不同类型甲状旁腺肿瘤中HRPT2基因突变及其编码蛋白差异表达的研究.pdf.doc

不同类型甲状旁腺肿瘤中HRPT2基因突变及其编码蛋白差异表达的研究.pdf.doc 硕 士 学 位 论文 目 第一部分甲状 旁腺 良恶性肿瘤中删 基 因的 突变筛查? ? ? ? ? , 表 型 的 关 系 ? ? ? ? ? ( ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? , 谢 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? , , 鷄 , , , , 猠 , , , , , , , 玺 琣, , , , , 颉 , 总 钙 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 一 , , , , ，, , 刖 缲 盤 砣 基 对象 与 方法 收 集 原发 性 甲旁亢患 者标本 ，包括: , 例散发 , 患 者, 份 石 蜡 包 , , , , ，, , , 例甲状 旁腺 增生 , , , , , , 括无 义 突变 , , , 坡 胪 槐 , 例， 突变 与 , 复发 有 关 , , ( , , 。 散发 性 良性 甲状 旁腺 肿瘤 中 未 发 现 该 基 因突变 。 , , , , , , 免疫 组 化结果 : , , , , , , 的 表 达 在 , 组 与 其 在 , 和, 组 间具 , , , , , , , , , , , 脚刀;, 甌 , , , , 蛳 , , 鷄 , 『 , , , , , , , , , , , , , , 脚, 辌 , , , , , , 蠡 , 印 , , 聊 , , , , , 伽 , , , 俺 笽 , , 齞 , , , 篹, , , , 驴 , , 伍 , 猧 , , , , , , , 乔 鷜, , , , , , , , , , , , , 珊 , , , 莑 , , , , 酷 怠, , , 伍 , 猧 , , , , , , 縜 , 仃 , , , 癿 , , , , , 锄 , , , 甌 , , 齀 , , , , 撒 , , , , , , 鹋 餺, , , , , , , 秗, , , , , 琻 , , , , , 璼 , , , 豱 , , , , ( , , 鱨 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ( , , ( , 嘶丘, , , , 蕄 , , ?, , , , , , , , , 鴒, , , , , , , 锄 , , , 尸 刀, , , !, — ? 刖 『 导 致, , 的 病理 类 型 包括甲状 旁腺 腺 瘤 , , , , , , , , , , 琍, 。 据 统 计 ，在 美国和西 的 改变 , , ，, , , 。 由 于 , 的 发 病率比较低，各研 究 中 标本 数均 不 多 ，多 数为 个 例报 道， 突变 筛查及, , 丘 , , , 检 查有 可 能 对于 , 的 术 前及早 期 诊断 起到 十 分重要的 作 研 究 对象 和方法 将组 织 进行 编号 , , ( , ，, ( , ，, ( , ，将外 周 血标本 编号 。 本 研 究 均 有 患 者本 人 的 知 情 同 意 ，符合医学 伦理 学 。 组 织 标本 收 集 方法 为 肿瘤 切 除 后 , , 斜 瓯揪, , , 鹾蟛? 碇 な , ，, ,中 性 福 尔 马 林固 定，石 蜡 包埋 ，, 姹 , 妗, 庵 苎 1瓯臼 占, 螅 , 崛 ? 狣 , ，一, ? 保 存 。 北 京 益利精细 化学 品 有 限 公 司 北 京 益利精细 化学 品 有 限 公 司 北 京 贞玉民生 药业有 限 公 司 北 京 挚友酒精制品厂 北 京 中 杉金桥生 物 试 剂 有 限 公 司 北 京 中 杉金桥生 物 试 剂 有 限 公 司 国药集 团化学 试 剂 有 , , 北 京 中 杉金桥生 物 试 疞 限 公 司 剂 有 限 公 司 , , 疞 北 京 中 杉金桥生 物 试 剂 有 限 公 司 北 京 益利精细 化学 品有 限 公 司 北 京 益利精细 化学 品 有 限 公 司 江苏 世 泰实 验器 材 有 限 公 司 江苏 世 泰实 验器 材 有 , , , 提取试 限 公 司 剂 , , , 台 式 冷 冻 离心 机 : : : : 型， 上 海安亭 台 式 离心 科 