钩端螺旋体毒力因子研究进展

钩端螺旋体毒力因子研究进展 第34卷 2010年第6期 黑龙江医学 HEILONGJIANGMEDICALJOURNAL Vo1.34.No.6 Jun.2010427 ? 综述? 钩端螺旋体毒力因子研究进展 曾维诚综述,张英审校 (泸州医学院,四JII泸卅I646000) 关键词:研究;综述;钩端螺旋体;血清学;毒力因子 doi:10.3969/j.issn.1004—5775.2010.06.010 学科分类代码:310.4l中图分类号:R377.5文献标识码:A 钩端螺旋体病(1eptospirosis,简称钩体病),是 由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的钩端螺旋 体病(钩体病).是一种全球性自然疫源性疾病,广 泛分布在世界各地.我国是受钩体病危害十分严 重的国家,目前已发现有18个血清群75个血清 型,遍布31个省份,自1955年以来病例数超过250 万人,平均病死率约为1%. 钩体病虽然已发现100多年,但其致病机制至 今尚未完全阐明.一般认为,钩体对机体的黏附和 侵袭,其自身的运动性和趋向性,以及其代谢产物 等因素都与致病性相关.近年来,随着分子生物学 手段,测序技术及生物信息学分析水平的提高,使 得与钩体致病有关的毒力因子,如:脂多糖,溶血 素,鞭毛蛋白,外膜蛋白等的研究,取得了较大进 展.本文就这些研究成果,进行综述. 1脂多糖(Lip0polysacehride,LPS) 钩体LPS能诱发家兔出现施瓦茨曼氏(Shwar- tzman)反应,给小鼠注射LPS能引起广泛性内脏出 血,尤以肺出血更为严重,从而提示钩体病的肺弥 漫性出血可能与LPS有关.钩体LPS能促进中性 粒细胞与内皮细胞和血小板的黏附,造成血小板聚 集,并引发血小板减少症.Isogai?等,报道LPS可 诱导小鼠淋巴细胞发生凋亡,并认为与LPS引起 TNF—d的大量产生有关.近年来,Nally等,发现 在急性感染钩体的动物模型体内,钩体LPSO抗原 的达较慢性感染的动物体内和培养基中的少. 由此可见,通过调节LPS0抗原的表达,可以决定 钩体感染后是引发急性感染亦或是慢性感染. 目前,我国和巴西的科学家已分别完成了问号 钩体黄疸出血群赖型赖株和哥本哈根型的全基因 组测序工作,并对这两型基因组进行了比较分 析J.对基因组的分析,发现钩体LPS合成和装配 相关基因共有23,31个.钩体间基因的差异被认 为是钩体对不同的动物宿主的适应性和钩体型特 异性的原因.因此,对LPS的进一步研究,可能有 助于揭示钩体血清型特异性及多样性的分子机制. 2溶血素(Hemolysin) 钩体产生的溶血素分为两大类:鞘磷脂酶c类 溶血素和成孑L蛋白类溶血素.到目前为止,鞘磷脂 酶c类溶血素仅在致病性钩端螺旋体中检测到,以 sphA为代表.溶血素基因sphH编码的蛋白与绵羊 红细胞在37?混合作用20rain后,在透射电镜下观 察到红细胞膜上有小孑L,电子云密度降低,细胞内 容物渗漏,细胞形态改变,而阴性对照组则没有这 种现象,证实这种溶血素具有成孔型性. 溶血素的作用是破坏红细胞或其他细胞膜,增 加毛细血管的渗透性,使血管壁破裂造成皮下出 血,这可能是钩体感染宿主后造成机体组织器官的 病变,特别是毛细血管壁的渗漏,溶血性贫血以及 致命性肺弥漫性出血的一个重要原因.此外,溶血 素对钩体的生存也是必须的,钩体不能自身合成生 长所必需的碳源和能源,而且也不能在无金属离子 的培养基中生长,这些物质必须要靠外界供给.溶 血素破坏红细胞膜使其裂解释放出游离脂肪酸和 金属离子,供其自身生长需要.同时,溶血素可能 还有助于钩体在宿主体内的存活. 晚近,通过对问号钩体黄疸出血型赖株基因组 CDs的分析,已发现11个可疑的溶血素基因,均分 布在钩体大染色体上.除了LA0177的氨基酸序 列较短,没有磷酸酯酶结构域外,其余基因根据其 所编码蛋白的功能可分为两类:鞘磷脂酶类和非鞘 磷脂酶类,即成孔蛋白类溶血素基因.其中的9个 基因已在大肠杆菌BL21plysS克隆表达并成功地验 证了它们的溶血活性.