胞期鼠胚440个,胚胎发育情况见表1. 表1各组体内2细胞期胚胎体外发育情况 注:与对照组相比,**P<0.01,*P<O.05,?P>0.05;三个实验组间两 两相比,?P>0.05,??P<0.05 1)培养到72h,对照组囊胚率为36.7,而三个实验组囊 胚率分别为45.8%,5O.5%,64.6实验组3与对照组比 较差异有统计学意义(P<0.01);实验组2与对照组比较差 异有统计学意义(P<O.05);实验组1与对照组比较差异无 统计学意义(P>0.05).三个实验组间两两比较,实验组3 与实验组2,实验组1比较,差异有统计学意义(P<0.05);但 实验组2与实验组1比较差异无统计学意义(P>0O5). 2)培养到96h.对照组鼠胚孵出率为18.3,三个实验组 孵出率分别为17.8,21.6,19.5.各实验组与对照组比 较,差异均无统计学意义(P>0.05);各实验组间两两比较, 差异均无统计学意义(P>O.05). 3讨论 白细胞介索一1(Interleukin一1,IL一1)又称淋巴细胞激 活因子,是一种主要由血液中的单核细胞和巨噬细胞以及其 他多种类型细胞合成和分泌的重要细胞因子和多肽调节因 子,II一1系统由IL—la,IL一1B,IL一1受体拈抗剂(IL— Ira),IL一1I型受体(IL一1RtI),IL一1II型受体(1L1RflI) 五种成分组成.IL一1具有广泛的生物学活性,其功能已远 远超出了最初发现的免疫功能,它不仅对多种免疫活性细胞 具有重要的调节作用,而且参与造血,神经内分泌及炎症反应 等多种生理,病理过程.近几年的研究表明,IL一1在哺乳动 物的生殖过程中起着重要的作用,它们可能参与性腺生理功 能的调节,着床前胚胎的发育,着床,蜕膜化(胎盘形成),分娩 等多个生殖环节 ChineseJournalofCoalIndustryMedicineFebruary2006,Vo1.9,No.2 Takacs等用逆转录多聚酶链反应法(RT—PCR)测定 了鼠胚不同发育阶段IL一1系统的表达,2细胞中IL— II3mRNA不表达,而4细胞期,8细胞期,桑椹胚及囊胚中都 有IL—ll3mRNA表达.而Kruessel等[6也利用RT—PCR 法研究发现IL—II3mRNA在胚胎的所有发育阶段都有表达 这与前者的结果稍有不同.可能与所用的方法灵敏度不同有 关.DeLosSantosMJ等[]在蛋白水平上测定胚胎IL,1系 统表l达的研究发现,胚胎所有发育阶段均有IL一1B的免疫染 色,随着胚胎成熟IL一1系统的表达量有逐渐升高的趋势 从这些研究报道推测.既然IL—II3mRNA在胚胎的发育阶段 有表达,那么它对胚胎的发育可能起作用,并随着胚胎的成熟 该作用更明显.白细胞介索一1B(IL一1B)对体外早期胚胎发 育的影响,已有过一些报道,如向人工授精后培养8,10h牛 胚胎(1细胞期胚胎)中加人IL一1B能增加囊胚发育率,因 此,认为胚胎以外来源的1L一1B对胚胎发育起着调节作 用[5_;但也有学者研究1CR小鼠发现,IL一1B对体外鼠胚2 细胞至囊胚的发育无影响[6];还有研究表明[7],在体外培养昆 明小鼠桑葚胚胚胎时,当rhIL一1B的浓度为500IU/ml(约 lOOng/m1)以下时,对胚胎发育无明显影响,当rhIL一1B浓度 增大到1O001U/ml(约200ng/m1)时,胚胎发育率下降,证明 其对胚胎发育有毒性作用.我们已做的研究结果表明,在我 们研究的IL一1B浓度范围内0.1ng/mI,IOOn~?ml.对ICR 小鼠体外2细胞胚胎培养时,加人IL一18可增加囊胚发育 率,IL一1B浓度为0.1ng/ml~10ng/ml是2细胞鼠胚体外培 养的较适宜浓度(结果待发表).由此可见,白细胞介素一1G (IL一1B)对体外早期胚胎发育的影响,尚无一致结论,以上不 同结论是否因体外培养的胚胎在不同发育阶段对IL—lB的 需要不同所致,对此文献并无报道.基于以上观点,我们 了本实验,并结合我们已作过的研究,选择了浓度为0.1ng/ ml的IL一1B培养液.本实验结果表明:在胚胎发育的4细 胞期,8细胞期加人lL一1B可以提高囊胚发育率,但不增加 孵出牢;在胚胎发育的8细胞期加人IL一1B.囊胚率高于在 胚胎发育的2细胞期,4细胞期时加入IL一1B囊胚发育率, 但孵出率也不增加.