低密度传代培养人脂肪基质细胞的体外增殖和表面抗原表达

低密度传代培养人脂肪基质细胞的体外增殖和表面抗原表达 低密度传代培养人脂肪基质细胞的体外增 殖和表面抗原表达 ISSN1671-5926CN21-1470/RI抛础圣卯z中国临床康复2006年9月10日第lO卷第33期 生长因子是c—Kit的配体.骨髓间充质干细胞通过干 细胞生长因子经多途径发挥抗细胞凋亡作用.首先, 干细胞生长因子可抑制磷酸肌醇激酶一3(PIK3)途径 抗凋亡l2;调控磷脂酶C及蛋白激酶C途径调节细胞 增殖与凋亡I31;其次,心肌梗死后局部区域炎症反应, 干扰素,肿瘤坏死因子,转化生长因子等通过诱导 Fas,肿瘤坏死因子受体家族和转化生长因子B受体 等凋亡受体,与各自的配体相互结合后激活下游的 信号转导,激活caspases家族诱发细胞凋亡.干细胞 生长因子则可抑制肿瘤坏死因子,转化生长因子诱 导细胞凋亡】.?干细胞移植后细胞分化及相关目的 基因受损促使分化细胞难以抵抗氧化还原反应,终至 细胞凋亡.研究发现,分化细胞能表达bcl一2抗凋亡基 因,另外,MEKKI基因通过抑制促凋亡因子产生而抑 制细胞凋亡l7,.?干纽胞移植后定向分化为心肌细 胞,能与宿主细胞形成缝隙连接.完成机械收缩,电耦 联功能,避免了单个细胞弥漫分布导致线粒体氧化磷 酸化诱发的细胞基质渗漏,细胞凋亡.?骨髓间充质 干细胞表达吲哚胺2,3双氧化酶可使色胺酸转化为 尿胺酸,诱导活化T细胞凋亡,而活化T细胞可产生 多种促心肌细胞凋亡的细胞因子”0】. 干细胞抑制细胞凋亡,利于心肌细胞再生,对心功 能改善,预防心室重塑有积极意义,其抗凋亡具体机制 尚有待进一步明确. (图1-2见插图33—3页) 4参考文献 lGengYJ.Molecularmechanismsforcardiovascularstemcellapoptosisand growthintheheartswithatherosclemticcoronarydiseaseandischemicheart failure.AnrtNYAcadSci2003:10:687—97 2SuiX,KrantzSB,ZhaoZJ,eto1.Stemcellfactoranderythropoietininhibit apoptosisofhumanerythmidprogenitorcellsthrot.ghdifferentsignalling pathways.BrJHnema~l2Ooo;l10(1):63—7O 3QuinlanLR,FahertyS.KaneMT,et.PhospholipaseCandpmteinkinaseC involvementinmouseembryonicstem.eellproliferationandapoptosis. Reproduction2003;126(1):l21—3l 4ChungU,DaiC.KrantzSB,et.Stemcellfactorincreasestheexpressioilof FLIPthatinhibitslFNgamma-inducedapoptosisinhumanerythreid progenitorcells.Blood20o3;10lf41:l324—8 50daA,NishioM,SawadaK,et.StemeellfaetorregulationofFas.mediated apoptosisofhumanerythroidprecursorcells.JHematotherStemCellRes 20O1:10(51:595—6o0 6DaiC.ChungU,KrantzSB.et.InhumanimmatureBFU.Etumornecrosis factor-alphanotonlydownregulatesCDK6butalsodirectlyproducesapoptosis whichispreventedbysterneellfactor.ExpHematol2004:32(10):91l一7 7YamaneDyllaSJ,MuijOensM.et.]EnforcedBcl-2expressionoverrides SerumandfeedercellrequirementsfornlouseembryonicstemeellseIf- renewa1.ProcNatlAcadSeiUSA2005:102(91:33l2—7 