毕业设计：牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究

毕业设计：牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究 青 岛 科 技 大 学 毕 业 设 计 (论 文) 牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究 题 目 __________________________________ __________________________________ 王传兴 指导教师__________________________ 王传兴 辅导教师__________________________ 学生姓名__________________________ 学生学号__________________________ 化工 学院 专业班 _____________________________________________应用化工技术__________________________ 2016 5 1 ______年 ___月 ___日 牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究 摘 要 牛初乳是指健康奶牛分娩后1周内所分泌的乳汁，它不仅含有 丰富的营养物质，还含 有多种免疫因子和生长因子等活性成分，具有机体免疫力、调节肠道菌群、改善胃肠道功 能、促进生长发育、增强智力、调节血糖、改善糖尿病症状等多种保健功能。牛初乳作为 功能性食品的重要原料，具有广阔的开发利用前景。从牛初乳中分离提取乳铁蛋白 , 建立 快速分离纯化乳铁蛋白的工艺. 选择弱酸性阳离子交换剂 CM2SEP HA ROSE FAST FL OW 装 柱 ,脱脂牛初乳在 4 ?下进行动态吸附上柱后进行阶跃洗脱. 通过对洗脱条件的比较 优化 ,确定了分离提取乳铁蛋白的最佳工艺条件为:牛初乳料液 p H 6 . 6 ,上柱速度 300 mL/ h ,阶跃洗脱剂的体积分数分别为 1 . 5 %和 5. 0 %的 NaCl ,洗脱体积流速 200 mL/h. 乳铁蛋白洗脱液经过超滤和冷冻干燥 ,得到冻干粉纯 度可达 98 . 98 % ,得率为 29 . 0 %. 关键词:牛初乳;乳铁蛋白 ;营养价值;保健功能;开发利用;离子交换;纯化 Bovine colostrum lactoferrin in extraction process of research ABSTRACT Bovine colostrum is the secretion of milk by healthy cows within 1 week after delivery(It is not in nutrients，but also contain a wide range of active ingredients such as immune factors and growth factors(Bovine colostrum showed various effective function such as strengthening organic immunity from disease，adjusting intestinal flora，improving tract function， stimulating physical growth，enhancing intelligence，regulating blood sugar，improving diabetes symptoms and so on(It is important raw material of functional food( To purify high purity (L F) from bovine , a fast n technique by t n exchange process. Weak a CM SEP HA ROSE FA S T FL O W was selected . At 4 ?,t he skim milk was adsorbed dynamically to t he , and t occurred in two stages . The op L F p H 6 . 6 , sample flow rate of 300 mL / h , 1 . 5 % and 5 . 0 % NaCl as t he ant respectively in t he two stages and the velocity of 200 mL / h . The purity of L F pro duct reached 98 . 98 % and t he total yield of L F was 29 . 0 %. KEY WORDS: bovine colostrum;nutritional value;health function;utilization ; bovine colostrum ; 目 录 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 1牛初乳的营养价值„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 1.1牛初乳的营养成分„„„„„„„„„„„„„„„„„3 1.2牛初乳中的免疫因子„„„„„„„„„„„„„„„„4 1.3牛初乳中的生长因子„„„„„„„„„„„„„„„„5 1.4牛初乳的生理功能„„„„„„„„„„„„„„„„„6 1.5初乳的加工特性„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 1.6产品开发及当前市场„„„„„„„„„„„„„„„„8 1.7本章小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 2乳铁蛋白的结构及开发与利用„„„„„„„„„„„„„10 2.1乳铁蛋白的结构„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 2.2乳铁蛋白的营养学作用„„„„„„„„„„„„„„„12 2.3乳铁蛋白对正常生长新生儿的作用„„„„„„„„„„13 2.4母乳可预防感染性腹泻„„„„„„„„„„„„„„„14 