因为胚胎的孵出有利于胚胎的体内着 床,但本研究各组的孵出率均未增加,所以未能间接说明IL 一 1B对鼠胚着床有利.因此本研究的结论是:在着床前不同 发育阶段的胚胎,对IL一1B的需要不同,并随着胚胎的逐渐 发育对IL一1口的需要有增加的趋势. 总之,本实验通过研究细胞因子IL一1B对小鼠着床前 胚胎体外发育的影响.以探讨小鼠早期胚胎发育机制和优化 鼠胚体外培养系统,并为进一步优化人类胚胎体外培养体系 提供理论和实验依据.但胚胎发育机制是复杂的,不能单纯 用一种因子来解释.它必然是许多相关因子协同作用的结果. 目前研究发现除了IL一10有可能促进胚胎生长外,还有白血 病抑制因子(LIF),表皮生长因子(EGF),胰岛索样生长因子 (IGF)等,但这些细胞因子之问相互调节的机制尚不清 楚.所以,如何把LIF和IL一1等细胞因子结合起来研究, 阐述它们的关系,尚需进一步探讨. 4参考文献 [13DokrasA,SargentIL,BarlowDH.Humanblastocystgrad— img:anindicatonofdevelopmentpotential?[J].HumRe 中国煤炭上业医学杂志2006年2月第9卷第2期 prod.1993.8:2127 E2]MenezoY,HazoutA,DumontM.eta1.Cocuhureofembryos onverocellsandtransferofblastocystsinhumansEJ].Hum Reprod,1992,7:101—106 r3]LivennesF.HazoutA,LelaidierC,eta1.Fm,rindicationsfor embryotransferattheblastoeyststage[J]HumReprod, 1995.9:2367—2373 r4]PlachotM.HeymannD,GodandA,eta1.Embroyaeoculture: theinteractionembryo,feeder[M]//AburumiehA,Bernat E,eta1.1xthworkIcongressoninvitrofertilisationandassis- tedreproduction.MonduzziEditoreBologna,1995:37"?44 and I51Takacal.Katlnl8S.Thcexpressionofinterleukin一1? interleukln一1Breceptortype1mRNAduringpreimplantation nlOUSCdevelopment[J].JReprod1nlllltlnol,1996,32:27—35 [63KrusselJS,HuangHY,SimonC.Singleblastomereswithin humanpreimplantationembryosexpressdifferentamountsof ~lessengerribonucleicacidforBaetlnandinterleukin一1re— eeptortype1[J].JClinEndocrinoMeta,1998,83:953 【7lDeLosSantosMJ,MercaderA,FrancesA.etal.Roleofen- dometria1factorinregulatingsecretionofcomponentsofthe immunoreaetlvehumanembryonicinterleukin一1systemdur- ingembryonicdevelopment[J].BiolReprod,1996,54(2): ? 189? 563—574 RobertsonSA,LavranosTC,SeamarkRF.Invitromodelsof themeterna]fetalinterface[M]//WegmannTG.Themolecu— larandcellularimmunologyofthematernal—fetaIinterface. NewYork:OxfordVnivPress.1990:l9l一206 张炜,周剑萍,张俊慧,等.LIF对体外培养小鼠孕早期胚胎发 育及1CAM一1表达的影响[J].