8MinaminoYujiriT,PapstPJ,et01.MEKKIsuppressesoxidativestress. inducedapoptosisofembryonicstemcel1.derivedcardiacmyoeytes.ProcNatl AcadSciUSA1999:96(26):l5l27—32 9Koyanagi-KR,AkimitsuN,ArimitsuN.Apoptosisofulouseembryonicstem cellsinducedbysingleeellsuspension.T/ssCell2000:32(11:66—7O lOPIumasJ.ChaperotL’RichardMJ.et01.Mesenchymalstemcellsinduee apoptosisofactivatedTcells.Leu.kem/a2005.19(91:1597—604 中国临床康复第『0卷舅33期2006—o9一lO出版 ChineseJolo’u~ofClinicalRehabilitation,September102006Vo1.10No.33 低密度传代培养人脂肪基质细胞的体外增殖和表面抗原表达 刘凯,周广东,吕晓杰,李纲,崔磊,刘伟,曹谊林 ? 基础研究? 术术术术? 上海交通大学附属第九人民医院整形外科,上海市2O00ll 刘凯?,男,1970年生,上海市人,汉族,1999年上海第二医科大学毕 业,硕士,i4主任医师,主要从事整形外科和组织工程研究. 通讯作者:曹谊林,博士,教授,主任医师,上海交通大学附属第九人民 医院整形外科,上海市2O00ll 国家”八六三”基金资助项目(2002AA205021);国家自然科学基金资 助项目(30300353);上海市青年科技”启明星”资助项目 (05QMX1427);上海高等学校青年科学基金(03BQ32) 中圈分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:167l一5926(2006)33—0038—o4 收稿日期:20o6-o3—23修回日期:2oo6—04一l7fo6—50—2—965/W?Y) Expressionsofsurfaceantigensandinvitroproliferationof humanadipose-derivedstromalcellsculturedinlowdensity LiuKai,ZhouGuang—dong,L0Xiaoqie,LiGang,CuiLei,LiuWei,CooYi— Iin DepartmentofP1asticSurgery.NinthPeople’sHospitalAmliatedto ShanghaiJiaotongUniversity.Shanghai2000l1.China LiuKai?.Master,Associatechiefphysician.DepartmentofPlastic Surgery,NinthPeopie’sHospital”AffiliatedtoShanghaiJiaotong University.Shanghai2O00l1.China Correspondenceto:CaoYi—lin,Doctor,Professor,Attendingphysician, DepartmentofP1asticSurgery.NinthPeople’sHospitalAmliatedto ShanghaiJiaotongUniversity.Shanghai2000l1.China Supportedby:theNational863ProgramofChina.No.2oo2AA2O5O2l: theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.30300353*; ShanghaiYouthScienceandTechnology”Phosphor”Plan,No. 05QMX1427;YouthScienceFoundationofShanshaiHighColleges,No. 03BQ32 Received:2006-03—23Accepted:2006-04-17 Abstract An厦:T0investigatethechangeofcellmorphology.proliferationabilityand expressionofcell—surfaceantigenwhenhumanadipose.derivedstromal