2.5乳铁蛋白对肠道病原体的作用„„„„„„„„„„„„15 2.6补充牛乳铁蛋白对迟发型败血症的预防作用„„„„„„16 2.7婴儿补充牛乳铁蛋白的双盲、安慰剂对照实验研究„„„17 2.8乳铁蛋白体外和体内铁结合能力的研究„„„„„„„„18 2.9乳铁蛋白治疗反复呼吸道感染患儿的疗效„„„„„„„19 2.10乳铁蛋白对牙龈卟啉菌和中间普氏菌的抑制效果„„„20 2.11本章小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„21 3乳铁蛋白的提纯工艺„„„„„„„„„„„„„„„„„22 3.1乳铁蛋白的分离提取„„„„„„„„„„„„„„23 3.2材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23 3.3结果与讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„26 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„27 附录„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„28 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 前言 现代乳品工业认为，牛初乳是健康奶牛分娩后1周内所分泌的乳汁的总称，为乳糜管分泌物和分娩前干乳期累积于乳房的血清组织(包括免疫球蛋白和其他血清蛋白质)的混合物。与常乳相比，新鲜牛初乳呈乳黄色，黏度较大，酸度较高，具有特殊的苦味和异臭 [1]味，感官指标低，口感较差，成分复杂，人不能直接食用。 免疫球蛋白是组成免疫系统的重要的蛋白质。它的功能类似于抗体，当外来物质 (抗原 )侵入身体时，身体便会产生这种蛋白质。免疫球蛋白存在于牛奶的乳清、人体血清及其它人体体液内。牛初乳含有丰富的免疫球蛋白，它们可以为新生牛犊提供足够的被动免疫 保护，抵御微生物感染。牛初乳的采集、提纯在新西兰等国家早已实现商业化，并且其产品越来越多地应用于保健食品和功能性食品中。除了免疫球蛋白，牛初乳还含有其它具有生理活性的功能性成分，如乳铁蛋白、溶解酵素、乳过氧化物酶及多种生长因子。正是这些生理活性成分，使牛初乳具备了免疫调节、防止和修复胃损伤，抵抗微生物等一系列的生物功能。 在过去的50年中，为了发现和证实牛初乳的功效，多国学者进行了大量人体和动物临床试验研究。这些研究证实了牛初乳在免疫调节，防止和修复胃损伤，抗感染，抗炎，促进表皮生长及提升运动表现等方面的功能。 初乳是母牛为了供给牛犊在新生环境下可以抵抗外来病毒及细菌而合成的，除了含有丰富的优质蛋白质、维生素和矿物质等营养成分外，还富含免疫蛋白球(主要为IgG)、生长因子等活性功能组分，能攻击侵入人体的致病原，抑制病菌繁殖，是一种能增强人体免 [2-3]疫力、促进组织生长的健康功能性食品。牛初乳神奇之处在于能增强自身免疫功能，减少对抗生素的依赖性，也不会产生任何副作用，在任何时候均可有效保护身体的健康，被科学家誉为“大自然赐给人类的真正白金食品”。大量研究证明，牛初乳是除人初乳外惟一富含生长因子和免疫因子的天然食物。 近些年来，国内外对牛初乳营养成分、功能特性方面研究较多，在牛初乳的加工技术方面有很大的飞跃，开发了多种功能性保健产品。2000年被美国食品科技协会(IEF)列为21世纪最佳发展前景的非草药类天然健康食品，有“免疫之王”、“乳黄金”之称，现已 [4]成为新一代功能性食品资源库。目前，牛初乳除了喂养幼牛外，多数制成功能性食品、功能性饲料及及化妆品，在国内外奶业迅猛发展的今天，开发牛初乳产品，尤其是开发功能性牛初乳制品的前景广阔。 一些科学家乐观地预言:在不久的将来，初乳功能性食品将“凝固人的年龄，使人年轻”。 乳铁蛋白(Laetoferin，L0是 1939年由 Sorensen等在动物乳中发现的一种功能因子【1。研究表明，乳铁蛋白在牛初乳中的含量最高，达到 1g,L，乳铁蛋白在乳清中含量为 30, 100mg,Li1。许多国家对乳铁蛋白开展了研究，如美国的Baylor医学院、Agennix公司、Genpharm公司，荷兰的 Pharming公 司、日本的 MoriageMilkZndustryCo Ltd，Snow BrandMilkProd CoLtd等都对乳铁蛋白进行了深入研究。除此以外，美国食品药品管理局(FDA)允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动、功能性食品。在日本、韩国也允许乳铁蛋白作为食 添加剂。 乳铁蛋白(Lactoferrin，以下简称LF)是铁结合糖蛋白，又称乳转铁蛋白，由Groves于1960年首次从 牛乳中分离获得，由于LF与铁结合形成红色的复合物，故也称其为“红蛋白”。乳铁蛋白存在于多种组织中，具有多种多样的生物学功能，参与构成非特异性免疫系统，具有抗细菌、真菌及病痗的特性。乳铁蛋白对肿瘤有明显的抑制作用，并且乳铁蛋白在启动宿主防御系统的初始活化反应、调控不同类型淋巴细胞比例的改变对机体免疫反应的影响、提高免疫力等方面也起到了积极作用。研究表明，乳铁蛋白对消化道肿瘤，如结肠癌、肝癌、胰腺癌，具有化学预防作用，并可抑制由此引发的肿瘤转移。乳铁蛋白( Lactoferrin, Lf) 是一种铁结合糖蛋白,广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中[1]。Lf 是一种具有多种生物学功能的蛋白质, 它能够参与铁的转运, 对肠中的铁离子具有增溶作用, 而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能[2, 3]。由于乳铁蛋白具有广泛而独特的生物学功能和理化特性 , 作为食品、医药等领域的新兴成员, 正在受到越来越多的关注。随着乳铁蛋白作用、功能、机制的不断阐明和开发应用范围的不断扩大 ,它在治疗、营养补充、食品等方面将有着广阔的应用前景 , 因此, 非常具有开发和研究价值。本文的目的旨在研究从酸牛乳清中分离、纯化乳铁蛋白的最佳条件, 并对其进行定性和定量。 近十几年来，世界各地的实验室对乳铁蛋白功能，特别是生物学功能进行了广泛研究，许多新的功能正不断被发现，许多体内、外试验证明，乳铁蛋白确实具有抗微生物、免疫调节、抗感染和抑制肿瘤生长等功能，乳铁蛋白可能具有的生物学功能见下图。 