孢子型乳酸菌之高菌量发酵培养

孢子型乳酸菌之高菌量发酵培养 孢子型乳酸菌之高菌量發酵培養 A fermentation study for the sporogenous lactic bacterium 李國陽 李順來 郭志彬 Kwong-Yang Lee, Shun-Lai Li and Chi-Pin Kuo 南台科技大學 化學工程系 Department of Chemical Engineering, Southern Taiwan University of Technology 摘要 乳酸菌在現代之日常生活中扮演著相當重要的角色, 它不但可以產生乳酸, 降低腸道中之PH而達到抑制腸內腐敗菌及致病菌之生長, 同時它亦可能產生多 種抗菌物質可以殺死腸道中之壞菌. 由於這些優秀之功能, 使相關產品在世界 各國大為風行. 本研究計畫進行孢子型乳酸菌之篩選與培養;菌種之耐酸性,溫度穩定性, 貯 存安定性, 抑菌性及加工穩定性等特性為篩選時之判斷標準, 期望能透過此一標 準而篩選出一株具優良特性之孢子型乳酸菌出來. 除此之外, 我們亦將針對此一 菌種進行深入之發酵條件, 加工條件, 以及其貯存條件等之研究. 關鍵詞:乳酸菌、孢子型乳酸菌 ABSTRACT Lactic bacteria have been used as healthy supplement for years . It is well known that by adding lactobacillus species to the human or animal diet , a series of advantages can be achieved , such as promoting the growth of the animal and protecting it from certain disorders . This is due to lactic acid and /or antibiotic -like substances produced, and the positive interferences in the functional reflexes of the digestive system . In this project ,we screen the sporogenous type of lactic bacterial with some special characteristics , such as acidic pH resistance , high temperature torelence , and good storage stability. In this study we isolate a sporogenous bacteria . Lactobacillus sporoagenes and optimize the culture conditions for this strain was performed in a 5L fermentor. In particular , evaluating the effect of culture temperature , medium PH , and medium composition on cell growth and sporogenation were well studies in this project . Key words: Lactic bacteria , sporogenous bacteria 1 1.前言 乳酸菌通常是泛指能夠發酵碳水化合物,以產生乳酸為主要產物之微生物,乳酸菌在多數動物消化道中為優勢菌,細胞較大,通常以成隻或成串出現;少數具有芽胞及莢膜,能在很廣圍的溫度(15?~45?)中生長。其具有抑制腸道中有害微生物的生長,調節及建立腸道內菌相外,其還具有治療腸內不適所引起之腹瀉,降低血中膽固醇,並且改善乳糖不耐症以及抑制致癌因子及癌細胞等等療效,就因乳酸菌具有這些優點的存在,因而乳酸菌至今才會被世界各地延用多年。 雖然在市面上利用乳酸菌所製造出的產品十分眾多,例如優酪乳(統一AB優酪乳,光泉晶球優酪乳…等) ,優格,起司,乳酪,三共胃腸藥,飛鳴,泡菜…等等相關的產品。但在這些產品之中能夠真正在人體中發生其作用的乳酸菌之菌種十分的少,其主要原因乃是人體的胃酸值介於PH值2~3之間,而使得許多乳酸菌種根本無法在此低PH值之下生存,所以市面上有的產品的確有很強之健胃整腸的效果,但有的產品其功能卻令人十分的值得懷疑。 根據許多文獻中記載中孢子本身具有高度的耐酸性,耐高溫性,及高度貯存安定性,但乳酸菌中會產生孢子的菌種卻十分的少見,目前文獻上的孢子型乳酸菌有Sporolactobacillus、Bacillus laevolacticus、Bacillus racemilacticus、Bacillus coagulans 被應用於益生菌,且具有很好之保健效果。 2.研究動機與目的 由於Bacillus coagulans 已被廣泛地應用於腸胃疾病,安全性較無問題,且其在好氧環境生長快速。