cells(ADSCs)areseededatlowdensityinrepeatedpassages. M匣TH0DS:T}leexperimentwasconductedattheDepartmentof PlasticSurgeryandTissueEngineeringCenter,theNinthAffiliated HospitalofShanghaiJiaotongUniversitybetweenMay2004andJanuary 2006.?Fattytissueswereobtainedbyliposuction,thendigestedand isolatedbycollagenase.(ADSCswereseededatdifferentdensities(5000 andl000cells/cm1andculturedtopassage3afterprimarycells completed80%confluence.?M1Trmethodwasusedtocomparethe cellmorphologyandproliferationability,andtherange’ofcellsurface epitopeswasidentifiedbyflowcytometer. RBsl?rs:?Moresmallandroundcellswasfoundinlowdensity seedinggroup.?M1Trresultdemonstratedthatthecellswhichwere seededat1owdensityhadthe$allleproliferationabilityasthoseinhi出 densitygroup.Byflowcytometerassay,theproportionofcellswithstem cellrelatedsulfaceepitopes.suchasCDlO5.CDl66.Stro.1andFlk—lin lowdensitygroupwassignificantlyhigherthanthoseofhighdensity group. 1SSN1671—5926CN21—1470/R m.镏oomkf23385083@singcom刘凯,等低密度传代培养人脂肪基质细胞的体外增殖和表面 抗原表达 CoNCLUSIoN:Thelow—densitysubculturecanpromotetheproliferation 0fADSCs.andmarkedlyenhancetheproportionofstemcellsinADSCs. thusthismethodmaycometobeaconvenientwaytopurifytheADSCs. LiuKZhouGD,L0.LiG.CuiL,LiuW,CaoYLExpressionsofsufloceantigensandin vitroproIirerationofhumanadipose—derivedstromafcellsculturedinfowdensi~ ZhongguoLiwchuangK?2006;101331:38-41(China) 刘凯,周广东,吕晓杰,李纲,崔磊,刘伟,曹谊林低密度传代培养人脂肪基质细胞 的体外增殖和表面抗原表达Ul_中围临床康复,2o06,10~331:38-41 1wwwzglckf.com) 摘要 目的:观察低密度传代培养对人脂肪基质细胞的形态,增殖能力和表面 抗原表达的影响. :实验于2004一O5/2oo6—Ol在上海交通大学医学院附属第九人民 医院整形外科和组织工程研究中心完成.?吸脂术获得脂肪组织,经胶 原酶消化分离.?培养脂肪基质细胞,原代细胞80%融合后分别以 5O00/cm和lO00/em的接种密度传代至第3代.?四唑盐比色法和 流式细胞法检测比较不同密度传代培养对细胞形态,增殖能力及表面 抗原表达的影响. 结果:?低密度传代培养的细胞形态相对均一,体积较小.?四唑盐比 色法结果显示低密度传代细胞增殖活力与高密度传代培养组差异无显 着性.?流式细胞学检测结果表明,低密度培养组表达CD105,CDI66, Stro-1,Flk一1等干细胞相关表面抗原的细胞比例显着高于高密度培养 组. 结论:低密度传代培养有利于脂肪基质细胞的体外增殖,并能显着提高 细胞群体中干细胞的比例,有可能发展成为一种简便的脂肪干细胞纯 化方法. 