生物活性 作用机制 铁离子代谢 增加铁离子的可溶性，并通过受体介导铁离子的吸收 抗微生物功能 通过螯合铁离子抑制微生物生长，或者通过裂解细胞膜杀死细菌 抗病毒活性 阻止病毒对靶细胞的吸附 抗感染活性和免疫调节 通过结合LPS、刺激NK细胞、T细胞成熟和减少促炎细胞因子的产生和释放 抗肿瘤 阻碍癌细胞由G1向S期转化，诱导细胞凋亡 抗氧化功能 清除铁离子 目前已被证实的生物学功能可归纳为以下几方面: 一、参与铁代谢，促进铁吸收 乳铁蛋白可提高肠细胞对铁的生物利用率，并稳定还原状态的铁离子，减少铁离子对胃肠道的刺激作用。乳铁蛋白能根据机体对铁的需求，通过调节肠黏膜细胞对铁的吸收，保持体内铁的平衡状态。 1( 运载及促进铁离子吸收。在生理pH条件下形成的三价铁离子(Fe3+)不溶于水，很难被动物和其他生物体利用，乳铁蛋白通过结合Fe3+，改变其化学形式 促进机体细胞对Fe3+吸收，乳铁蛋白促进Fe3+吸收的作用，主要与其结合铁的高溶解性和肠绒毛细胞对Fe-LF中铁的特殊吸收机制有关。 2( 提高铁的生物利用率，减轻补铁负面效应。在补充铁时，结合使用乳铁蛋白可明显减缓铁离子对动物肠道的刺激作用。这是因为乳铁蛋白螯合了铁，避免了铁离子对 肠道的直接刺激作用;同时，进食乳铁蛋白可以减少无机铁离子的摄人量，从而增强铁的实际吸收量和生物利用率，有效降低铁的使用量，减少铁离子对机体造成的 不利影响。因此，乳铁蛋白可作为一种很好的补铁剂。 二、抗微生物功能 在乳铁蛋白的诸多生物学功能中，抗微生物活性最引人注目，乳铁蛋白对许多微生物，包括G+和G-需氧菌和厌氧菌及一些真菌，都具有不同程度的抑制和杀伤作用。其作用机制主要有以下几点: (1) 不饱和乳铁蛋白极强的铁结合性，通过夺去微生物生长环境中的铁离子，使细菌因失去生长所需的基本元素铁而停止生长甚至死亡，或使微生物由于缺乏铁离子而不 能形成致病性生物膜，降低细菌浓度，减少发病率。乳铁蛋白属于广谱抑菌剂，既抑制革兰氏阴性菌如大肠菌群、克雷白氏杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等，也抑制革 兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、杆菌和产单细胞李斯特菌，对引起胃炎或胃溃疡等上消化道疾病的幽门螺旋杆菌也具有抗菌作用。 (2)乳铁蛋白通过N端强阳离子结合区域与细菌表面一些特异性分子结合，破坏微生物细胞膜的正常生理功能，使细菌脂多糖渗出，增加细胞膜通透性，引起微生物死亡。 (3)乳铁蛋白通过其蛋白酶活性降解一些细菌毒力因子或黏附蛋白，降低某些微生物的致病性。 (4)除了乳铁蛋白的抑菌和杀菌作用之外，乳铁蛋白还能通过调节机体全身免疫应答，激发巨噬细胞和单核细胞吞噬功能，并抑制巨噬细胞TNF-a的分泌，发挥出抗微生物活性。 (5) 抗真菌、寄生虫及其他抗微生物作用。乳铁蛋白通过直接与细胞结合，以“致命”的方式杀死白色假丝酵母和丝状真菌，起到杀真菌作用，也确认对肠道出血性大肠 菌、耐甲氧苯毒霉素金黄色葡萄球菌MRSA以及引起消化道疾患的幽门螺旋杆菌等都有抗菌作用。另外，乳铁蛋白还有抗寄生虫活性，其分子机制更复杂。 (6) 促进双歧杆菌生长，调节肠道菌群。乳铁蛋白通过抑菌和杀菌作用，限制特定微生物 要防御系生长，间接起到筛选或调节哺乳动物肠道菌群的作用。肠道菌群是机体健康的主 统，乳酸杆菌和双歧杆菌属是肠道菌群中较为突出的有益菌。有实验证实，乳铁蛋白不仅可以抑制多种细菌和病毒，同时还可以刺激嗜酸乳杆菌和四种双歧 杆菌的生长。因此，乳铁蛋白一方面通过其抗菌作用，限制特定微生物生长，另一方面通过促进益生菌生长，具有筛选或调节新生儿肠道菌群，使之趋于正常的作 用。 三、抗病毒作用 乳铁蛋白(www.china-abid.com/rutiedanbai.php)属于非特异性免疫系统成员，具有与众不同的抗病毒活性，主要通过与病毒或宿主细胞或 者两者的表面蛋白结合，在病毒吸附和入侵过程中发挥抗病毒作用。许多研究结果表明，铁蛋白属于广谱抗病毒剂，对有包膜和无包膜的病毒均有效果。大部分研究 表明，乳铁蛋白抗病毒活性主要作用于病毒感染早期，通过不同方式干扰病毒对靶细胞的吸附和入侵(见下图)。 A乳铁蛋白直接结合病毒颗粒阻止病毒感染宿主细胞;B乳铁蛋白与乙酰型硫酸肝素蛋白聚糖(HSPGS)结合干扰病毒黏附宿主细胞;C乳铁蛋白直接结合病毒受体阻碍病毒入侵;D细胞内乳铁蛋白的抗病毒活性 乳 铁蛋白抗病毒作用的发生机制主要包括:(1)通过直接与病毒或病毒粒子结合，抑制病毒吸附和入侵靶细胞。(2)乳铁蛋白与靶细胞表面的病毒受体结合，阻断 病毒和靶细胞结合，阻止病毒对宿主细胞的感染。(3)乳铁蛋白通过抑制部分病毒，如轮状病毒和脊髓灰质炎病毒感染细胞后的病毒复制，发挥抗病毒作用。 (4)通过调节病毒等病原体引起的炎症反应和上调机体免疫系统，通过增强自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK cell)的细胞毒作用提高机体抗病毒反应，间接达到抗病毒目的。 近年来，乳铁蛋白的抗病毒作用日益受到人们的关注和重视，众多研究表明，乳铁蛋白具有广谱的抗病毒功能，主要包括以下类型病毒: (1)丙型肝炎病毒。丙型肝炎病毒(HCV)是一种有包膜的单链RNA病毒，它可以引起慢性肝炎、进行性肝硬化，甚至肝癌。目前除干扰素外，尚无HCV疫 苗和抗HCV药物，而干扰素对慢性HCV患者的有效率只有30,左右，且有严重的副作用。据文献报道，乳铁蛋白在一定程度上具有抗HCV(丙型肝炎病毒) 和HBV(乙型肝炎病毒)作用。人或牛乳铁蛋白也能抑制HBV感染，临床试验证明乳铁蛋白能有效地治疗慢性乙肝。 (2)人免疫缺陷病毒(艾滋病毒)。人免疫缺陷病毒(HIV)属于慢病毒科，是一种有包膜的逆转录病毒， HIV感染可引发人类艾滋病(AIDS)。HIV临床试验证明，人乳铁蛋白具有体内防御HIV传递的功能，据Viani等发现，人和牛乳铁蛋白都具有抑制 HIV体外复制的功能，乳铁蛋白还可能通过抑制羟自由基的形成，发挥抗HIV感染作用。 (3)疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)分为1型和2型，属于DNA病毒，是疱疹病毒科成员。HSV-1和HSV-2在免疫功能低下的病人中，如艾滋病 人、器官移植病人和未成年婴、幼儿中可能会产生严重问题，甚至危及生命。乳铁蛋白抗HSV作用主要通过与宿主细胞和病毒颗粒结合，抑制病毒对靶细胞的吸 附。 (4)轮转病毒。