饲料添加剂(I)粪肠球菌质量内控标准-提供伟嘉版本
DBNF-SW-5-Y005 北京大北农科技集团股份有限公司内控标准
饲料添加剂(?)粪肠球菌质量内控标准
2013-6-16发布 2013-7-1实施
北京大北农科技集团股份有限公司 发布
前 言 本标准由北京大北农科技集团股份有限公司提出并起草。 本标准主要起草人:刘雪连
本标准于2013年7月首次发布
饲料添加剂(?)粪肠球菌质量内控标准 1 范围
本标准
了粪肠球菌产品的
、检验方法、检验规则、标签、包装、运输和贮存。
本标准适用于本公司生产的粪肠球菌饲料添加剂。
2 规范性引用文件
下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
GB/T 14699.1-2005 饲料 采样
GB/T 5917.1-2008 饲料粉碎粒度测定法
GB/T 6435-2006 饲料中水分的测定
GB 10648 饲料标签
GB/T 13079-2006 饲料中总砷的测定
GB/T 13080-2004 饲料中铅的测定 原子吸收光谱法
GB/T 13091-2002 饲料中沙门氏菌的检验方法
GB/T 14699.1-2005 饲料采样方法
GB/T 18823-2002 饲料检测结果判定的允许误差
JJF 1070-2005 定量包装商品净含量计量检验规则
国家质量监督检验检疫总局第75号令(2005)定量包装商品计量监督#管理
# 3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1 杂菌数
指在选择培养基上,除粪肠球菌外的其他细菌和霉菌菌落数之和。 3.2 杂菌率
指杂菌数在目的菌种数和杂菌数之和中所占百分率。
4 要求
4.1 感官指标
表1粪肠球菌的感官要求
产品名称 杂质 外观 色泽 气味 项目指标
淡黄色至黄具有乳酸特有的酸甜味,无腐败,无异物 粉末状 DBN粪肠球菌原粉 褐色粉状 无异臭味
溶解度大淡黄色至黄具有乳酸特有的酸甜味,无腐败,于95%,无粉末状 DBN粪肠球菌可溶原粉 褐色粉状 无异臭味 异物
乳白色至淡具有乳酸特有的酸甜味,无腐败,无异物 颗粒状或条状 DBN粪肠球菌菌粒 黄色颗粒状 无异臭味
4.2 理化指标
理化指标应符合表2的规定。
表2粪肠球菌理化指标
孔径 水分 粪肠球菌活菌数
产品名称 8? (×10个/g)?
项目指标
DBN粪肠球菌原粉 7% 500
DBN粪肠球菌可溶原粉 7% 500
DBN粪肠球菌菌粒 0.8mm 10% 500 4.3 卫生指标
标准名称卫生指标应符合表3的要求。
表3 粪肠球菌卫生指标
项目 指标
杂菌率? 0.1%
致病菌(肠道致病菌或致病性球菌) 不得检出
总砷(以As计)(mg/kg) ?2.0
铅(以Pb计)(mg/kg) ?5.0
其它卫生指标 符合NY/T 1444 2007中4.1.3的规定 4.4 净含量
按国家质量监督检验检疫总局第75号令执行。
5 检验方法
本标准使用的水,在未注明其他要求时,应符合GB/T 6682中三级用水的要求。
本标准所使用的试剂,在未注明规格时,均为分析纯(AR)。如有特殊要求另作明确规定。
5.1 抽样
按GB/T 14699.1-2005的规定,进行样品的采集。采样时必须特别注意样品的代表性
和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具,如灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属
勺和刀。在卫生学调查基础上,采取有代表性的样品。样品采集后应立即进行检验。
5.2 感观检验
取一定量(固态250g、液态250ml)的样品于无色玻璃杯中,采用目测、鼻嗅的方法