主词:组织工程;间质干细胞;细胞培养技术 0引言 种子细胞是组织工程与修复重建外科领域发展 的关键问题之一,脂肪基质细胞来源于机体的脂肪组 织,目前认为其中含有的大量具有多向分化潜能的干 细胞,是继骨髓基质干细胞后在成体干细胞领域研究 较多的一类干细胞『l1.在整形外科广泛开展的脂肪抽 吸术中,吸出的脂肪组织常被废弃.因而,脂肪组织作 为种子细胞来源充足,对患者无额外创伤,患者易于接 受,具有良好的应用前景.但研究表明这群细胞成分相 当复杂,直接用这群脂肪基质细胞进行诱导目前还没 有形成真正意义上的终末分化组织,除成脂肪能力外 其诱导成其他组织的能力明显弱于骨髓基质干细胞[21, 因此纯化脂肪基质细胞是提高其作为种子细胞诱导 转化效率的重要一步.鉴于干细胞的体外增殖能力强 于大多数终末分化细胞,本实验试图通过降低脂肪基 质细胞传代密度的方法让其中的干细胞得到更多的 生长空间并形成优势群体,从而提高脂肪基质细胞中 干细胞的比例而达到初步纯化的目的. 1材料和方法 设计:单一样本观察. 单位:上海交通大学医学院附属第九人民医院整 形外科和组织工程研究中心. 材料:实验于2004—05/2006一O1在上海交通大学 医学院附属第九人民医院整形外科和组织工程研究 中心完成.实验试剂DMEM培养液:DMEM(Gibco, GlandIsland,NY,U.S.A),含有L一谷氨酰胺(上海思吉 39 生物制品有限公司)300mg/L,维生素C(上海伯奥生 物科技公司)50mg/L,青,链霉素各100U/mL;细胞 基础培养液:在DMEM培养液基础上再加入体积分数 为O.1的胎牛血清(HYCLONE,U.S.A);磷酸盐缓冲液: 每升液体含NaCI8g,KC10.2g,Na2HP04?12H203.44g, KH2PO40.2g,pH值约7.2;I型胶原酶(Worthington, U.S.A);胰蛋白酶(上海思吉生物制品有限公司);乙二 胺四乙酸(华美生物工程公司);NaHCO,(上海虹光化 工厂);40g/L乙酸溶液(上海试剂一厂);成软骨诱导 因子:转化生长因子B1(R&D),胰岛素样生长因子 (R&D),Dex(Sigma,2mg/mL);转化生长因子B1稀 释液:1g/L的牛血清白蛋白,4mmol/LHC1,以磷 酸盐缓冲液为溶剂;四唑盐比色法溶液(5g/L):称取 250mg四甲基偶氮唑盐粉剂加50mL磷酸盐缓冲液, 磁力搅拌30min,过滤除菌,冷藏保存,两周内使用. 实验设备恒温CO:培养箱(FormaScientific,U.S.A),普 通台式离心机(Heraeus,U.S.A),精密天平(Mettler Toledo,Switzerland),恒温摇床(太仓市华美生化仪器 厂),倒置相差显微镜(Nikon,U.S.A),超净工作台(苏 州安泰空气技术有限公司),流式细胞仪(Beckman Coulter,U.S.A),培养皿,96孔培养板(FALCON FranklinLakesNT,U.S.A). 设计,实施,评估者:实验由通讯作者设计,第一作 者实施,第二作者评估. 方法: 脂肪抽吸物来源:均来自上海交通大学附属第九 人民医院整形外科门诊行脂肪抽吸术的患者5例(患 者知情同意),男性1例,女性4例,年龄19,39岁,平 均年龄28.5岁.抽吸部位腹部1例,臀部和大腿部4 例,抽吸方式为电动负压吸引. 脂肪来源细胞分离:将脂肪抽吸物在无菌条件下 装入175cm培养瓶中.用无菌的磷酸盐缓冲液反复 冲洗至抽吸物溶液变清.加入等体积O.1%I型胶原 酶,在37?恒温摇床消化1h,1200r/min离心10min, 获得高密度的细胞沉淀物,倾去上清液和漂浮的黄色 组织,将细胞振荡混匀,加入DMEM+体积分数为O.1 的胎牛血清培养液使细胞重悬. 脂肪来源细胞原代接种和培养:吸取少量细胞悬 液用4Og/L乙酸等体积稀释破坏红细胞,血细胞计数 仪常规计数有核细胞数,按4xl0s有核细胞/cm细胞 密度接种于培养皿内,常用的100mm塑料培养皿接 种细胞30xlO左右,加入培养液8mL.将接种好细胞 的培养皿置于37?,体积分数为O.O5的CO:,100%饱 和湿度的条件下,培养24h后首次换液.倒置相差显 微镜下观察有大量细胞贴壁和漂浮的血细胞,用磷酸 盐缓冲液反复冲洗去除漂浮的细胞,加入DMEM+体 ISSNl671-5926CN2l一147Q41黜?础胛-p闭临壤苴:州m9Jj10H旃10卷第期 积分数为0.】的胎牛血清培养液..每周换液2次.细胞 融合至8O%传代一 传代培养:传代前用少量磷酸盐缓冲液洗涤1次, 加人2.5L胰蛋白酶和02L乙二胺四乙酸2mL见 大部分细胞胞质回缩,形态变圆,加入2mL含血清的 1)MEM培养敞中止消化.