轮转病毒轮状病毒是引起世界婴幼儿非细菌性肠炎的最主要原因，每年导致约1亿儿童的死亡，研究表明，乳铁蛋白具有体外抑制轮状病毒的作用。 (5)脊髓灰质炎病毒。脊髓灰质炎病毒是一种肠道病毒，主要引发小儿麻痹症。Marchetti等证明乳铁蛋白具有体外抗脊髓灰质炎病毒活性。 (6)其他病毒。乳铁蛋白对其他许多病毒，包括腺病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞病毒(RSV)及披膜病毒科的阿尔法病毒和一些动物病毒(如鼠类FVC病毒)均有不同程度的作用。 综上所述，乳铁蛋白抗病毒活性的主要作用特点有:?乳铁蛋白主要作用于感染早期或是病毒黏附阶段，通过干扰病毒与细胞接触，阻止病毒感染细胞;?天然完整 的、折叠正确的乳铁蛋白具有较好的抑制病毒作用;?乳铁蛋白的抗病毒作用与其结合铁等金属离子的能力无关;?病毒抑制作用随乳铁蛋白浓度的增加而增强;? 乳铁蛋白具有广谱的抗病毒特性，对各种病毒均有不同程度的抑制效果。 四、免疫调节和抗感染 研究表明，乳铁蛋白属 于人体先天性非特异性免疫系统成分，在分泌液和上皮细胞表面，通过抑制微生物繁殖、吸附或(和)杀死微生物发挥抗微生物作用，参与机体抗炎症过程。乳铁蛋 白由乳腺细胞、中性粒细胞产生后进人组织中，参与血液凝固调节、NK细胞激活、白细胞介素及肿瘤坏死因子产生等过程，发挥其免疫调节和抗炎症作用。 1、免疫调节 研 究表明，乳铁蛋白具有调节先天免疫的能力，被认为是哺乳动物先天性免疫系统的一部分，构成了机体对外来病原菌的最初快速免疫防御系统。体外模拟试验表明， 乳铁蛋白具有促进抗体生成、T细胞成熟、淋巴细胞增殖、活化自然杀伤细胞及抑制混合淋巴细胞释放IL-1、IL-2和TNF-α等多种免疫调节功能。 Dhennin- Duthille等的研究结果表明，乳铁蛋白通过提高调控免疫细胞增殖与分化的关 键酶------促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性，上调CD4抗原 表达，促使胸腺细胞(T细胞前体)成熟为辅助T细胞，刺激初次体液免疫应答。研究发现，脱铁乳铁蛋白由于能够克服“游离”铁离子对淋巴细胞增殖的抑制作 用，因而可促进淋巴细胞增殖。 体内一些研究表明，乳铁蛋白能防止皮肤和肺部变态反应的发生。乳铁蛋白可作为蛋白信号分子参与免疫细胞的发育过程， 通过促进抗体生成、T细胞成熟、淋巴细胞增殖、活化NK细胞、抑制混合淋巴球的IL-1，IL-2以及肿瘤坏死因子(TNF)的释放等，参与机体免疫调节 过程。另外，乳铁蛋白可与特定的DNA序列结合，促进细胞分泌免疫球蛋白或细胞因子，达到提高机体免疫力的作用。 2、抗感染及作用机制 蛋白可通过N1结构域的氨基酸残基与病原体或宿主细胞表面的糖蛋白成分(如脂多乳铁 糖、黏多糖、肝素等)和乳铁蛋白受体结合，发挥抗微生物活性和免疫调节作用，参与抗炎症反应。其抗感染作用主要与免疫调节和铁离子结合有关。 五、抗肿瘤 虽然铁饱和乳铁蛋白能促进正常细胞增殖，但对癌细胞却是起阻止而非刺激作用。一些研究结果表明，乳铁蛋白具有阻碍体外培养的癌细胞由G1向S期转化，达到抑 制肿瘤细胞增殖的作用，主要是因为乳铁蛋白能诱导改变细胞周期中一些重要调节蛋白的表达水平或活性，其他一些体内研究认为，乳铁蛋白抗肿瘤作用也可能通过 激活肿瘤细胞中FAS信号途径，或利用一些乳铁蛋白异构体所具有的DNA酶、RNA酶及ATP酶活性等，产生细胞毒性和诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡。乳铁蛋 白及其降解产物不仅能减少实体肿瘤的生长，而且具有抑制肿瘤细胞转移的作用。乳铁蛋白的这种作用是由于乳铁蛋白能强烈抑制体内血管内皮因子和肿瘤介导的血 管生成，从而抑制由此引发的肿瘤转移。因此，乳铁蛋白可通过多种途径发挥抗肿瘤作用，达到预防和治疗肿瘤的目的。 六、抗氧化作用 正 常情况下，细胞内抗氧化防御系统使自由基的产生和清除保持一种动态平衡状态，不会引起机体组织细胞的损伤。但在某些特定条件下，自由基异常增多或机体组织 抗氧化能力下降，造成机体内氧自由基过剩，引发脂质过氧化反应，导致DNA损伤、癌发生及形成与老年病有关的羰基化合物，促进多种疾病发生和机体老化。正 常情况下，铁离子处于被大分子包围的稳定封闭状态中，一旦逃出这种封闭状态的铁离子与巯基结合后，具有很强的催化作用，产生活性很强的羟自由基和其他氧化 剂，启动脂质过氧化链式反应引发脂质过氧化链式反应，导致疾病的发生和发展。近年来，国外许多流行病学调查结果认为，机体铁储存水平升高是导致动脉粥样硬 化、冠心病的一种重要危险因子。乳铁蛋白主要通过螯合Fe3+，阻断氧自由基生成，抑制由铁引起的脂质氧化反应和其后的组织损伤，发挥抗氧 化作用。另外， 乳铁蛋白具有的核糖核酸酶活性，能通过降解酵母tRNA抑制超氧离子形成，从而降低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏，达到预防和治疗动脉粥样硬化 和冠心病的目的。 七、作为细胞生长因子 随着乳铁蛋白对成骨细胞作用的研究，人们发现乳铁蛋白在生理浓度下不仅能促进原始成骨细胞增殖和分化，同时还能减少成骨细胞的细胞凋亡，并具有抑制破骨细胞增殖的作用，促进成骨细胞幸存机会。 八、其他生理功能 1、抑制胆固醇的积累，参与脂质代谢:乳铁蛋白通过增加高密度脂蛋白(HDL)和减少低密度脂蛋白(LDL)浓度，降低肝脏和血液中胆固醇和三酰甘油，参与机体脂质代谢。 2、调节基因转录:乳铁蛋白与一些细胞表面受体，如核仁素结合后，经细胞胞吞作用进入胞内并传送至细胞核，然后结合在特定的DNA、RNA序列上，调节这些基因的转录过程。 3、抗血栓作用:血小板膜上表达有乳铁蛋白受体，能阻止腺苷二磷酸(ADP)处理后的血小板聚集;乳铁蛋白能阻止纤维蛋白原与ADP激活的血小板结合;乳铁蛋白能阻止血小板聚集、血栓形成、五羟色胺的释放和α-颗粒膜蛋白的表达。 4、镇痛作用:自然条件下，外源性乳铁蛋白通常来源于哺乳动物乳汁，不易产生耐受性，且乳铁蛋白本身具有显著的抗伤害作用，因此，提示乳铁蛋白有可能成为一种治疗疼痛的天然药物。 近几年，我国有条件的生产企业利用初乳加工干粉制品作为保健食品，而偏僻的奶牛场，其初乳大部分被丢弃掉，造成很大的浪费。若按每头奶牛产初乳 10 kg计算 (IJf质 量浓度为 1g门L)，我国约有乳牛 220万头 ，乳铁蛋白的含量一般为 1 g,L，若按 70,的提取率计算，仅此一项乳铁蛋白的产量可达 l5(4t。