但是,这些基因是否在宿 主体内表达以及其在体内的溶血活性和细胞毒性 如何,尚需实验验证. 3鞭毛蛋白(Flagellin) 钩体的鞭毛附着于钩体的两个亚末端,通过其 第34卷 4282010年第6期 黑龙江医学 HEIL0NGJIANGMEDICALJOURNAL Vo1.34.No.6 Jun.2010 在胞浆中的旋转导致菌体的运动.从钩体细胞中 分离的鞭毛经双向凝胶电泳显示,鞭毛由分子量介 于31.5,36kDa的7种蛋白组成.其中最为重要 的蛋白是FlaA,FlaB,两者相互作用影响鞭毛的螺 旋结构. 为了研究鞭毛在钩体致病中的作用,以Brachy— spirahyodysenteriae作为模型,用等位交换基【六J突变 分析其功能,构建flaA::cat,flaA::kan,flaB1:: kan,flaB2::cat和flaB3::cat突变体,观察这些突 变体是否可以导致运动能力的丧失并改变鞭毛的 结构来研究纯化的鞭毛功能.结果发现,上述突变 体的运动能力仍然存在,但是其运动能力均比野生 株弱.PicardeauM..等,用穿梭质粒作为自杀置 换体定向灭活双曲钩体的flaB基因,结果观察到突 变体鞭毛缺如,运动能力丧失,表明FlaB参与鞭毛 的组装及菌体移动.钩体鞭毛还做为抗原刺激T, B淋巴细胞应答.赖型钩体基因组中预测的4768 个基因中有50余个基因所编码的蛋白可能与钩体 鞭毛的生物合成有关,这50余个基冈均分布在钩 体大染色体上. 4外膜蛋白 外膜蛋白(Outermembraneproteins,OMPs)种类繁多,在钩体黏附,免疫和致病中意义重大.较 为重要的有以下几种. 4.1OmpL1 目前,发现OmpL1是钩体惟一的跨膜蛋白,由 320个氨基酸组成,分子量31kDa.OmpL1在致病钩 体表达的保守性和位于菌体表面,使其有可能成为 有效疫苗和诊断抗原的候选者.尽管单独使用含 有重组OmpL1的大肠杆菌膜片段主动免疫金黄地 鼠,对同种钩体Kirsehneri基因种RM52无显着的 保护作用,但使用含有重组OmpL1和LipIA1的大 肠杆菌膜片段免疫后,却出现了明显的保护作 用….Maneewatch等,用编码问号钩体黄疸出 血群哥本哈根型OmpI1基因的质粒DNA疫苗 (ompL1一pcDNA3.1+)免疫仓鼠,表明OmpL1DNA 疫苗可提供抗异种钩体的交叉保护作用.免疫印 迹试验显示:重组OmpL1具有良好的抗原性, ELISA表明重组OmpL1可与感染同型钩体的血清 发生强烈反应,提示该蛋白可作为广普疫苗和免疫 诊断抗原的候选者J.ReitstetterRElI等,亦有类 似的报道.可见OmpL1在钩体病的诊断和预防上, 具有一定的价值. 4.2LipL32 LipL32,也称为Hap一1.由272个氨基酸组 成,分子量为32kDa,其结构基因含816bp核苷酸, 是钩体中含量最多的表面暴露脂蛋白,除自身具有 溶血活性外,还能调节溶血素HlyX,促进溶血…. Yang1等,发现LipL32的重组体可以刺激近曲小 管上皮细胞通过诱导NF—KB,AP一1转录,促进 iNOS,TNFct和MCP一1的分泌,而LipL32的抗体可 阻止这一反应,提示Lipl_32通过NF—KB介导的通 路,引起肾小管上皮细胞损伤,引发肾小管问质性 肾炎.进一步研究证实引,重组的LipL32可诱导 小鼠.肾小管上皮细胞TLR2受体表达上调,伴有iN- OS,MCP一1产生增加,抗TLR2受体的抗体可以阻 断LipL32引起的iNOS,MCP—lmRNA表达增加, 表明LipL32通过TLR2受体诱导了的小鼠肾小管 上皮细胞炎症介质的释放,可能是引起肾小管间质 性肾炎的一个重要毒力因子. 对LipL32免疫保护作用的研究,一直深受重 视.2001年,BrangerH等,以腺病毒作为载体,制 备含有LipL32的疫苗,免疫动物后可保护动物对抗 异种有毒钩体的攻击.随后,为消除腺病毒的不良 影响,他们以真核质粒为载体,构建DNA疫苗免疫 沙鼠,发现免疫鼠可耐受3种不同型别钩体的攻 击,提示LipL32(Hap一1)可以在沙鼠体内诱导交 叉免疫保护反应,但有趣的是,重组LipL32蛋白 却不能诱导明显的保护性免疫.