进行检验。
5.3 水分测定
按GB/T 6435-2006规定方法测定。
5.4 成品粒度测定
按GB/T 5917.1-2008规定方法测定。
5.5粪肠球菌检测
按附录A(规范性附录)执行。
5.6 卫生检测
5.6.1砷含量测定
按GB/T 13079-2006规定执行。
5.6.2 铅含量测定
按GB/T 13080-2004规定执行。
5.6.3 霉菌检测
按GB/T 13092规定执行。
5.6.4 细菌总数
按GB/T 13093规定执行。
5.6.5 致病菌检测
按GB/T 13091-2001、GB/T 4789.5-2008和GB/T 4789.10-2003规定执行。 5.6.7 杂菌率
霉菌数,(细菌总数-目的菌数)杂菌率,,100%计算公式: 霉菌数,细菌总数
5.7 净含量
按JJF 1070-2005规定执行。
5.8 监测与仲裁判定
检测结果判定的允许误差按GB/T 18823-2002规定执行。 6 检验规则
6.1 检验分类
产品的检验分为出厂检验和型式检验两类。
6.2 组批与取样
6.2.1 组批:同品种、同一生产线、同一天内生产的同一批料为一批。
6.2.2取样:按GB/T14699-2005方法取样,每批产品包装袋数为1-4时,每袋取样;每批产品包装袋数为5-16袋时,最少取4袋;每批产品包装袋数大于16袋时,最少取袋。2n每批取样量不少于0.5kg。
6.3 出厂检验
感官指标、水分、粒度、微生物含量(含活菌数和杂菌率)指标为出厂检验项目,产品出厂前必须由公司质检部门检验合格并出具合格证,方可出厂。
6.4 型式检验
6.4.1一般情况下,企业半年进行一次型式检验。但有下列情况之一时,亦须进行型式检验。
a)产品成批出厂前;
b)原料、配方、生产工艺及设备有重大变化时;
c)产品停产3个月以上需要重新恢复生产时;
d)国家质量监督机构要求进行质量抽查时。
6.4.2 型式检验项目:第4章所规定的全部项目。
6.5判定规则
6.5.1 在保证产品质量的前提下,生产厂可根据工艺、配方、设备、原料等变化情况,自行确定出厂检验的批量。
6.5.2检验时如产品已霉烂变质、有明显结块或有致病菌检出,卫生指标不合格,则判定该批产品为不合格产品,不得复检;
6.5.3 活菌指标若低于表2规定值的80%者为不合格项,允许在原样本中加倍取样复检,以复检结果为依据。若仍有不合格项,则判定该批产品为不合格产品。
7 标签、包装、运输、贮存、保质期
7.1 标签
采用鲜明的标签贴于外包装,标签内容应符合GB 10648的规定要求。 7.2包装
包装为铝箔袋、纸箱包装或纸塑复合袋包装。包装应符合运输和贮存的要求。 7.3 贮运
贮运过程中防雨、防潮、防止日光暴晒。不得与有毒有害或其它污染物品混装、混运。 7.4 贮存
产品应贮存在凉爽、通风、干燥的库房内,或阴凉贮存。不得与有毒有害或其它污染物品混贮。
7.5保质期
在符合贮存运输的条件下,自生产日期起保质期为12-15个月。
附录A
(规范性附录)
粪肠球菌检测方法 A1 范围
生产分析和质量控制部门适用。
A2 原理
细菌呈球状、球杆状,0.5-0.8μm,常成对或短链状排列,无芽孢,革兰氏染色阳性。在血平板上
菌落呈针尖大小、灰白色、圆形、表面光滑凸起、溶血。在葡萄糖肉汤中呈均匀混浊生长。
革兰氏阳性,过氧化氢酶呈阴性,能在6.5%氯化钠肉汤、pH9.6葡萄糖肉汤及45?生长,能分解
葡萄糖产酸不产气,发酵山梨醇,不发酵阿拉伯糖,硝酸盐还原阴性,精氨酸双水解阳性,最适生长温
度36?,最适pH4.7-7.6。
A3 试验方法
A3.1 仪器设备和
A3.1.1 生物显微镜(10×100)
A3.1.2 菌落计数器
A3.1.3 恒温培养箱(36?1?)