收集细胞悬液.计数,每个病例 的细胞分为两组:第l组正常密度传代以5000/cm 细胞密度接种于新的培养皿内,第2组低密度传代 1O00/cIrfl:细胞密度接种于新的培养皿内第】组一 般四五天达到融台状态,继续原密嚏传代培养,第2组 一 般八九天达到融合状态.继续原密度传代培养:涟续 传代至第3代,倒置相差显微镜下观察并拍照后 脂肪来源细胞表面标志的鉴定:用流式细胞仪对 原代,第3代细胞表【丽特异性抗原进行检测.2.5异/L 胰蛋白酶+0.2g/L乙二胺四乙酸消化待检细胞.收集 细胞,1200r/n]in离一tL,5min用培养液调整细胞的浓 度<1.5,3)X10.啦取ImL细胞悬液加入1.5mL eppendorf管中,离心,将沉淀细胞用100L0.5%牛血 清白蛋白重悬,加入:同的I抗抗体(见表1),4qc孵 育30rain.离心.磷酸盐缓冲波冲洗,需问标的抗体, 加荧光标记?抗,4孵育30rain最后细胞用40g/L 甲醛固定.样品用流式细胞仪鉴定..分别设实验组,同 型刘照组,空白对照组..每组标本3例,取平均值 表1流或蛔胞橙溅单屯隆抗雌 四唑盐比色法细胞活力检测:单层培养细胞消化 后用含胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液. 记数每组细胞浓度.按每孔1000个细胞接种96孔板 上(每孔200L,高密度组和低密度组各加4x12个孔 (4组数据平均.观察l2d),培养3d后,每孔加人四 唑盐溶液201,培养箱孵育4I1,吸弃孔内上清,每孔 人l50”I二甲基亚砜振荡l0min使结晶物充分溶解 后.在酶联免疫检测仪L选择490tLl~l波长比色., 主要观察指标:?细胞倒置相差显微镜观察结 果.,?部分流式细胞仪检测结果.?四唑盐比色法细 胞活力观测结果. 2结果 2.1细胞倒置相差显微镜观察结果原代脂肪来源细 胞成分较复杂,形态各异,有短圆形,梭形,方形等(图 1).细胞传代后形态渐趋一致以梭形为主.第3代低 密度传代组细胞(圈2)一致性强于高密度传代组(图 3).并且更多分布小圆外形高亮度的正处于分裂状态 的细胞= 2.2部分流式细胞仪槛嘲结果原代细胞CD14, CD106.Stro-I阴性+CD29,CD3l,CD34,CD49d,CD105, CDl66阳性;第3代细咆CD31.CD34CD49d转为阴 性而CD14,Stro-l转为阳性.其中不同密度组比较低 密度组CD29.CDl05,CDI66.Stro-lI轲性细胞显着多 于高密度组(图4),细胞表面标志变化『见图5.. ??? l5:圈j延l.j烂 . i . .. CD105PE 高宙度纽(第31t CD】05PEl:7I2/13 1:慨带度组c第3代) 圈4细胞表面标志主化洗置妇抱卑争强蛄果 』圈j蛔胞表面标志变化(n=5) +1 嚣P熊藤算 2.3四唑盐比色法细胞活力观测结果比较两种 密度组细胞增殖活力.不同接种密度传代后细胞生 长能力类似,每个测试点f检验比较差异无显着性 (P>0.05)(见图6) 中国临床康复第巷第33朋2006-09—10出版 ChineseJouofClinicalRehabilitation,September102006Vo1.10No.33 +高密度接种 -- 0-低密度接种 - II-空白对照 l23456789l0lll2 t/d 图6四唑盐比色法观测细胞活力 3讨论 干细胞是目前组织工程和再生医学领域研究的 热点.脂肪来源基质细胞在体内分布广泛,取材创伤 小,来源充足,且具有很强体外扩增能力和多向分化 潜能等特点,已成为目前十分优良的种子细胞来源[3】. 但现有的分离培养方法很难纯化脂肪来源细胞得到 干细胞,本实验中也观察到这些体外具有良好增殖能 力的脂肪来源细胞贴壁后,呈现多种形态.目前研究 认为脂肪组织分离得到的贴壁细胞中混杂有脂肪前 体细胞,成纤维细胞,内皮细胞,平滑肌细胞,血管周 细胞等,由于这些混杂细胞的存在,常规培养方法得 到的脂肪来源细胞的CD105,CD106,CD166等干细胞 相关表面抗原阳性表达率明显低于骨髓基质干细胞, 这也是目前影响脂肪来源基质细胞定向与多向分化 能力及构建特定组织均质程度的主要干扰因素.因 此,建立脂肪来源细胞的体外扩增与纯化技术是决定 其能否广泛应用的关键问题. Coher等嘲在研究骨髓基质干细胞时发现,在降低 密度接种培养(1000/cm及以下)时,骨髓提取细胞 群中外形小而圆的RS细胞(rapidlyself-renewcel1)增 多,.RS细胞被认为可以快速自我复制,并且有更强的 多向分化潜能,相对骨髓提取细胞中的其他细胞更具 有干细胞的特性.