学 仪 器厂 恒 温 磁 力搅 拌器 机 电 热 恒 温 水 浴 箱 手 提式 压 力蒸汽消 毒器 : : : : : : : : ， : : : : ， 日 本 微 波 炉 普通光 学 显 微 镜 照相机 采 图 成 像 系 统 紫 外 分 光 光 度计 : : : 型电 脑三恒 多 用 电 泳 仪 ， 中 国香 港 数字 凝 胶 图像系 统: : : : : : : : : : : 美 国 微 量 震荡 器 研 究 流 程 : 法 方 高 于 正常上 限 的 倍 数 表 示 : : 钚粤 姿 崦 : : : ， : 小 时 尿 钙 : : ， : 小 时 尿 磷 : : : : 橹 : 瓯 綝 : 的 提取 : : : 咴挡 灰U瓷 希 : 巧细 亲樱 : : : : : : 咴挡 灰U瓷 希 : 巧细 亲樱 : : : : : : : : : : : , : : 右 迫 胍 磺 褰 : : 收集 管 ， 弃去原收 集管 。 : 患 者 全 血立 即加入 : : 或 : : : : 离心 管 。 : : : 。 : : : : : : : : : 琔 : : : 耍 : ?鎏跫 : #: : 嬖 け湫 : : : : : : : : : : :: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 疉 : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 篢 : : : : : : : 结 果 : 甈 : 扩增检 测 图: : : 砸 : 锢 ?鲒: 眩 基因产物 ， 自 右 向左 分 别为: : : : : 拢篒胪力基因测 序 结 果 显 示 : : 患 者 中 ， : 例有 外 周血标 本 ， 其 中 : : 嬖 谂呦低 槐 洌 : : –: ， : : ， : : ， 明 确 存在胚 系 突 变 。 : : 颊 咧 挥 型庵苎 狣 : ， 未 检 出突 变 。 而 : : ， : : 由于 无 相应的 外 周血不 能 明 确 突 变 来 源 。 氨 基酸改 变 : : : : : : : 】 : 颊 逷 : 产物测 序 结 果 表明 ， 患者的组 织 : : 星 页 够: 虻: : 位密 码子 的 : 涑蒅 ， 造 成 : 位酪 氨 酸变 为终止密 码子 的 无 义 突 变 ， 提前 终止 外 显 子 : : 幻 苈 胱尤 笔Ъ罨 鵄 : : 斐 梢坡 胪槐 洌 : 崆 爸罩 : : : : : : : 挥 : : 个 氨 基酸组 成 的 截短 蛋 白 : : : (: 。 : : : 』 : , ,,,— , 个 氨 基 酸 组 成 的截 短 蛋 白 ,,,(,。 【 : ,,,,苏 ,虿庑 蚪峁鸇 (正 常 人 反向 测序 结 果 , ,, ,,,, , ,, , , ,,, , ,, , ,, ? 。 亡 。 ? , , , ,, ,, ,, , , , ,,, , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , ,,, , , , , , , , , , , , , , ,,瓵 , , , , , , , , ,, ,, , , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, , , ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, 骨 痛症 状 例数 ,,, ,,, ,,,縊 (, ,,,縊 (, , ,小 时尿 , ,,甇 ,,(, , 远处 转移例 数 尺 桡 骨 干 骺 端增 宽 ,渲 幸 幌 罨 蚨 嘞 , 患 者 中 ，肿瘤 复 发 率 明 显高 于 无 凡 ,口基 因 突 变 患 者 ,,(,,，校 正 了 病程 这 一 存 在基因 突变 ，相 关 性 结 果 显示 脚 刀 基因 突变 与 转移的相 关 性未达到显著 注 :阳 性似然比,嫜 粜裕 ,傺 粜裕 ,媒 峁 ,屑傺 粜晕 狾 诊断 危险 度 ,? 蹲榈 姆 ? ?剩,潜 ? 蹲榉 ? ?剩,媒 峁,蟹 潜 ? 蹲榉 ? ?饰 狾 研 究 流 程 : 上 上 一、 收 集甲 状 旁腺 肿瘤 患 者 的 临床 资料 甲 状 旁腺 肿瘤 患 者 的临床 资料包 括以 下 项 目: ,肿瘤 复 发 :两 次 或两 次 以 上手 术 ，手 术 间隔大 于 ,鲈拢 ,个 月 期 间血 钙 水平正 ,,,逅 ,逑 ,次 ，直 至 清 水无 色; ,(中 性树胶封片 ，镜 下 观 察 。 