A3.1.4 恒温干燥箱
A3.1.5 恒温摇床
A3.1.6 灭菌锅
A3.1.7 无菌室或超净工作台
A3.1.8 酸度计
A3.1.9 架盘药物天平:0-500g,精度至0.5g
A3.1.10 试管:Ф15mm×150mm Ф18mm×180mm
A3.1.11 灭菌培养皿:直径9cm
A3.1.12 三角瓶:500ml
A3.1.13 无菌吸管:1ml(具有0.01ml刻度) 5ml,10ml(具有0.1ml刻度)
A3.1.14 玻璃刮刀或L型玻璃棒(涂布棒)
A3.1.15 灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属勺和剪刀
A3.1.16 酒精灯
A3.1.17 载玻片
A3.1.18 镊子
A3.1.19 接种环、接种针
A3.1.20 均质器或微型振荡箱
A3.2 培养基和试剂
A3.2.1 除特别注明外,试验中所有试剂为分析纯试剂,水为蒸馏水或相应程度的水,溶液为水溶液。
) A3.2.2 BPY琼脂培养基(配置方法见附录B1
A3.2.3 血琼脂培养基(配置方法见附录B2)
A3.2.4 pH9.6的肉汤培养基(配置方法见附录B3)
A3.2.5 耐盐试验培养基(配置方法见附录B4)
A3.2.6 40%胆汁肉汤培养基(配置方法见附录B5)
A3.2.7 糖类发酵培养基(配置方法见附录B6)
A3.2.8 硝酸盐培养基(配置方法见附录B7)
A3.2.9 索恩利氏培养基(配置方法见附录B8)
配置方法见附录B9) A3.2.10 革兰氏染色液(
A3.2.11 解囊液(配置方法见附录B10)
A3.2.12 乳酸纸层析法(配置方法见附录B11)
A3.2.13 格里斯氏试剂(配置方法见附录B12)
A3.2.14 二苯胺试剂(配置方法见附录B13)
A4 粪肠球菌菌落数检测
A4.1 检验程序如下
检 样
?
用无菌水做成几个适当倍数稀释液
?
选择2-3个适当稀释度各0.1ml,加入富集培养基平皿
?
36?1? 培 养24小 时
?
菌 种 鉴 别 检 验
?
菌 落 计 数
?
报 告 A4.2 操作步骤
A4.2.1 采样
A4.2.1.1采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具,
如灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属勺和刀,采取有代表性的样品,样品采集后应尽快检验,否则应将样品
放在低温干燥处。
A4.2.1.2以无菌操作称取经过充分摇匀的待检样10克移入含有90毫升解囊液(按本标准附录B10规定
执行)的灭菌三角瓶内,并于振荡器中恒温振荡培养器中36?,200rpm预处理30分钟,做成1:10的均
匀稀释液,混合均匀。
A4.2.1.3用无菌吸管吸取1:10稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中,并于微型振荡器中8000-10000转/分钟处理2-3分钟,充分摇匀制成1:100的稀释液。
A4.2.1.4 用无菌吸管吸取4.2.1.3的稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中,进行10倍梯度稀释,并于微型振荡器上混合3min。每个稀释度换用一支1.0ml灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递
-8增稀释直至10。
A4.2.2 平板计数法
A4.2.2.1估计样品的含菌量,选择三个连续稀释度,分别在作10倍稀释的同时,各取0.1ml分别加到计数培养基平皿,均匀涂布,各个稀释度作3个平皿,最好同时作2种培养基,同时作无菌水空白对照。以上操作全过程需在20min内完成。
A4.2.2.2 将平板倒置于36?恒温中培养,培养24小时后观察菌落特征。
A4.2.2.3 选取具有30-300个典型菌落的平板,进行计数。并计算同一稀释度三个平板的平均菌落数。 A4.2.2.4根据证实试验确定为粪肠球菌的菌落数,按比例计算出该皿内的粪肠球菌的菌落数,然后乘其稀释倍数再乘以10,即得每克(或ml)样品所含粪肠球菌数并作出报告。
-6例:将检样10稀释液0.1ml涂布于选择富集培养基平板上,生成的可疑菌落数为35个,取5个
6进行鉴定,证实为菌粪肠球菌菌的是4个,则1g样品中菌粪肠球菌菌数为(35×4/5)×10×10=1.2
8×10。
A4.2.2.5计数后,将可疑菌落、目标菌落分别接种于营养琼脂斜面,与37?培养24小时,进行粪肠球菌鉴定试验。
A5 粪肠球菌的鉴定