本实验根据这一现象,通过普通接 种密度培养传代和低密度接种传代的比较,探讨能否 通过降低脂肪来源细胞的传代培养密度,提高其中具 有干细胞潜能细胞的比例.根据本实验的初步研究结 果,低密度传代培养后,外形较小的梭形细胞比例比 高密度传代培养有明显增加.低密度培养时,多数细 胞贴壁伸展后呈现细长梭形,较少出现类似高密度接 种培养组中的体积较大的扁平,方形细胞,脂肪 来源基质细胞在低密度传代培养过程中可能具有类 似于骨髓基质干细胞的传代生长扩增特性. 原代培养的脂肪基质细胞中有一定比例的 CD31,CD34,CD14,CD29等与内皮系,造血系及成纤 维细胞系相关的表面抗原表达,说明原代脂肪基质细 胞中确实含有大量的造血系,内皮系,成纤维细胞等 41 系的混杂细胞.原代培养的脂肪基质细胞中干细胞相 关表面抗原CD105,CD166,Stro.1等表达率均较低,说 明原代脂肪基质细胞中干细胞含量较低.第3代细胞 中干细胞相关表面抗原CD105,CD166,Stro.1等表达 率均有明显提高,说明体外传代扩增后,脂肪来源基质 细胞因增殖能力强,可以优势生长,从而在细胞群体中 所占比例升高.第3代细胞中,低密度培养组CD105, CD166,Stro-1等的表达率又显着高于高密度培养组, 说明低密度培养更有利于脂肪来源基质细胞的优势生 长和体外增殖.这可能与细胞生长空间多,细胞间接触 抑制较少,细胞自发分化程度较低有关.同时CD31, CD34,CD14,CD29等与内皮系,造血系及成纤维细胞 系相关的表面抗原表达在低密度传代过程中并未增高 说明该培养条件下成体细胞未优势生长. 四唑盐比色试验是一种检测细胞存活和生长的方 法,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性四唑 盐还原为难溶性的蓝紫色结晶物,再用二甲基亚砜溶 解,用酶联免疫检测仪测定吸光值,可间接反映活细胞 的数量.本实验发现经过12d的培养发现高密度接种 组的细胞增殖在7,8d达到平台期,而低密度组在9, 10d进入平台期,但统计检验两组细胞生长能力无显 着性差异,四唑盐比色试验结果说明低密度培养并不 会降低脂肪来源基质细胞的体外增殖活性,而低密度 培养有可能获得更多的细胞总量,同时可以产生比例 更高的具有干细胞潜能的细胞.当然可能还需要更多 体内体外组织诱导,构建实验进一步证明. 结论:通过低密度传代培养可能有利于脂肪来源 基质细胞在传代过程中的进一步纯化,提高具有干细 胞特性细胞的比例,并且不改变其体外增殖活性,从而 获得细胞纯度更高,总量更多具有干细胞特性的脂肪 来源基质细胞.但本实验中所列举的干细胞相关表面 抗原均是根据文献报道来的,目前作者正在通过 细胞分选与纯化技术(流式或磁珠细胞分选)进一步鉴 定和证实这些干细胞相关表面抗原阳性细胞的多向或 定向分化替能,相信待这些问题明确后,便可以根据鉴 定结果建立脂肪来源基质细胞的纯化与分离技术. 4参考文献 1Slack,JM.StemCellsinEpithelialTissues.Sc/ence2000;287:1431-3 2ZukPA.ZhuM.MizunoH.MultilineageCellsfromHumanAdiposeTissue: ImplicationsforCell—BasedTherapies.T/ssueEng2001;7(2):21l一28 3ClarkeDLJohanssonCB,WilbertzJ.etGeneralizedpotentialofadult neustemcells.sc/ence2000;288:1660—3 4GronthosS,FranklinDM,LeddyHA,eto1.surfaceproteincharacterizationof humanadiposetissue—derivedstromalcells.Jcellphysiology2oo1;189:54—63 5ColterDC.ClassR.DiGirolamoCM.eto1.Rapidexpansionofrecyclingstem cellsinculturesofplastic’adherentcellsfromhumanbonemarrow?ProcNatl AcadsciUSA2000;97(7):3213—8