抗 ，作 为 空 白 对照 。 免 疫 组 织 化 学 染色 步 骤如 下 : ,(石蜡切片 于 ,? 烤片 , 冲 洗,危,? 糜 ,(, ,甇 ,校 ,? ǚ,,嬉 ,,? 抗 原 修 复 , 三、 免 疫 组 化 结 果 判 定 四 、 统 计学 处 理 进 行比较 分 析 。 敏 感 性、 特 异性、 预期 值 和,, 可 信 区间应 用二项 分 布 方 法 ， 果 结 一、 甲 状 旁腺 肿瘤 患 者 及正 常 甲 状 旁腺 患 者 的 临床 资料 血 ,灾,陀谡,, 哉兆,仪,,,,,见 表 , , , , , 组, , ( , , 琾, ( , , ， 高 钙危象 发 生率在 , 组 升 高 , , ( , , ; ? , 豳 , 五 毒; 。 ， , , 甈 , , , , , , 诓 煌 , ?砝 嘈 偷 淖 橹, 斜 泶锏 那 榭 , 见表 , , , 例 正 常甲 , , ( , 有统 计 学 差 异 病 理类 病 理类 , 型 型 四 、 , 中 , , , , , , 表 达 的 差 异与 临 床 表 型的关 系 , , , 骨 干 骺 端 增 宽, 渲 幸 幌 罨 蚨 嘞, , , 吒莆 , 螅 貉8啤 , ( , , , 疞 , , , , , , 与 ? , 相 关 性分 析 的结 果 提 示二 者 统 计 学 分 析 具 有相 关 性, ? , , , ， 、 芝 要 竺 瓦 寺 弓 弓 辛 毒文爝 潞辛荣越饕 聿餐 累 夏 ,畂 曩 器 重? 葛 焉 譬 昌 是 璺 趔 器 拳 夏 高 一 ? ? ? ‘一 莹 , 一 ,鳎 甤 ,(寸 囊善 捌重 (球萎 薯堪皋硼箕 腊皿,鲻淮佛,藐?,餕垂。琳秘,惧拳嚼懊罂山靧?,, 。,,甤桠一 否辎抵停肾,韫 窝镫桨講肾缌高 器 葛 荨 革，拦，差管，蹬,誹 ,, 一 , ，、掣銎榭哟罨箕。翱碟薯赛 表 , ( 联合 脚力基因检 测 与 , , , , , , 蛋白 检 测 诊断 甲状旁 腺恶 性肿 瘤 讨 论 织 标本 , , 其 中 包括 , , 捶 ? 呤质鹾蟮谋瓯 , ， , 例 , ， , 齈, 淖 橹 疍 , 显 统计 学 差 异 , , ( , , 。这 一结 果 与 瑞典, , , 腺肿 瘤 意义 不 大， 目 前 甲 状旁腺恶性 肿 瘤 的 发 病机 制不 清。其 中 值 得 提及 的 是 ? ( , ， 研 究 发 现其 高表达 对 于诊断 甲 状旁腺腺癌 有一定 意义 ， 并 且 与 , 的 复 发 、 转移 及 预 后 密 切 相 关 【 , ， , , , 嗍 , 芯 拷 峁 , 衅湔 锒 螾 , 奶 匾 煨 钥 纱 , , ヒ , , , ， 但 其 敏 感 性 低， 只有, , 一, , ， 因此 北 京 协和医院 对 于甲 状旁腺恶性 肿 瘤 及 增 生 活 跃 的 甲 状旁腺肿 瘤 均 进行了飚 , 的 免 疫 组织 化学 检查 。相 关 性 分析发 现， 硒 一, 高表达 , , , 甘 , , , , 幕颊 咂銹, , 絩 , , 均 有不 同 程 度 表达 缺失 。在 我 们 的 研 究 中 只有一例 , 患者为 表达 完 全 缺失 。该例 患者没有家族史 ， 目 前 没有临床 转 移 和复 发 的 证 据， 术 前 血 钙 , , , 觧 , , , , ?蹦 蚋 苐, , 删, , ， 手术 病理 提示未 见 血 管 侵 袭 、神经侵 袭 、周 围 组织 及 包膜侵 袭 等 为 最 早 发 现的 甲 状旁腺致瘤 基 因， 作用 在 细 胞周 期 循典型 腺癌 的 表现， 但 其 病理 切 片可 环 中 的 蛋白 ， 其 在 良恶性 甲 状 见 粗 大带 状纤 维 化， 而 且 硒 ( , 指数 大于, , ， 综 合考 虑 不 排 除 该患者为 一例 不 典 仍有约, , 患者该蛋白 完 全 缺失 表达 ， 但 原因不 明。影 响 蛋白 表达 的 异 常 原因很 多， 的 机 制中 研 究 最 多的 为 基 因突变研 究 。根据“二 次打击 学 说”， 一对 等 位基 因中 其 中 从 不 同 角 度 分析月 , , 刀基 因和, , 矗 , , , 与 , 的 关 系 ， 但 本 研 究 也 存在 很 多不 足 之处 。