因此我們將篩選此菌株,對其特性、高菌量發酵培養及產孢性作一詳細研究,以建立一套可以量產化的商業化製程,未來期望能進一步轉移給業界進行量產。 3.實驗方法與步驟 a. 菌種篩選與鑑定 動物糞便中分離出多株菌種,將菌體倒入液態培養基:如表一、二:,培養 24hr,37?。將菌液移至45 ?培養箱培養48hr,使其產孢。產孢菌液以90 ?, -2-330min隔水加熱,使其未產孢的菌種死亡。以連續稀釋10, 10後取0.1mL 的稀釋菌液培養24hr 37 ?,以求得單一菌落,再以劃線法求得更純的菌株, 並以顯微鏡觀察。利用革蘭氏染色、顯微鏡觀察、作catalase測定、作oxidase 測定初步判定是否為凝結芽孢桿菌 ,再以 Biolog鑑定系統做進一步鑑定。 b. 5升發酵槽發酵分析 利用控制攪拌速率達到合適的溶氧量,利用發酵溫度、發酵時間、分批進料 2 法等,尋求高菌量培養。 c.菌種的生長條件與營養需求分析 不同溫度下的生長性,我們分別考慮25?、30?、35?、40?、45?、,50?、55?、60?發酵槽發酵培養。 不同碳源培養基之篩選,我們將分別改變Glucose,Sucrose,fructose,glycerol及starch,以探討不同碳源的影響。 d.尋求凝結芽孢桿菌最佳產孢溫度 我們將考慮在35?~60?間,尋求一較適的產孢溫度。分別考慮不同的溫度35?、40?、45?、50?、55?、60?培養使其產孢,我們將以眼視與顯微鏡觀察未產孢與產菌的差異。 e.孢子對於溫度及PH耐受性之測試 孢子菌對於不同溫度的耐受性測試: 將產孢的菌液分別取1mL後,各經80?、85?、90?、95?隔水加熱30分鐘、60分鐘、90分鐘,後取1mL使用連續稀釋法,稀釋後取1mL接於BCP上,放於37?培養48小時後計算菌數。 孢子菌對於不同pH值的耐受性測試: 將產孢的菌液分別取1mL放入pH2、pH3、pH4之液態培養液以37?培養後30分鐘取菌液分別取1mL接於BCP上,放於37?培養48小時後計算菌數。 4.結果與討論 a.菌種篩選與鑑定 目前我們已篩選得一株 Bacillus coagulans 其鑑定特徵如表三,進一步委託食品研究所作Biolog 系統鑑定。 b.菌種的生長條件與營養需求分析 生長溫度測試:在不同之溫度下,我們共測試了25?, 30?, 35?, 40?,45?,50?,55?,60?。 等八種不同成長溫度。實驗結果如圖一所示,由圖中可知,30?以下,以及45?以上菌體成長均不甚理想,50?以上,菌體成長則完全停滯。溫度在35~45?之間,菌體之成長情況差異不大,由此可知本株菌是屬中溫菌屬,未來應用在人體,動物之保健用途上甚為適合。 碳源之篩選,本研究共測試了包括Glucose,Sucrose,fructose,glycerol及 starch。等多種不同碳源,經測試結果以sucrose,glucose,starch可達較佳之成長,但與其他碳源之比較其優勢並不很明顯〈圖二〉,因此可以推論本菌株對碳源需求並不具特異性,這可能歸因於此株菌屬野生型,又營養需求較為寬鬆。 最佳產孢條件,為獲得較好之產孢率,本研究亦針對產孢溫度進行篩選比 3 較,由圖三可知,菌體培養溫度要在45?以上,才開始進行產孢。低於40? 以下產孢情況非常差,產孢速率亦很慢,而在55?以上,菌體在未產孢前到大量死亡,產孢率亦不佳。在45~50?應為最佳狀況。若配合糖濃度之偵測,可以發現在45?時,耗糖速率加快,在8~12小時內,發酵液中之糖濃度會降至零。這可能是造成在此溫度範圍內,產孢率較佳的原因。 孢子對pH耐受性測試,由於保健用乳酸菌需通過胃酸之嚴苛挑戰,才能順利到達腸道。因此乳酸菌對酸性條件之耐受性是一個非常重要的特性。由圖四可知,本株菌在pH3以上,耐受兩小時其菌體存活率幾乎不受影響。在PH2時,一小時內,菌體存活率仍在90%以上,2小時以上存活率降為80%左右。因此本株菌在商業使用上,應較一般市面上所販售之乳酸菌製品,具有更佳之耐酸性。 孢子對溫度之耐受性測試,在加工過程中,乳酸菌製通常會接觸到高溫條件,尤其是粉末或錠劑製品均需由高溫加以乾燥,因此對高溫度之耐受度是乳酸菌製品另一個非常重要的特性。由圖五結果可知,既使溫度在90?以上,30分鐘內,菌體存活率仍不受影響。1小時以上,生菌數才會下降,這個結果亦較一般之乳酸菌為佳。綜合以上結果可知,即使溫度在90?以上,30分鐘內,菌體存活力仍不受影響。1小時以上,生菌數才會下降,這個結果亦較一般之乳酸菌為佳。綜合以上結果可知,我們篩選到之乳酸菌的確具有較佳的耐酸性,抗溫性及加工穩定性,未來應用在商業化生產上應有很大之潛力。 5.結論 目前已篩得菌株Bacillus coagulans,並已用5L發酵槽發酵得OD值達到10(菌 9數大約為5*10隻/c.c),已達商業化生產標準。接下來將利用多次進料進行高菌量培養及用100L發酵槽進行試量產試驗。 6.謝誌 感謝國科會:NSC 89-2214-E-218-003:計畫的經費補助 7.參考文獻 1. 凌代文編著.乳酸菌細菌分類鑑定及實驗方法.1995. 2. 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