我 国婴儿乳粉生产量居世界第一，乳铁蛋白是婴)L-~L粉的重要添加剂，其需求量极大，但是乳铁蛋白的供应全部依赖进口，95,纯度的乳铁蛋白每公斤价值 1000$p1。因此，解决乳铁蛋白的生产关键技术是当前重要的课题。 第一章 牛初乳的营养价值 [5]1.1牛初乳的营养成分 牛初乳比一般牛乳具有高蛋白，高钙质的营养特征。牛初乳含有的主要矿物质元素为Mg、K、Na、Cl、Zn和Mn等，维生素类物质有维生素A、D、C、E、B、B、B等。 12121.1 蛋白质不但含量丰富，而且为优质蛋白 蛋白质主要为乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白、酪蛋白，还有酶。并具有人体所需的9种必需氨基酸 (EAA)，而且比例接近人体的需要。 1.2 脂肪中多不饱和脂肪酸的含量高 牛初乳的乳脂肪中，水溶性、挥发性脂肪酸比例特别高，这不仅使乳脂风味良好，也容易消化。牛初乳磷脂中，多不饱和脂肪酸含量高，且人类膳食中需要的共轭亚油酸含量较高，大部分是顺、反-9，11-十八碳二烯酸，即生理性最强的异构体，有明显的抗癌作用。丁酸占牛初乳脂肪酸的10%(摩尔分数)，也有一定的抗癌作用，利于某些肠道疾病和贫血 [4]症的治疗。 1.3 碳水化合物，主要是低聚糖。 牛初乳中不含蔗糖，除乳糖(能够加强钙质被动扩散过程，增加钙质的生物利用率)以外，还含有较多的不易被人体肠道消化酶降解，却能促进肠道双歧杆菌增殖的低聚糖。 1.4 微量元素 含有丰富的人体所必需但又易于缺乏的钙、锌、硒，其他人体必需的常量与微量元素 (Na、Mg、Cu、Mn、Mo、Cr等)也高于常乳。 1.2 牛初乳中的免疫因子 2.1免疫球蛋白 免疫球蛋白是指具有抗体活性，能与相应的抗原发生特异性结合反应的球蛋白，是牛初乳中最重要的免疫因子。牛初乳中含有高浓度的IgG、IgA、IgM、IgE和sIgA，其中IgG占86,，是牛初乳中含量最高的免疫球蛋白，它能部分取代人类母乳IgA的功能。牛初乳中IgG的含量(50,150 g,L)是人初乳的50倍，是牛常乳的50,150倍，对病毒、细菌及真菌感染具有强大的防治作用。IgM是相对分子质量最大的免疫球蛋白，在补体和吞噬细胞参与下，其杀菌、溶菌、激活补体和促吞噬等作用均显著强于IgG，主要分布在血液中，对防止菌血症起重要作用，牛初乳IgM的含量为常乳的50,101倍，与人具有抗原同源性。IgA是黏膜局部抗感染的重要免疫物质。IgE具有被动皮肤过敏抗原的活性，无抗病 [6]毒和抗菌的活性，对机体抗过敏反应和抗寄生虫感染有特殊意义。 2.1乳球蛋白 牛初乳中的生物活性蛋白包括乳铁蛋白、β,乳球蛋白、α,乳白蛋白、补体(C3、C4)、淋巴因子等。乳铁蛋白是一种天然的铁结合蛋白，牛初乳中乳铁蛋白的含量约为1(5,5(0 g,L，为常乳的20倍左右。乳铁蛋白是人乳中一种主要的乳清蛋白，向婴儿食品中添加从牛乳或乳清中分离纯化获得的乳铁蛋白功能性基料，是使之“母乳化的一个重要方面。乳铁蛋白具有许多独特的生物学功能，如增强铁的传递和吸收、广谱抗菌性、免疫作用、抗氧化作用、促进肠道菌群平衡、作为生长因子、抗炎症、抗病毒、抗癌症等。β,乳球蛋白是由乳腺上皮细胞合成的乳特有蛋白，是反刍动物和牛等乳中的主要乳清蛋白成分。β,乳球蛋白经蛋白酶酶解后产生的一些活性短肽，以及β,乳球蛋白与其他物质形成的复合物及反应产物，都有着相当重要的生物活性。研究证明，β,乳球蛋白与羟基邻苯二甲酸酐的复合物在一定程度上能干扰HIV、HSV,1HSV,2对人体的感染;β,乳球蛋白与一些糖类物质的反应产物具有较强的清除自由基、抗氧化的活性。β,乳球蛋白良好的凝胶性能及其对脂溶性维生素的绑定能力，对黑色素产生的抑制作用与提高细胞膜抗氧化性的能力，以及与其他物质结合所形成的复合物的特有生物功能，使得其在保健食品及 [7]医药等相关领域有着巨大的应用前景。 2.3 酶类 包括溶菌酶、乳过氧化物酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、C,谷氨酰转肽酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳酸脱氢酶、血凝乳酶等。乳过氧化物酶是存在于乳汁中的血红素蛋白，牛乳中的乳过氧化物酶活力远远高于人乳(相差约20倍)，而牛初乳(11,45 mg,L)又高于常乳(13,30 mg,L)。溶菌酶是一种能够降解细菌细胞壁中肽聚糖而造成菌体溶解的糖苷酶，是一种非特异性免疫因子。牛初乳中溶菌酶的含量高于0.15 mg,L，为常乳的2倍 牛初乳还含有黄嘌呤氧化酶、富含脯氨酸的多肽及多种免疫细胞，是各种免疫因子的集大成者。富含脯氨酸的多肽能支持和调节胸腺(免疫系统控制中心)，能抑制过分活跃的或激活不活跃的免疫系统。 2.4 其他 牛初乳还含有各种具有抗细菌、病毒、酵母和原生动物活性的特异性抗体，以及包括配糖体(如糖肽、低聚糖或氨基酸糖等)在内的非抗体性免疫化合物。 1.3 牛初乳中的生长因子 牛初乳中的生长因子主要包括胰岛素样生长因子(IGF?和IGF?)、神经营养生长因子(NGF)表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGFα和TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGF)、促性腺激素释放激素(GnRH)及其缔合肽(GAP)、生长激素(GH)等。牛初乳中的各种生 [8]长因子具有促进组织正常生长和加快伤口愈合的功效。 1.4 牛初乳的生理功能 4. 1 改善胃肠道功能 牛初乳通过调节肠道微生物菌群，促进有益菌群的繁殖，调整肠道微环境，促进消化吸收，对人体胃肠道机能乃至整体机能起到全方位的调理作用。初乳中的免疫因子能高效抵抗病毒、细菌、真菌及其他过敏原，中和毒素。在抑制多种病原微生物生长的同时，不影响肠道内非病原性微生物的生长和繁殖。它能够改善肠胃机能，对肠胃炎、胃溃疡患者有显著疗效。Jeong和Playford等分别用不同的方法研究了牛初乳对非甾类抗炎性药物(NSAID)所引起的小鼠胃肠道损伤的保护作用，发现牛初乳可以减轻NSAID所引起的胃、 [9]小肠的黏膜损伤。许多研究表明，初乳中的多肽对胃肠道的功能改善有很大作用。Playford等发现，牛初乳不仅能预防和治疗由非甾体抗炎药物导致的胃肠道损伤，同时还 [10]可以效治疗其他肠道溃疡疾病。牛初乳IgG可以侵入肠道或肠道固有的一些病原微生物，以此消彼长的方式维持肠道菌群平衡，从而预防肠道致病菌引起的炎症反应。