在 本 研 究 中 ， 基 因测 序 的 结果 不 完 整 ， 一方面由 于外周 血 收集 不 全 ， 只收 集 到, 例 , 的 外周 血 ， 另 一方面我 们 的 标本 年代比 较 久 远 ， 从 石蜡 组织 中 提取 , , , 眩珼 , 降解严 重 ， 导 致, , ?龉, 滩凰忱 , , 淙坏 髡, 丝赡 苡 跋霵, 扩增 的 条 件 ， 还 是存 在 部分患者的 某 些外显 子 未 能 扩增 出 来， 不 能 明确 组织 中 是否 存在 基 因突变。虽然 免 疫 组化的 研 究 结果 完 整 ， 但 考 虑 到免 疫 组化本 身具有一定 局 限 性 ， 可 因标本 处 理 不 当、抗 原丢 失 或减 弱 、抗 体 浓 度 或效 价 敏 感 度 降低及 操 作不 当等 出 现假 阴 性 情况， 也 可 能 由 于操 作不 当出 现假 阳 性 可 能 。本 研 究 进一步 需 要 进 行该蛋白 功 能 学 方面的 研 究 以 及 蛋白 致病机 制研 究 ， 从 而 证 明该蛋白 与 , 的 关 系 ， 探 讨 , 的 发 病机 制， 并 且 需 要 对 存在 胚系 突变的 患者直 系 亲 属进行筛查 以 探 讨 突 变的 来源 ， 并 进一步 分析突变与 临床 表型 的 关 系 。 论 , , ? ?訮, 薪 帕, , 蛲 槐 浔冉铣,, ,狙芯 恐校, ? ?訮, 蟹? , 例 脚力 基 因突变， 除 , 滞 槐 湟 延 邢 喙 乇 ǖ劳 猓 , 溆嗑, J状畏 ? 值 男峦 槐 洹 , , , 砣 的 直 接 测 序 对 于, 的 早 期 诊断 有重 要 意义 。 , , , , , , 可 能 在 , 的 发 病过 程 中 起作用 。 学 》 ， , , , , , 【 , 浚甃 , , , , , , , , , , , , , , ( , , 琫 , , , 蕉 实 叮 , 鷆 , , , , , 齝 既 , , , 琽 , 鶷 ， , , ( , , , , 鷇 , 珻 , , , , , 緁, , , , , , , , , , , , , , :, 鷓 , , , , , , 柚 , , , 蜘 ?, , , , , , 鵧 , , , , , :, , , ( , 畃 曲 , , , , 印啪 , , , , , , , , , 甁 , 篠 , , , ; , , 搠 鷌 ?, , , ( , , 鮯, , , , ? 【 , 】 ( , , , ? 订， , , 辴 , , , , , , , 腒 , , , , , , :, , , ( , , , , 【 , 】 , , , , 蝢 ( 乃 , , , , ， , , , , 锄 , , 鼹 , , , , , , , , , :, , , ( , ( , , , , , , :, , — , ( , , , ( , 粒 篿 , , ( , , , , , , :, , , ( , 銲, , ( , , , , , , , 郔 , , 謉 , ?锄 , 甁 , , , , , , , , , , 簆 , コ 鷗 , , 垫 説 , , , , , 鷌 , 蘳, ( , , , 鷏 , , , ?, , 鷇 , ( , , , , ( , , , , , ( , , , , , , , , , , , , 录, 纯 趃 , , , , , , , , , 琒 , , , , , 论 文 综 述 原发 性 甲 状旁腺功 能 亢 进症 及 其研 究 现状 明 。 随 着 分子 生物学 的 发 展 ，目 前 的 观 点认为 该 病与 某 些基因 改 变密切 相关 。 约 , , ，, , , , 琀, , , ，其 致 病基因为脚 砣;钙 , , , , ，, 印 删 , , , , , , 琋 , , ;此 外 还 有孤 立性 家族 性 甲 旁亢 , , ，其致 病基因 尚不明 确 ，部分存在 二 ( 甲 状旁 腺癌 袭 等 ，但 没 有明 确 的 周 围 及 远 处 转移 等 侵袭 生长征象的 肿瘤 【 , 】 。 , 中 核 分裂活 性 , 胐 , 常 见 于 , ，但 为 非特 征 性 形 态 ，良性 甲 , 娶 柰ü, 冉匣 , 蛟 咏 环 , 鄄 斓 焦鄄 斓 街辽, , サ腜 , 杉 鹟, , , 的 , 变异 ，基因 产 物增 多 或活 性 增 强时 ，使 细胞过 度 增 殖，从 而形 成 肿瘤 。 目 前 对 于 , 的 原癌 基因 研 究 主要 集中 于 以下基因 的 研 究 : , , 甲 状旁腺腺癌 有意 义，但 其敏感 性 低 , , ヒ , , , 【 , 】 。 , , 橹 , 樘 悄, , 性 可达, ,。 