最近,Seixas16]等 用表达LipL32的重组卡介苗免疫仓鼠,再用致死剂 量的问号钩体哥本哈根型攻击,尸检和组织学检查 表明:接种重组卡介苗后,在注射了钩体的动物体 内没有找到发生钩体病的证据,进一步证实了Li. pL32的免疫保护效应. 迄今,在钩体感染的病人中,已发现了7种与 感染有关的蛋白,其中免疫印迹实验表明.LipL32 的抗体IgG在急性期和感染期病人血清中分别占 37%和84%,具有很强的特异性和敏感性,提示Lj. pL32可作为诊断钩体病的候选抗原.实际上,已有 多个研究证实了LipL32的诊断价值ll']. 4.3LipL21 LipL21是一种新型表面暴露性脂蛋白19],该 蛋白在问号钩体赖型赖株外膜蛋白中的含量仅次 于LipL32.LipL21无论在体内还是体外,是否缺铁 以及不同温度条件下均表达.Southern杂交显示, LipL21存在于所有致病菌株,而在被检的非致病菌 株中均未发现,提示LipL21是钩体的又一毒力因 第34卷 2010年第6期 黑龙江医学 HEILONGJIANGMEDICALJ0URNAL V01.34.No.6 Jun.2010429 子. 4.4LipL41 LiplA1由355个氨基酸组成,分子量为 41kDa,结构基因含1065bp核苷酸.LiplA1在动 物感染时表达上升,且免疫沉淀试验显示其暴露于 外膜表面.晚近发现LiplA1还具有结合氯化高 铁血红素的能力,这可能对钩体的生长有一定的作 用.免疫保护实验证实,以LiplA1或OmpL1单独 免疫不能产生有效的保护作用,但两者共同免疫 时,免疫保护率明显提高.由此可见,LiplA1与 OmpL1有协同免疫保护作用. 4.5LipL36 LipL36的OFR含1092bp核苷酸,编码364个 氨基酸,分子量36kDa.在钩体生长培养过程中,Li— pL36的表达量不同.在对数生长早期LipL36表达 量最大,是钩体中表达最丰富的蛋白之一,但从对 数生长中期开始,LipL36表达水平显着下降.IJi— pL36是温度调节蛋白,在30cc时,钩体合成IJi— pL36;但在37qC,钩体则不表达此蛋白.值得注意 的是:LipL36在动物感染中表达下调,这可能与 钩体的慢性感染机制有关,钩体通过下调外膜蛋白 表达量逃避宿主的免疫反应,从而在宿主体内长期 存活.因此,该蛋白可能成为致病钩体适应宿主机 制的标志分子. 4.6Loa22 Loa22为含有195个氨基酸,分子量约22kDa 的外膜脂蛋白,一小部分暴露于钩体表面,其c末 端与OmpA结构域同源.有人将转座子Himad 插入Loa22基因序列中,构建Loa22缺陷的突变 体,结果发现感染突变体的动物体内没有Loa22蛋 白的表达,同时钩体引起的毒性反应较野生株弱, 若在突变体中转入Loa22基因,不仅感染动物体内 出现Loa22蛋白的表达,而且引起突变株的毒力恢 复,提示Loa22是钩体感染宿主所必须的毒力蛋 白.晚近,Zhang等J,研究表明,重组的Loa22蛋 白可引起培养的肾小管上皮细胞释放NO,MCP一1 等炎症介质,提示该蛋白可能在钩体引起的小管间 质性肾损害中起到了重要作用.Nally等,对从 宿主体内分离的钩体进行蛋白组学分析显示,不仅 该蛋白在宿主感染期间表达,而且表达量显着增 加.已知感染宿主时表达的蛋白质在钩体病的发 病机制中可能起决定作用,同时可作为宿主免疫反 应的靶蛋白.因此,对Loa22的致病作用,免疫保 护,诊断价值,有待进一步研究. 4.7LipL46l25 这是最新发现的一种外膜蛋白,由412个氨基 酸组成,分子量为46kDa,含有21个氨基酸组成的 信号肽.它可溶解于TritonX一114,表明是一种脂 蛋白.表面免疫沉淀和全钩体ELISA试验提示:IJi. plA6暴露于钩体表面,免疫组化证实急性感染钩体 的仓鼠血流中的钩体可表达LiplA6.LiplA6还存 在于受染仓鼠的肝细胞间隙及脾巨噬细胞内.该 蛋白可被感染钩体的仓鼠的血清识别,表明它在感 染期间表达.