Palmeira等研究了初乳和常乳对肠道致病性大肠杆菌与抗核抗体细胞相结合的抑制作用，发现抑制作用不仅与初乳中大分子量部分(如IgG)相关，低聚糖也起了重要作用，同时低聚糖还能 [11]抑制细菌在肠黏膜的黏合和入侵。 牛初乳中的IGF?、IGF?、NGF、EGF、TGFα、TGFβ、FGF、GnRH及其缔合肽、GH等，能促进组织正常生长，加快伤口愈合。Yoon等研究了牛初乳及葡聚糖对角化细胞和人体皮肤培养的细胞素的影响，结果采用牛初乳组分处理过的皮肤活组织中的TNFα、IL,10和 [12]IL,6抗体有所增加，表明牛初乳对人体皮肤提高防御能力有积极作用。 4. 2 提高机体免疫力和增强抗病能力 牛初乳富含多种免疫因子，可为机体提供很好的被动免疫保护，能够提高免疫力低下者及体弱多病者的机体免疫力。徐丽等用牛初乳粉对小鼠进行喂养实验，研究了不同剂量的牛初乳粉对小鼠免疫的调节作用，结果表明牛初乳粉能极显著地增强巨噬细胞的吞噬功 [13]能、NK细胞的杀伤活性和T淋巴细胞的增殖活性。王建平等按国家卫生部颁布的《保健食品功能学评价程序和检测方法》(1997)进行二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠DTH(耳肿胀法)试验、血清溶血素测定、半数溶血值测定、小鼠碳粒廓清试验,结果表明牛初乳具有免 [14]疫调节作用。李莉等研究了牛初乳对放、化疗的肿瘤病人的免疫调节作用，发现服用牛初乳粉胶囊后试验组的NK细胞和CD3，细胞活性显著增高，试验组与对照组IgA差异显著， [15]说明肿瘤放、化疗病人服用牛初乳粉胶囊可改善免疫功能，有利于治疗和康复。牛初乳作为食品，含有丰富的免疫球蛋白，除直接与肠道病原菌发生免疫反应外，这些异种抗体摄入后若未完全降解，可成为抗原刺激肠黏膜释放抗体物质，这种因口服抗原所导致的特 异性超敏状态也是牛初乳的免疫调节机制之一。 4.3 促进细胞正常生长、组织修复和外伤愈合 牛初乳中的各种生长因子的协同作用可促进细胞正常生长、组织修复和外伤愈合等。姚文等人研究了牛初乳制剂对成骨细胞增殖及胎鼠骨骼发育的影响。结果发现，牛初乳制剂能显著促进胎鼠骨骼生长发育，比单纯补钙效果好。IGF-1可有效促进处于分化期细胞的增殖，而对于成熟细胞则有促生长作用。Baumrucker C R等人报道，用含有IGF - 1 (750μg/L)的配方乳饲喂初生犊牛，可使犊牛小肠组织中的DNA合成率提高2倍，特别是回肠段更明显。转化生长因子-β(TGF-β)可明显提高马骨髓基质细胞的增殖速度，能促进间质细胞增生，加速伤口愈合和组织修复。鲁道海等人在研究TGF-β对体外培养的破骨细胞功 [16]能影响的试验中证明，TGF-β在骨骼修复的过程中起着重要的作用。 4.4 提高机体的抗氧化能力和延缓衰老 牛初乳能够提高老年人体内血清总SOD和Mn-SOD的活力，降低脂质过氧化物的含量，可延缓人的衰老。周之辉等人对100例60岁以上的老人进行了服用牛初乳制剂的试验。结果发现，牛初乳能提高老人体内血清总SOD和Mn-SOD的活力，降低脂质过氧化物含量。牛初乳中还含有多种功能性蛋白质、酶、生长因子、微量元素等，能明显改善糖尿病症状和降低血糖。IGF -1可通过降低生长激素水平、升高胰岛素受体水平等途径增加脏器、组织对胰岛素的敏感性;促进物质代谢，使人体内的葡萄糖氧化和转化为脂肪;同时IGF -1 [16]对于糖尿病表现出的神经传导速度变慢、动作电位降低等神经病变有明显的改善作用。 1.5 初乳的加工特性 由于牛初乳化学组成特殊，其物化性质与常乳差异较大。牛初乳添加到常乳中对加工特性有影响。牛乳表面张力影响到起泡性、乳浊状态、微生物生长特性、热处理、均质工 [17]艺设计以及风味等。 初乳一般呈淡黄色，粘稠而有特殊腥味。经加热处理或调味后易被接受。牛初乳及其活性组份在加工中，可能经热、酸碱和高压处理，接触包括酶、微生物在内的组份，从而改变功能性质。 5.1 热处理 加热是多数食品制造的必需工序。E.Li-Chan等确认，在普通消毒牛乳、乳粉和乳清 [18]中均保留了相当数量的IgG抗体完整分子。故牛初乳免疫功能食品制造应注意受热强度。 5.2 超高压处理 在200MPa处理20min， IgG活性不发生变化。随压力升高， 400MPa时IgG开始变性， [19]至700MPa时，无蔗糖存在则IgG完全变性。蔗糖可以增加IgG对高压处理的稳定性。 1.6 产品开发及当前市场 研究加工牛初乳制品的关键在于:保证牛初乳中活性成分的作用，保证牛初乳中免疫球蛋白、生物活性因子、酶及其他功能性成分的稳定性，创造这些功能活性成分对胃、肠环 [20]境的抵抗能力。 当前，科学家更关注牛初乳保健功能方面的研究，利用现代的生物、分离纯化等技术分离牛初乳中的功能成分，是目前研究牛初乳中功能成分的主要方法。 牛初乳中各项功能性组分的快速检测法在加工中是一个研究的热点。我国对牛初乳IgG和乳铁蛋白的检测也取得了很大的进展:采用琼脂双向免疫扩散法和化学发光自显影法等方法测定牛初乳的IgG;采用酶连免疫等方法测乳铁蛋白含量。另外，超滤、膜分离、 [21]微胶囊、冷冻干燥等高新技术在我国牛初乳的研究方面也有应用。 初乳色黄，有苦味和异臭味，其黏度、酸度和相对密度均比常牛乳高，含有大量的免疫物质，乳球蛋白、乳白蛋白的含量也比常牛乳高，因此热稳定性较差，加热时易发生沉 [22]淀，同时散发出臭鸡蛋样的气味。试验证明，在常压下温度达到60~65?，初乳就会结块，而且有异臭味，免疫因子和生长因子也失去活性。因此对于牛初乳加工一定要在低温条件下进行，这样才可以使牛初乳中的免疫因子得以保全，它的免疫功效才可以发挥出来。 [22]因此加工工艺难度较大，对设备要求高，这也是多年来影响牛初乳开发的重要因素。 对于牛初乳的研究及食用可以追溯到几千年前。印度几千年前就有食用牛初乳的文献记载，人类采用科学的方法研究牛初乳至少已有200多年的历史。牛初乳及其功能成分的商品开发至少可以追溯到1958年，当时芬兰Immuno.Inc与其他公司合作研究牛初乳及其组分的生理功能、用量及安全性。1996年Bernard Jensen博士在《初乳:人类的最佳食品》一书描述了牛初乳具有抗病毒的功能。20世纪90年代，牛初乳的基础理论研究基本成熟。自20世纪90年代开始，我国开始从事牛初乳加工技术的研究和产品的开发。1989年颜贻谦最先报道了牛初乳提取物“乳珍”的研究成果，随后牛初乳制品相继问世。目前，我国的牛初乳产品主要侧重免疫保健食品方面，主要有牛初乳纯粉、胶囊、片剂和初乳奶 [23]粉等产品类型。