但 最近 我 们 对 , , , 也 做了 一些工作，发 现该 蛋 白对 于 鉴别甲 状旁腺良 , , , , , , , , ，, , ，甲 状旁腺肿瘤 的 等 位基因 型 分析 发 现存在 非 , , , 虰 , , 等 报 道, ,, , 缺失 , 康 任 换 , 颍, , ,, , 缺失 , 等 位基因 。 相关 的 免 疫 组化 研 究 证明 了 , 在 , 中 表达 是 完 全 或明 显 的 缺失 ，而在 , 中 没 有, 表达 的 异 常 。 目 前 , , , , 妊 芯糠 ? 衷 赑 , 蠷, 坏愕 脑雍 先 笔 , , , , 鳥, , 位点的 杂 合缺 失 , , ，而在 , 中 , 课 坏阍雍 腿笔 , , , , ,，, , , 坏愕 脑雍 先 笔 , , , , ,。 有些学 者 将, , , 游<鬃 磁 韵 僦 琢 銮 痹诘 囊 职 ?, 颍, , 牵 琁之, 虰 , , 对 于 泛 ，除结 缔 组织 、平滑 肌组织 、内皮 及 某 些上 皮 组织 如结 肠 、泌尿 系、子 宫、甲 状 , , 研 究 中 标 本数 均 不多 ，个例 报 道颇 多 ，所 谓 大 样 本最多 只 有, 个恶 性 肿瘤 , , , 直 系亲属均应 进行 筛 查 。 另 外 ，, 患者 应 行 外 周 血的脚 乃 基因突变筛 查 ，如果 变筛 查 不仅有利 于 遗 传性 疾 病的 检 测，对 于 , 的 术 前 诊断及 术 后随 访 也 可 能 起 到 十 分重要 的 作用 ，可 能 成 为 , 分子 诊断的 标 志物。 , , , , , 轕, 琣 ( , , ，, , , 饥, , , ( , , , , , , , 琍 , 篠 , , , , , , , , , , , , ( , , , , , , , 佟 辧 砌 , , , , , , , , :, , , , , , 膌 , , ( , , , , , , , , , , 捱 邓 , , 齭 , , , 【, 浚 瓹 , , , 轘，巧 蕴 , , , , ( , 唱 , 鞵 , , , , , , , , ( , , , , , , ( , , , , , , , ( , , 吐 , , , , 緊, , , 锄, , 猠 , , , , 【 , 】 ( , , , , , , , , , , , , , , , 鯽 ( , 【 , 】 ( , , 甁 , , , 印 锄, , , , , 篶 琓 , , , , 锄, 例 , , , , , , , 镊莱, , , , , 鷇 , , , , , , , 腸, , , , , ( , , , ，, 刑 , , , , 舻訮 , , , ( , , , , , 浚 瓵 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 柚 , , , , ;, , , , , , , , ( , , , , , ( , , , , , , , , , :, , , , , , , , , 鸽 , , 琁, , 獭 , 珹 疵 薿 , , , 呔 , , 珻 , 襛 , 珼 , , , , , 読 , , , , , , , , , , , , , 靉 , , , , , , , , ( 【, 】( , , , , , , , , , 螰, , , , , ，, , , ( , , 舫伽 , 锄, , 髂, , , , , 鲫 , , , , , 琈, , , ? 瓸 , 簄 , , , , , 琒 , , , , ( , , , 羞 蒲猧 蚴 蚰 , , , 习, , :, , 磂 勰强 , , , , 踮 , , 撕 , 謈 既, , , 眔 , ? ( , , , , , , , , 帕 , , , , , , ( , 浚 , 哦 实秏, 【 , 】 ( , , , 縑, 琀 , 舶 , , 箂 , ，, , , , 蔏 , , , , ( , , 北 京 协和医学 院 中 国医学 科 学 院 硕士研 究 生学 位论 文 ,,諴,,齞 ,琄 , ,，,鷊 聃 ,( , ,鳎 ,,,: ,,,( ,( ,,,, 【 ,】 ( ,,, , 【 ,,甋 ,,,,，,，,,,,緄 , , ,，? , ,，? ,,,鷆 【 ,】 ( , ,( ,唧,,,, , 膖 ,瑅 ,腣 ,锄 , 餠 ，, 致 谢 感谢血 管 外科 管 珩教 授、 李沛 大 夫 等在 实 验中 的 帮助和支持 。