A5.1在pH9.6的肉汤培养基上的生长试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种葡萄糖肉汤(pH9.6)液体培养基,并将未接种的空白作对照,于36?培养18—24小时,观察生长情况,培养基有混浊物为阳性。粪肠球菌能够在pH9.6的肉汤培养基上的生长。
A5.2耐盐试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种耐盐培养基,并将未接种的空白作对照,于35?培养3-7天,与未接种的对照管对比,观察培养液的混浊情况,
试验结果。粪肠球菌能够在6.5%NaCl的培养基上生长。
A5.3 耐胆盐试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种40%胆汁肉汤(pH9.6)液体培养基,置35?培养24-48小时,观察有无细菌生长。阳性菌呈颗粒状生长,上液澄清,管底有沉淀;阴性菌则不生长。粪肠球菌为阳性,可以生长。
A5.4 葡萄糖产酸和产气试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种乳酸菌葡萄糖发酵培养基,并将未接种的空白作对照,于36?培养2 -3天,观察记录。若产酸则培养基变黄色,并可用pH计测定pH值,用纸层析法检查是
-4.6,否为乳酸。若产气则德培拉姆氏小试管中有气泡。粪肠球菌发酵葡萄糖产乳酸不产气,pH可达4.1发酵山梨醇,不发酵阿拉伯糖。
A5.5 硝酸盐还原试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,种硝酸盐培养基,并将未接种的空白作对照,于35?培养3天,在干净的比色瓷盘小窝中倒入少许已接种培养的培养液,再滴一滴格里斯氏试剂的A液及B液。在对照中同样加入格里斯氏试剂的A液及B液各一滴。观察并记录溶液是否变色,若变红色则为阳性,若无红色出现,再加入一滴二苯胺试剂,如溶液变为蓝色则为阴性,不变蓝色,则为阳性。粪肠球菌为硝酸盐还原阴性。
A5.6 精氨酸双水解酶测定试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,穿刺接种索恩利氏培养基,并用灭菌的凡士林油封管,并将未接种的空白作对照,于35?培养3、7、14日观察,培养基转为红色者为阳性,不变者为阴性。粪肠球菌的精氨酸双水解酶测定试验呈阳性。
A5.7 结果解释及报告
符合粪肠球菌群的特征,有较强的耐盐性、耐胆碱性、能在pH9.5的培养基上很好的生长、葡萄糖发酵产酸不产气、发酵山梨醇、不发酵阿拉伯糖、硝酸盐还原阴性、精氨酸双水解酶测定试验呈阳性,则可报告为粪肠球菌。
对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验。
附录B
(规范性附录)
专用培养基和试剂
B1 BPY琼脂培养基
葡萄糖 5g 酵母膏 5g 氯化钠 5g 大豆蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 碳酸钙 0.7g 蒸馏水 1000mL 按以上配方配制培养基,溶解后用40%的氢氧化钠溶液调pH为6.8-7.0,高温蒸汽灭菌锅121?,
20min灭菌。
B2 血琼脂培养基
蛋白胨 10g 葡萄糖 2g 氯化钠 5g 磷酸二氢钾 2.5g 柠檬酸钠 5g 脑浸汁 800ml 猪心浸汁 200ml 羊血 10% pH 7.2 注:猪心和猪脑浸汁法:
(1)新鲜猪心除去心头和脂肪,搅碎100克加蒸馏水至1000ml; (2)新鲜猪脑除去血管,取200g加蒸馏水至1000ml;
(3)50?保温1小时,然后煮开15min;
(4)冷却后用纱布过滤备用。
B3 pH9.6的肉汤培养基
pH9.6的肉汤 100ml 葡萄糖 2g/L 注:将普通肉汤调整pH9.6,加入葡萄糖溶解后,分装试管,每管2,3ml,121?灭菌15min,备用。
B4 耐盐培养基
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 65g
蒸馏水 1000ml
将上述成分溶解后,调节pH7.0,分装试管,高压灭菌121?15min,20min,冷至45?,备用。
B5 40%胆汁肉汤培养基
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
牛肉浸膏 5g
新鲜胆汁(猪、牛) 400ml
蒸馏水 600ml
先将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠加热溶于蒸馏水中,调pH至7.6,加入胆汁混匀后,分装试管,每
管3ml,置115?灭菌20min,冷藏备用。取新鲜猪(牛)胆若干只,取胆汁用纱布过滤,装于瓶中115?