上海医科大学,1999.26 (4):255—257 KurzawaR.GlabowskiW.WendaRL.EvaluatinofnlOUSe preimplantationembryosculturedinmediaenrichedwithin— sulin—likegrowthfactors1arid2.cpidermalgrowthfactor andtumornecrosisfactoralpha[J].FoliaHistoehemCytobi— ol,2001,39(3):245—251 KimCH.ChaeHD,CheonYP,cta1.Theeffectofepidermal growthfactoronthepreimplantationdevelopment,implanta— tionanditsreceptorexpressioninmouseembryos[J].JOb— stetOynaeco1Res.1999,25(2):87—93 KowalikA,LiuHC,HeZY,eta1.Expressionoftheinsulin一 1ikegrowthfactor一1geneanditsreceptorinpreimplatation nlouseembryoviability'.;[J].MolHuntReprod.1999,5(9): 861865 [2005—0908收稿20O51120修回] 文章编号10079564(2006)020189—01 大鼠自体血栓脑动脉栓塞模型的制作及灌注取材 063000河北省唐山市,华北煤炭医学院解剖教研室田清友卢鹤翔王海学 关键词自体血栓;灌注取材;大鼠 中图分类号R一332文献标识码A 制作模拟人类脑动脉栓塞动物模型,对于研究人类脑动 脉栓塞的发病机制,病理变化,以及早期溶栓治疗的有效性和 可行性.具有非常重要的作用.因此.稳定而近似人类脑动脉 栓塞的动物模型的建立,为这些研究提供了基础现将我们 采用大鼠制作自体血栓脑动脉栓塞模型以及灌注取材的情况 报告如下. 1资料与方法 1.1实验动物Wistar大鼠,雌雄不限,体重220~290g. 1.2栓子制作取大鼠尾静脉血,置人用凝血酶湿润的内径 为0.75mm塑料管内,37"C放置10rain,吹人2ml含3单位凝 血酶(25万单位/L)中_1].37C放置20mln,小心吸取栓子放 入10ml生理盐水中洗涤5min,然后用lml注射器套上塑料 管,吸人5ram的栓予,将塑料管头剪成楔形备用 1.3模型制作将大鼠用10%水合氯醛麻醉,常规分离一 侧颈总动脉(CCA),颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA).ECA 远端二处结扎.从其问剪断,动脉夹暂时夹住CCA,提起ECA 使其与ICA成一直线.在ECA结扎近端剪开小口,插入约 4cm含栓子的细管.缓慢推人栓子,在退出细管的同时,结扎 ECA.松开动脉夹. 1.4取材手术24h后麻醉大鼠,打开腹腔剪开膈肌.暴露心 脏,于左心室处插入用lOOm]注射器连接的输液管,在右fi,室 *华北煤炭医学院基础部形态中心 * 唐山IJ』眼科医院 处剪开一切口,迅速推人5Oral生理盐水,冲出血液,然后推人 4多聚甲醛PBS缓冲液50ml.如果大鼠四肢抽搐痉挛,则证 明灌注成功,继续滴注缓冲液20min.剪掉鼠头,f:t1止血钳沿 额中线左右分离颅骨,于颅底剪掉视交义,取出大脑固定. 2结果 2.1形体观察大鼠清醒后,栓塞对侧肢体无力,行走时向 对侧旋转,前肢下垂,眼睛缩小. 2.2TTC染色取未固定脑组织,一2O?放置5min,以 2ram为单位,切成7片,进行染色.正常脑组织染成红色,梗 死区呈白色,表现出明显的缺血性梗死区. 3讨论 实验过程中的栓子的吸人比较困难,需要进行反复的练 习.但自体栓子的制备,由于用生理盐水进行了洗涤.从而避 免了由于凝血酶的作用,而造成的散在性栓塞的形成,较之线 栓法更接近于人类脑动脉栓塞.为溶栓药物的选择和早期溶 栓效果的观察.提供了良好的实验基础.灌注固定使大脑组 织形态结构完整,有利于进行形态学研究.水合氯醛具有抗 惊厥和高热的作用,用其来进行麻醉,可以避免大鼠术后不良 体征的出现 4参考文献 ,常丽英,张苏明,等.大鼠自体血栓大脑中动脉闭塞模 [1]张新江 型的改良[J].卒中与神经疾病,2003,10(1)i13 [2oo5一n一3O收稿2【)(】5,12—07修] 胡 n口口