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【doc】 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型谷氨酰胺转移酶的关系

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【doc】 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型谷氨酰胺转移酶的关系【doc】 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型谷氨酰胺转移酶的关系 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型谷 氨酰胺转移酶的关系 中华内科杂志2005年9月第44卷第9期ChinJInternMed,September2005,V0l44,No.9 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型 谷氨酰胺转移酶的关系 曾非余绍祖曾庆杏 【摘要】目的探讨凝血酶增高大鼠的小脑颗粒细胞N一甲基一D一天冬氨酸受体(NMDA)敏感性 是否与细胞内组织型谷氨酰胺转移酶(tTG)变化有关.方法以0.01U/ml浓度凝血酶单独或与 tT...
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【doc】 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型谷氨酰胺转移酶的关系 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型谷 氨酰胺转移酶的关系 中华内科杂志2005年9月第44卷第9期ChinJInternMed,September2005,V0l44,No.9 凝血酶增高NMDA受体敏感性与组织型 谷氨酰胺转移酶的关系 曾非余绍祖曾庆杏 【摘要】目的探讨凝血酶增高大鼠的小脑颗粒细胞N一甲基一D一天冬氨酸受体(NMDA)敏感性 是否与细胞内组织型谷氨酰胺转移酶(tTG)变化有关.方法以0.01U/ml浓度凝血酶单独或与 tTG抑制剂单丹磺酰尸胺(MDC)0.5×10mol/L处理原代培养的Wistar大鼠小脑颗粒细胞30min 后,以0.1×10一mol/L,0.25×10mol/L和0.5×10mol/L3种浓度NMDA作用3h诱导上述处 理的细胞凋亡,比较流式细胞仪检测到的细胞凋亡率差异以判断NMDA受体敏感性的变化;RT.PCR 和Gelpro图像分析软件检测各NMDA浓度有/无凝血酶预处理的细胞内tTGmRNA变化差异.结果 凝血酶预处理细胞后上述3种浓度NMDA诱导的细胞凋亡率均升 高[(8.3.4-0.5—15.1?0.8)%, (14.1?1.1—23.8?0.7)%,(26.8?1.9—33.7?2.1)%].预处理细胞时加入 MDC可阻断凝血酶 对NMDA受体的这种影响,细胞凋亡率降至(5.8?1.2)%,(11.5?1.5)% 和(19.0?1.7)%;凝血酶 预处理后各浓度NMDA处理细胞内tTGmRNA量均同一浓度单独 NMDA处理的细胞高.结论凝 血酶通过增高细胞内tTG使小脑颗粒细胞NMDA受体敏感性增高. 【关键词】受体,N一甲基一D一天冬氨酸;凝血酶;脱噬作用 EnhancementofNMDAleeeptorsensitivitybythrombinanditsrelationshipwithtissue tramghtaminasezENGFeiYUShao—zu.zENGQing—xing.Departmentof Neurology.Renmin Hospitalof,lUniversity.nD0.ina CorrespondingauthorzENGFei.Emailfrederic2000@etang.corn 【Abstract】 0bjecfiveToexplorethepossiblerelationshipbetweenthethrombininduced potentiationofratcerebellumgranularcellN—methy1.D.aspartate(NMDA )receptorfunctionandtllechange ofintracellulartissuetransglutaminase(tTG).MethodsPrimarycultm’edratcerebellumgranularcells werepretreatedbyusingthrombin(0.01Um1)withorwithoutco.pretreateme ntof0.5×10-4mol/LMDC (monodansylcadaverine,atTGinhibitor)30minutes.Inducecellsmentionedabovetoundergoapoptosis withdifferentconcentrationofNMDA(0.1×10一 mol/L,0.25×10-4mol/Land0.5×10-4mo1/L). Flowcytometerwasapplied3hourslatertodetecttllechangedfunctionofNMDAreceptorbycounting percentageofapoptoticcells.RT—PCRwasusedtocomparetlletTGmRNAl evelintllecerebellumgranular cellstreatedwitllNMDAofsanledosagewith/witlloutthrombinpretreatment.ResultsThrombin pretreatmentincreasedthepercentageofapoptosiscellsinducedbyNMDA[(8.3?0.5)%to(15.14- 0.8)%at0.1×10一 mol/L,(14.1?1.1)%to(23.8?0.7)%at0.25×10-4mol/L,(26.8?1.9)% to(33.7?2.1)%at0.5×10mol/L)l;andthiseffectwasinhibitedbyco.pretreatmentMDCwitll tllrombin,cellapoptosisdecreasedto(5.8?1.2)%,(11.5?1.5)%and(19.0?1.7)%;Thrombin increasedintracellulartTGmRNAlevelscomparingwitlltllosewitlloutthrombinpretreatment.Conclusion ThrombinpotentiatesratcerebellumgranularceUNMDAreceptorfunction byincreasingintracellulartissue transglutaminase. 【Keywords】Receptor,N—Methyl—D-Aspartate;Thrombin;Apoptosis 脑出血是中老年人常见多发病,其发病率,病死 率和致残率高,此疾病引起神经损伤机制尚未完全 作者单位:430060武汉大学人民医院神经内科 通信作者:曾非,Email:frederic2000@etang.tom . 论着 明了.迄今研究多集中于凝血过程中产生的凝血酶 的神经毒性作用,认为凝血酶不仅可以引起脑水 肿,可以诱导神经细胞凋亡,还能通过激活蛋 白激酶激活受体(PAR).1改变神经细胞N.甲基.D. 天冬氨酸(NMDA)受体的敏感性.凝血酶激活 2005年9月第44卷第9期ChinJIntemMed PAR.1可以引起大鼠脑皮质细胞内组织型谷氨酰胺 转移酶(tTG)的蛋白达和酶活性增高.为了解 tTG这一多功能酶是否参与了凝血酶影响NMDA受 体敏感性的机制,我们利用凝血酶作用于原代培养 的大鼠小脑颗粒细胞,tTG抑制剂单丹磺酰尸胺 (MDC)干预,对这一问进行了研究. 材料和方法 1.材料与仪器:Wistar大鼠鼠婴购于武汉大学 医学院动物室;细胞培养板购于美国Falcon公司; DMEM培养基,胎牛血清和胰蛋白酶购于美国 Gibco公司;凝血酶,阿糖胞苷和NMDA购于美国 Sigma公司;M-MLV逆转录试剂盒购于美国Promega 公司;TaqDNA聚合酶购于中国华美生物工程公司; 其他试剂为国产分析纯.使用EPICSAI胍A?