婴幼儿配方奶粉中添加牛初乳粉(尤其是完达山牌乳珍)十分普遍。根据特殊人群，市场上也有牛初乳复合营养品销售。2002年我国市场开始出售肠溶胶囊型初乳粉产品，液态的初乳制品中来福乳和高IgG的初乳较流行。2003年冬天，伊利集团推出 [24]了伊利—奥力星牛初乳。曹劲松等人(2002年)研究出具有IgG活性的酸奶。乳铁蛋白( Lactoferrin, Lf) 是一种铁结合糖蛋白,广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中[1]。Lf 是一种具有多种生物学功能的蛋白质, 它能够参与铁的转运, 对肠中的铁离子具有增溶作用, 而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能[2, 3]。由于乳铁蛋白具有广泛而独特的生物学功能和理化特性 , 作为食品、医药等领域的新兴成员, 正在受到越来越多的关注。随着乳铁蛋白作用、功能、机制的不断阐明和开发应 用范围的不断扩大 ,它在治疗、营养补充、食品等方面将有着广阔的应用前景 , 因此, 非常具有开发和研究价值。本文的目的旨在研究从酸牛乳清中分离、纯化乳铁蛋白的最佳条件, 并对其进行定性和定量分析。 乳铁蛋白(Lactoferrin，以下简称LF)是铁结合糖蛋白，又称乳转铁蛋白，由Groves于1960年首次从 牛乳中分离获得，由于LF与铁结合形成红色的复合物，故也称其为“红蛋白”。乳铁蛋白存在于多种组织中，具有多种多样的生物学功能，参与构成非特异性免疫系统，具有抗细菌、真菌及病痗的特性。乳铁蛋白对肿瘤有明显的抑制作用，并且乳铁蛋白在启动宿主防御系统的初始活化反应、调控不同类型淋巴细胞比例的改变对机体免疫反应的影响、提高免疫力等方面也起到了积极作用。研究表明，乳铁蛋白对消化道肿瘤，如结肠癌、肝癌、胰腺癌，具有化学预防作用，并可抑制由此引发的肿瘤转移。 1.7 本章小结 免疫球蛋白是指具有抗体活性，能与相应的抗原发生特异性结合反应的球蛋白，是牛初乳中最重要的免疫因子。牛初乳中含有高浓度的IgG、IgA、IgM、IgE和sIgA，其中IgG占86,，是牛初乳中含量最高的免疫球蛋白，它能部分取代人类母乳IgA的功能。牛初乳中IgG的含量(50,150 g,L)是人初乳的50倍，是牛常乳的50,150倍，对病毒、细菌及真菌感染具有强大的防治作用。IgM是相对分子质量最大的免疫球蛋白，在补体和吞噬细胞参与下，其杀菌、溶菌、激活补体和促吞噬等作用均显著强于IgG，主要分布在血液中，对防止菌血症起重要作用，牛初乳IgM的含量为常乳的50,101倍，与人具有抗原同源性。IgA是黏膜局部抗感染的重要免疫物质。IgE具有被动皮肤过敏抗原的活性，无抗病 [6]毒和抗菌的活性，对机体抗过敏反应和抗寄生虫感染有特殊意义。 牛初乳中各项功能性组分的快速检测法在加工中是一个研究的热点。我国对牛初乳IgG和乳铁蛋白的检测也取得了很大的进展:采用琼脂双向免疫扩散法和化学发光自显影法等方法测定牛初乳的IgG;采用酶连免疫等方法测乳铁蛋白含量。另外，超滤、膜分离、 [21]微胶囊、冷冻干燥等高新技术在我国牛初乳的研究方面也有应用。 初乳色黄，有苦味和异臭味，其黏度、酸度和相对密度均比常牛乳高，含有大量的免疫物质，乳球蛋白、乳白蛋白的含量也比常牛乳高，因此热稳定性较差，加热时易发生沉 [22]淀，同时散发出臭鸡蛋样的气味。试验证明，在常压下温度达到60~65?，初乳就会结块，而且有异臭味，免疫因子和生长因子也失去活性。因此对于牛初乳加工一定要在低温条件下进行，这样才可以使牛初乳中的免疫因子得以保全，它的免疫功效才可以发挥出来。 [22]因此加工工艺难度较大，对设备要求高，这也是多年来影响牛初乳开发的重要因素。 牛初乳能够提高老年人体内血清总SOD和Mn-SOD的活力，降低脂质过氧化物的含量，可延 缓人的衰老。周之辉等人对100例60岁以上的老人进行了服用牛初乳制剂的试验。结果发现，牛初乳能提高老人体内血清总SOD和Mn-SOD的活力，降低脂质过氧化物含量。牛初乳中还含有多种功能性蛋白质、酶、生长因子、微量元素等，能明显改善糖尿病症状和降低血糖。IGF -1可通过降低生长激素水平、升高胰岛素受体水平等途径增加脏器、组织对胰岛素的敏感性;促进物质代谢，使人体内的葡萄糖氧化和转化为脂肪;同时IGF -1对于糖 [16]尿病表现出的神经传导速度变慢、动作电位降低等神经病变有明显的改善作用。 第二章乳铁蛋白的开发与利用 2.1乳铁蛋白的结构乳铁蛋白的结构、功能和应用(墨西哥奇瓦瓦大学化工科学院) 乳铁蛋白(LF)是一种分子量为80 kDa的铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族的一员，存在于多种体液组织中，也是哺乳动物体内免疫系统的重要组成部分。乳铁蛋白对机体的预防作用表现在多个方面，首先是直接抑制多种微生物活性，如细菌、病毒、真菌以及寄生虫等;还包括抗炎症以及防癌等功效。乳铁蛋白这些生理活性功能的发挥不仅仅是因为其具有结合铁的能力，也在于他能影响宿主或病菌体内某些重要化学成分的分子机制。本文综述了乳铁蛋白的抑菌机理、临床应用以及外源表达情况。 2.2乳铁蛋白的营养学作用(美国加利福尼亚大学营养学系) Lönnerdal, Bo 一直以来，膳食中乳铁蛋白的来源主要是母乳中的人乳铁蛋白。目前，通过现代技术从牛奶中分离的牛乳铁蛋白，以及利用基因工程技术获得的重组人乳铁蛋白都已经商业化，且可以作为保健成分添加到食品和临床产品中。本文主要阐述了膳食乳铁蛋白的生理功能。研究发现通过膳食摄入的乳铁蛋白在人体肠道中具有抗菌、抗病毒的功能，这些功能的实现一方面通过乳铁蛋白直接作用于病原菌，另一方面可能通过影响肠道粘膜的免疫功能而实现。通过受体结合被摄入细胞的乳铁蛋白主要通过影响肠道粘膜的免疫功能方式发挥作用，它也能影响细胞内的基因转录。乳铁蛋白一直都被认为能改善婴儿和孕妇的铁缺乏状况，这有可能是通过受体调节的方式实现。此外乳铁蛋白也可以促进肠细胞的增殖和分化，使肠粘膜组织变大从而加强营养的吸收能力。 2.3乳铁蛋白对正常生长新生儿的作用 Artym J, Zimecki M. 初乳及乳汁中，除了含有各种营养成分外，还含有对婴儿生长发育至关重要的各种蛋白质。乳铁蛋白属于铁结合蛋白质家族中的一员，有广泛的抗菌及亲免疫特性。与乳汁当中的其他蛋白质(比如，酪蛋白)相比，乳铁蛋白(LF)能够有效抵抗在消化道内的降解。 另外，乳铁蛋白衍生肽还具有很强的抗病毒活性。LF通过结合定位于肠道刷状缘细胞的特异性受体而吸收。