这些研究提示:LiplA6在钩体的体内 扩散过程中十分重要,可以作为一有用的血清学诊 断抗原. 4.8OmpL17[, 鲍朗等,应用抑制消减杂交技术,从赖型钩体 017株中筛选出致病钩体赖型017株特有的,而非 致病钩体缺失的差异基因片段,半巢式PCR扩增差 异基因片段相邻两侧未知序列,获得1020bp的 DNA片段,测序并经生物信息学分析,表明其包含 一 完整读码框,编码的蛋白是外膜蛋白,已登录在 GeneBank,命名为OmpL17.以其构建重组表达载 体在大肠杆菌中表达出约28kDa的蛋白,该蛋白可 以诱导豚鼠产生高滴度的特异性抗体,表明Om— pL17具有良好的免疫原性.以基因打靶技术研究 OmpL17功能,证实OmpL17是赖型钩体的一个毒 性蛋白.因为灭活该基因的突变株的致病力较野 生株有明显的减弱. 4.9钩体免疫球蛋白样蛋白 钩体免疫球蛋白样(Lig)蛋白,是暴露在表面 的外膜脂蛋白,含有一串约90个氨基酸的串连重 复序列,同源性分析表明,该重复区域与多种细菌 的Ig类似.其中LigA仅含Ig样区域,而LigB在C 末端还有一独特非重复区域.Lig基因存在于各 种致病性钩体,而非致病性钩体则没有,而且Kir— shneri钩体和问号状钩体减毒后不表达Lig蛋白和 LigmRNA,提示Lig蛋白与毒力有关.钩体免疫 球蛋白样蛋白结构域与多种细菌的黏附蛋白结构 域同源.Choy等,发现渗透压升高诱导Lig表达 时,伴有钩体黏附到胞外基质和胞浆蛋白(如胶原 I,?,层连蛋白,尤其是纤维连接蛋白和纤维蛋白 原)的能力增加,而且钩体对纤维连接蛋白的黏附 可被重组的LigA,LigB阻断,提示LigA,LigB与钩 体黏附宿主相关,可能参与了钩体病发病过程中钩 体的最初定植和体内扩散. Lig基因序列在致病钩体高度保守;哺乳动物 第34卷 4302010年第6期 黑龙江医学 HEILONGJIANGMEDICALJOURNAL Vo1.34,No.6 Jun.2010 感染钩体时,Lig蛋白表达增强;感染不同血清群钩 体的病人血清可与Lig蛋白反应;在钩体豚鼠模型 中,Lig蛋白能诱导针对同源马尼拉型和异源黄疸 出血型的保护性免疫,这些结果提示:Lig蛋白,尤 其是LigA能诱导抗各种血清型钩体的保护性免 疫].最近的研究显示:ligADNA疫苗也可产生 明显的免疫保护作用,该保护作用既有体液免疫的 参与,又有细胞免疫的介导.由此可见,用Lig 制备疫苗可能具有良好的应用前景. 5展望 2001年,我国完成了钩端螺旋体黄疸出血型赖 株的全部基因组DNA的序列分析和初步功能研 究.预测其含有4768个基因,其中已知功能的基因 不到50%,随着生物信息学的发展,将有更多基因 的功能被发现,如:宋卫等,利用生物信息学技 术预测到黄疸出血群赖型赖株有2个基因可能编 码降解蛋白质,肽链及糖肽的金属蛋白酶,这类酶 是某些病原菌,如:炭疽杆菌,艰难梭菌等的毒性因 子,提示它们可能是钩体新的致病基因.因此,不 断对未知功能基因进行注释和结构预测,可以发现 新的致病基因,有助于钩体致病机制的最终阐明, 促进现有钩体疫苗的改善和新疫苗的研制,这将是 今后钩体病研究的重要方向. 参考文献: [1]IsogaiE,IsogaiH,KubotaT,eta1.Apopto— sisoflymphocytesinmiceadministeredlipopolysac— cha6defromleptospirainterrogansJJ1.ZentralblVet— erinarmedB,1998,45(9):529—537. I2INallyJE,ChowE,FishbeinMC,eta1. Changesinlip0polysaccha—deOantigendistinguisha— cuteversuschronicleptospirainterrogansinfections [J].InfectImmun,2005,73(6):3251,3260. 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