流 式细胞仪(BECKMANCOULTER公司,美国), CetlQuest软件获取数据,ModifitLT软件进行分析; BH-2显微镜(OLYMPUS公司Et本);二氧化碳培养 箱(SHEL-LAB公司,美国)PCR仪购于德国 Eppendorff公司;凝胶成像系统为美国GDs7600凝 胶扫描分析系统. 2.方法:大鼠小脑颗粒细胞原代培养及分组: 出生1d的Wistar大鼠鼠婴,断头处死,解剖显微镜 下取小脑,细胞培养至第20天J,以神经元特异性 烯醇化酶抗体做细胞鉴定,细胞纯度达到90%可进 行实验.培养细胞分为3组:(1)空白对照组: NMDA加入培养液配成3个工作浓度(0.1x10 mol/L,0.25x10I4mo]/L和0.5x10mo]/L)处理 小脑颗粒细胞3h;(2)实验组:0.O1U/ml浓度的凝 血酶(不引起细胞凋亡的低浓度)预处理小脑颗 粒细胞30rain后换液,用以上3个工作浓度的 NMDA处理3h;(3)实验对照组:以0.O1U/mlTm 加0.5x10mo]/L浓度tTG抑制剂MDC预处理小 脑颗粒细胞30min后换液,再用以上3个工作浓度 的NMDA共同处理细胞3h.流式细胞仪检测细胞 凋亡率.tTGmRNA半定量检测RT-PCR的方法 扩增tTGmRNA,以13一aetin为内参照,Gelpro图像分 析软件对检测结果进行半定量分析.用DEPC水配 制并预冷至4?的PBS清洗细胞3次;采用Trizol试 剂提取细胞总RNA.紫外分光光度计测样品RNA 总量.取RNA4I.J,g,逆转录试剂盒合成第一链 eDNA.取第一链eDNA2,同一反应体系内PCR 扩增tTG及13-aetin.引物序列:tTG(上游:5 GTT?C1AAGGACCGTlAGC3,]游:5GTTCCAAGlG ACCGTAGC3),13-aetin(5CCI’A,IBAGACA0:CAGAAT- C3,下游:5rI?,I’I?ACI’AGGAGCCrI3).反应条 件:95?变性1rain,57?退火1min,72?延伸 1rain,35次循环. 3.统计学方法:采用SPSSIO.0统计软件进行 统计学处理,计量资料结果(?s)表示,数据比较采 用方差分析和q检验. 结果 1.凝血酶和MDC对NMDA诱导细胞凋亡率的 影响:空白对照组NMDA3个浓度诱导的细胞凋亡 率分别为(8.3?0.5)%,(14.1?1.1)%和(26.8? 1.9)%;实验组细胞经0.O1U/ml浓度的凝血酶预 处理30rain再加人以上3个工作浓度NMDA,各浓 度NMDA诱导的细胞凋亡率均较空白对照组升高, 分另0为(15.1?0.8)%,(23.8?0.7)%,(33.7? 2.1)%(P<0.O1).提示经凝血酶预先处理后同样 浓度的NMDA引起的细胞凋亡率升高,说明NMDA 受体敏感性增高.实验对照组同时加入0.O1U/ml 浓度Tm和0.5X10mo]/LMDC处理细胞30rain 后,再加入以上3个浓度的NMDA,细胞凋亡下降至 (5.8?1.2)%,(11.5?1.5)%和(19?1.7)%,且 低于单纯NMDA处理的空白对照组(P<0.05);提 示MDC抑制了凝血酶引起的NMDA受体敏感性 增高. 2.不同处理细胞内tTGmRNA变化:以RT. PCR的方法检测空白对照组和实验组tTGmRNA, 产物大小为309bp;以13-aetin作为内参照,片断大 小为623bp;marker大小为100,1000bp.1,3和5 道为空白对照组,NMDA浓度分别为0.1X10 mo]/L,0.25X10mo]/L和0.5X10一mo]/L:2,4,6 道为实验组,NMDA浓度分别为0.1X10一mo]/L, 0.25X10I4mo]/L和0.5X10一mo]/L.空白对照 组和实验组细胞内均有tTGmRNA的逆转录扩增 产物. 3.RT-PCR产物灰度分析柱状图:以Gelpro图 像分析软件对RT-PCR产物(图1)进行灰度分析, 以tTG产物值与13-aetinA值的比值做Y轴,以 NMDA剂量作为x轴.比较同一NNDA浓度有无 凝血酶处理(实验组和空白对照组)细胞内tTG mRNA产物量的多少(图2).