灭菌20min,冷却后置4?冰箱内,次日取出吸取上清液备用。
B6 糖类发酵培养基
B6.1 基础培养基
蛋白胨 1%
酵母膏 0.5%
吐温80 0.1%(v/v)
盐溶液A 0.5%(v/v)
盐溶液B 0.5%(v/v)
溴甲酚紫(1.6%水溶液) 约1.4ml
盐溶液A: KHPO 10g 24
KHPO 10g 24
蒸馏水 100ml
盐溶液B: MgSO?7HO 11.5g 42
MnSO?2HO 2.4g 42
FeSO?7HO 0.68g 42
蒸馏水 100ml B6.2 以上成分溶解后调pH到6.8-7.2,分装试管。121?高压灭菌20-30min。 B6.3 葡萄糖、阿拉伯糖、山梨醇各10g
B6.4 将山梨醇和阿拉伯糖配制成10%的水溶液,经过滤灭菌后用无菌操作加到无菌基础培养基中。
硝酸盐培养基 B7
牛肉蛋白胨培养基 1000ml
KNO3 1g
培养基配制好后,调节pH7.0-7.6,分装试管,每管4-5ml,121?蒸汽灭菌15-20min,冷至45?,
备用。
B8 索恩利氏培养基
蛋白胨 1g
NaCl 5g
KHPO0.3g 24
洋菜 6 g
酚红 0.01g
L-精氨酸盐 10g
蒸馏水 1000ml
将以上成分加热溶解,调节pH7.0-7.2,分装试管,每管4-5ml,121?蒸汽灭菌15-20min, 冷至
45?,备用。
B9 革兰氏染色法
B9.1 结晶紫染色液
结晶紫 1g
95%乙醇 20ml
1%草酸铵水溶液 80ml
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
B9.2 革兰氏碘液
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水 300.0ml
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振荡,待完全溶解后,再加蒸馏水至300ml.
B9.3 沙黄复染液
沙黄 0.25g
95%乙醇 10.0ml
蒸馏水 90.0ml
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
B9.4 染色
B9.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
B9.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min水洗。
B9.4.3 滴加95%乙醇脱色约15-30s,或将乙醇滴满整个涂片,立即倒去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10min.
B9.4.4 水洗,滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
B9.4.5 结果
革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
B10 解囊液
柠檬酸9.6g,磷酸氢二钠14.2g加蒸馏水至1000ml,调节pH 至7.5,分装,121?,15min灭菌,备用。
B11 乳酸纸层析法
B11.1 展开剂:水、乙醇、正丁醇以1:5:5的量相混合,然后加1%的甲酸。
B11.2 显色剂:0.04%的溴酚蓝酒精溶液,用0.1%的NaOH调pH到6.7。
B11.3 1mol/L乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸8.4ml,移入100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,备用。 B11.4 0.1mol/L乳酸标准使用液:将1mol/L乳酸标准溶液稀释至0.01mol/L。 B11.5 点样
选择大小合适的国产新华滤纸,在滤纸下方距边约3cm处划条横线,每隔2.5-3cm划一点作为点样位置,并表明点样编号。用干净的毛细管沾取样品点样,每点一次样品用吹风机吹干,0.01mol/L乳酸标准使用液为对照。
B11.6 层析
将点好样的滤纸放入层析缸,先用展开剂饱和一夜,然后加展开剂开始层析。上行25cm左右取出晾干,喷显色剂,并与对照比较黄色斑点的位置,确定是否是乳酸。
B12 格里斯氏试剂
A液:将对氨基苯磺酸0.8g,溶解于2.5mol/L乙酸溶液100ml;
B液:将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100ml中。
B13 二苯胺试剂
将二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中,用20ml蒸馏水稀释。