在各个NMDA浓度, 凝血酶预处理细胞均较无凝血酶预处理细胞内 2005年9月第44卷第9期ChinJInternMed Marker123456 bp 623 309 1,3,5:分别为NMDA0.1×10一mol/L,0.25×10一mol/L, 0.5×10-4mol/L3h;2,4,6:分别为凝血酶30rain+NMDA 0.1×10一mol/L,0.25×10一mol/L,0.5×10一mol/L3h 圈1空白对照组和实验组tTGmRNA的RT—PCR产物 O.1O.25O.5 NMDA剂量10-4mol/L 与相同浓度的N’MDA剂量比较,p<O.05,p<O.01 与相同浓度的NMDA剂量比较,P<0.05,P<0.01 圈2tTGmRNART—PCR产物灰度分析柱状图 tTG/~一actinA比值高,提示凝血酶处理后再加 NMDA的细胞内tTGmRNA量增加(P<0.05, <0.01). 讨论 凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶,其在出血 性脑血管病中对中枢神经系统的毒性越来越受到重 视.研究发现凝血酶可以通过细胞毒性和破坏血脑 屏障导致脑水肿,也可以引起大脑各个不同部位的 神经细胞凋亡.Mehssa等还发现凝血酶激活PAR一 1受体能使大鼠小脑颗粒细胞NMDA受体敏感性增 高两倍,人工合成PAR.1受体激活剂SFLLRN亦可 以产生相同作用;这种作用可以被凝血酶抑制剂 hirudin阻断,在缺乏PAR一1受体基因缺陷鼠则明显 减弱,但机制不清J.NMDA受体是中枢神经系统 内广泛存在的一种兴奋性受体,其过度激活会导致 Ca内流,造成神经细胞肿胀及异常电活动.有 回顾性研究发现脑出血后早期癫痫的发生率为 6.19%,且多与皮层的出血有关. 我们采用流式细胞仪检测同一浓度NMDA在 不同干预条件下引起不同细胞凋亡率的方法比较 NMDA受体敏感性的变化J.研究发现,空白对照 组细胞凋亡率随着NMDA剂量的升高而增高, NMDA诱导的细胞凋亡率有NMDA剂量依赖性;实 验组预先凝血酶处理30min后,再用NMDA诱导细 胞凋亡,检测到的细胞凋亡率仍有NMDA剂量依赖 性,而且预处理后各NMDA浓度细胞凋亡率均升高 (P<0.01),提示凝血酶预处理后大鼠小脑颗粒细 胞对NMDA的敏感性升高.实验对照组在Tm预处 理的同时加入了tTG抑制剂MDC后再加入NMDA, 3种浓度的NMDA诱导的细胞凋亡率均较实验组下 降(P<0.01),提示MDC抑制tTG酶降低了NMDA 受体敏感性.实验对照组MDC使细胞凋亡率降低, 甚至低于空白对照组(P<0.05),提示MDC不仅抑 制了凝血酶引起的NMDA受体敏感性升高,而且还 降低了NMDA受体激活本身引起的细胞凋亡,这提 示tTG也可能参与了NMDA受体激活引起的细胞 凋亡过程. 为了比较空白对照组和实验组细胞内tTG的 量,我们检测了细胞内tTGmRNA的变化.RT—PCR 检测发现在空白对照组和实验组细胞内均有tTG mRNA扩增产物,且组内和组间的产物量均有差异 (图1).通过Gelpro图像分析软件对RT—PCR产物 的分析发现,在各个NMDA浓度,凝血酶预处理后 再加入NMDA的小脑颗粒细胞内(实验对照组)的 tTGmRNA的量均较空白对照组(单独NMDA处 理)高,显示凝血酶预处理能增加细胞内tTGmRNA 的量.我们推测凝血酶影响NMDA受体敏感性的 机制可能是凝血酶激活PAR一1受体后使细胞内无 活性的tTG酶蛋白表达,而NMDA受体激活后进一 步增加细胞内tTG的量?...同时,NMDA受体激活 引起的Ca内流增加,使Ca依赖性的tTG均被 激活. 我们以往的研究发现凝血酶激活PAR一1受体 在诱导皮质神经元凋亡的同时细胞内tTG酶蛋白表 达增加和酶活性升高,tTG参与凝血酶通过PAR一1 受体诱导细胞凋亡的细胞内信号途径L4J,而本次研 究发现tTG在小脑颗粒细胞内也是凝血酶通过 PAR一1受体影响NMDA受体的中间物质联系.这 提示tTG不仅直接参与PAR一1细胞内信号途径,可 能有其他受体细胞内信号物质,在凝血酶对中枢神 经毒性机制中起着非常重要的作用.tTG具有两种 酶活性,除了肽链交联作用外还有GTP结合蛋白作 伽啪湖姗m O8642O 1OOOO 弩’r口_.n\0 20o5年9月第44卷第9期ChinJInternMed 用.tTG可能通过前者参与凋亡小体的形成和稳定 膜结构等一般凋亡过程,也可能通过后者干扰GTP 的转化和代谢过程从而干扰其他GTP相关的细胞 内信号途径.而后者可能是tTG产生多种生理及病 理作用并干扰其他受体信号途径的原因.凝血酶对 中枢神经的毒性作用需要RhoA的参与,有研究 证实tTG可通过激活RhoA引起其下游物质Rho相 关卷曲螺旋形成蛋白激酶移动至细胞膜导致胞膜构 相改变,这也可能是导致NMDA受体敏感性升高的 原因. 本研究的结果提示,凝血酶通过tTG使NMDA 受体敏感性增高;凝血酶通过激活PAR.1受体和影 响NMDA受体引起中枢神经损伤的两个途径均有 tTG参与;tTG可能是凝血酶引起的多种细胞凋亡细 胞内信号途径中的共同信号物质. 参考文献 1GongC,BoulisN.QianJ,eta1.Intracerebralhemorrhage?induced neuronaldeath.Neurosurgery,2001,48:875--882. 2DonovanFM,PikecJ,CotmanCW,eta1.Thrombininduces apoptesisinculturedneuronsandastrocytesviaapathwayrequiring tyrosinekinaseandRhoAactivities.JNeurosci,1997,17:5316? 5326. 3GingrichMB,JungeCE,LyuboslavskyP,eta1.Potentiationof NMDAreceptorfunctionbytheserineproteasethrombin.J Neurosci,2000,20:4582..4595. 4曾非,余绍祖,陈谦学.凝血酶诱导皮质神经元凋亡及其机制 的实验研究,中华实验外科杂志,2004,2:1508.1510. 5LaurieDJ,SeebulgPH.Regionalanddevelopmentalheterogeneity insplicingoftheratbrainNMDARImRNA.JNeurosci,1994,14(5 Pt2):3180-3194. 6StriggewF,RiekM,Bi~derJ,eta1.Theproteasethrombinisan endogenousmediatorofhippocampalneuroprotectionagainstischemia atlowconcentrationsbutcause8degenerationathighconcentrations. 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(收稿日期:2004.11-23) (本文编辑:丁云秋) 本期广告目次 贺普丁[葛兰素史克(中国)投资有限公 司]…………………………………………………………封面拉页 凯西莱(新谊制药股份公 司)………………………………………………………………………… ……封二 阿尔马尔(住友制药株式会 社)………………………………………………………………………… 对封二 诺和龙[诺和诺德(中国)制药有限公 司]…………………………………………………………对本期导读 三金片(桂林三金药业股份有限公 司)……………………………………………………………对中文目次1 阿斯美一呼吸畅通海阔天空(三共制药)………………………………………………………对中文目次2 拜唐苹(拜耳医药保健有限公 司)…………………………………………………………………对英文目次 万托林[葛兰素史克(中国)投资有限公司]……………………………………………………………前插页1 糖适平(北京万辉双鹤药业有限责任公 司)…………………………………………………………………658a 脉络宁(金陵药业股份有限公 司)…………………………………………………………………………658b 欢迎订阅英国医学杂志中文 版………………………………………………………………………………686a 欢迎订阅中华内科杂 志………………………………………………………………………………………686b 特苏尼(南京新港药业有限公 司)………………………………………………………………………… …720a 波依定(阿斯利康制药有限公 司)…………………………………………………………………………720b 倍他乐克注射液(阿斯利康制药有限公 司)………………………………………………………………封三 拜阿司匹灵(拜耳医药保健有限公 司)……………………………………………………………………封四
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