口服LF不仅可以刺激局部免疫反应，还可以刺激全身免疫反应。LF在营养素的吸收方面也起着重要作用，它能运载金属离子如铁、锰、锌，并促进糖的吸收。LF还可以刺激肠道内皮细胞的增殖以及肠相关淋巴滤泡的生长，因此，LF可以有效应用于早产儿及肠粘膜损伤病人。LF能够维持正常肠道菌群，从而抑制病原菌的生长，促进非致病性乳酸杆菌及双歧杆菌的增殖。人工喂养新生儿易发展有害微生物(肠球菌、肠杆菌属、类杆菌属、埃希氏菌属)。非致病微生物可以确保肠道低PH值，合成一些维生素，增加NK细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的活性，促进保护性免疫蛋白的生成，降低变态反应的风险。大量小鼠实验研究表明，LF是菌血症和内毒素血症的保护因子，这种蛋白质能够刺激网状内皮系统细胞的活性，刺激骨髓组织生成，从而增强对细菌的杀伤和清除作用。对内毒素血症实验模型的研究表明，LF能抑制前炎症细胞因子(一氧化氮和活性氧)的活性。LF能够促进未成熟T、B细胞的分化，增加NK和LAK细胞的活性。LF还能抑制活性氧自由基的毒害作用，这种特性对于含矿物质铁的改良奶粉等婴幼儿食品至关重要，因为这些婴幼儿食品可能是有害自由基的一种来源。总的来说，天然母乳对新生儿而言是最有价值的食物，在人工喂养婴幼儿的食品中添加LF对于提高此类食物的保护性及免疫性是非常重要的。非常明显，牛奶是一种不适合新生儿的食品。牛奶中含有比母乳低50倍的LF，极少量的溶解酵素，更低含量的其他乳清蛋白及相关免疫球蛋白。因此，市面上婴幼儿食品(美国、日本)都添加了LF。 2.4母乳可预防感染性腹泻(辛辛提那儿童医院医疗中心儿科流行病学与生物统计中心，辛辛提那大学医学院) 母乳喂养是预防因婴幼儿腹泻导致的发病率和致死率的重要手段。调查表明，干预过的卫生系统和社区的母乳喂养率大大增加，使腹泻的发生率降低，从而减少了婴儿的保健费用支出。母乳之所以具有预防腹泻的效果是由于其中存在许多具有抗感染、抗发炎作用及免疫调节作用的生物活性物质，如抗体、低聚糖、复合糖、乳铁蛋白、白细胞、细胞因子等。美国儿科研究院推荐纯母乳喂养应当持续到小儿6个月，然后开始添加辅食，同时继续母乳喂养一直到孩子1岁，如果有条件的话建议再延长母乳喂养的时间。如果这一建议能被广泛执行，那么每年全球孩子因腹泻死亡的数量将减少超过100万。 2.5乳铁蛋白对肠道病原体的作用(卡耶塔诺秘鲁大学热带医学研究所;美国德克萨斯大学公共卫生学院传染病研究中心) 近年来很多研究都致力于解析母乳喂养促进孩子健康和提高婴儿存活率的机制，但是如何使这些研究结果改善和提高儿科护理的现状依然进展不大。研究表明，在母乳喂养中起到保护作用的活性因子可降低因断奶而导致的腹泻或者对生长发育带来的负面效应。乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，存在于母乳中，具有多种生理功能如抗菌、抗炎以及提高免疫力等，其中防治肠胃炎是乳铁蛋白最重要的功能之一。许多体外试验和动物实验都表明乳铁蛋白对肠内微生物感染，如轮状病毒、贾弟虫、志贺氏菌、沙门氏菌和致泄性大肠杆菌感染，都具有预防作用。乳铁蛋白对肠道病原菌的抑制作用主要通过两种途径来实现:抑制细菌的生长;破坏细菌表面的毒力因子功能从而减弱病毒粘附或者侵入哺乳动物细胞的能力。因此，乳铁蛋白对婴儿的保护作用可能是通过阻止肠道病原菌在肠道内壁的吸附而实现的。最近的几项儿童临床实验得到了类似的结果。但是关于乳铁蛋白是否能广泛预防婴幼儿腹泻尚待进一步研究。 2.6补充牛乳铁蛋白对极低出生体重儿迟发型败血症的预防作用(意大利儿科协会;美国安娜医院，新生儿科及新生儿重症监护室) 败血症是早产新生儿的一种常见的、严重的并发症，特别是针对那些极低出生体重儿(VLBW<1500g)。乳铁蛋白——哺乳动物乳汁中的一种糖蛋白——是否能够减少败血症的发生率尚不清楚。动物模型研究显示，鼠李糖乳杆菌(LGG)能提高乳铁蛋白的活性，但还没有对人类婴儿的相关研究。本次实验目的:确定单用牛乳铁蛋白或乳铁蛋白与LGG合用对极低出生体重儿迟发型败血症发生率的影响。设计、背景、患者:对来自11个意大利NICU的患儿进行可预期的，多渠道的，双盲的，安慰剂对照的随机试验。病人主要是 2007年10月1日到2008年7月31登记的472名极低出生体重儿。干预:婴儿被随机分成3组，一组(n=153)给予口服牛乳铁蛋白(BLF)(100mg/d);一组(n=151)给予BLF加LGG(6 x 109菌落单位/天);一组(n=161)给予安慰剂。时间是从出生到30天(出生体重<1000 g，从出生到45天)。主要观察指标:在迟发型变态反应的第一阶段，其血液、腹膜、脑脊液所分离的病原菌。结果:与对照组(29/168[17.3%])相比，BLF组(9/153 [5.9%])( P = .002)和BLF+LGG组(7/151 [4.6%])( P < .001)迟发型败血症的发生率明显降低。治疗过程中没出现任何不耐受性或反作用。结论:与安慰剂相比，单独补充BLF或BLF与LGG合用可以明显降低极低出生体重儿第一期迟发型败血症的发生率。 2.7人工喂养婴儿补充牛乳铁蛋白的双盲、安慰剂对照实验研究(美国马里兰大学医学院儿科系) 乳铁蛋白具有很多生物学功能包括促进生长、免疫调节和抗菌作用等。这个随机、安慰剂对照、双盲试验的目的是观察补充牛乳铁蛋白对婴儿的影响。对象及方法:对象为在 儿科诊所登记的健康、配方奶喂养婴儿。给这些婴儿喂食乳铁蛋白强化了的配方奶粉(850 mg/L)或商业配方牛奶(102 mg/L)，连续12个月。收集这一年内婴儿的生长参数及胃肠道、呼吸道、结肠疾病的发生情况。并分别在9个月和12个月的时候检测免疫抗体及血液学指标。结果:乳铁蛋白强化配方奶粉具有很强的耐受性。乳铁蛋白强化配方奶粉喂养婴儿与普通奶粉喂养的婴儿相比，呼吸道疾病(特别是哮喘)的发生率明显降低(P < 0.05)，在9个月时，血细胞比容明显增高(37.1% vs 35.4%; P < 0.05)。结论:乳铁蛋白的补充能带来很强的有利结果，比如说降低呼吸道疾病的发生率，增加血细胞的比容。 2.8乳铁蛋白体外和体内铁结合能力的研究(江南大学食品学院;食品科学与安全教育部重点实验室) 采用超滤,离子交换色谱法制备的乳铁蛋白的铁结合能力为87.7%，铁饱和度为15.1%。当pH值为7.5，NaHCO3 浓度为100mmol/L 时，铁结合能力最强。采用低强度的巴氏杀菌可以保持乳铁蛋白的铁结合性能。SD 大鼠的动物试验表明，50μg/g?d 和250μg/g?d 的乳铁蛋白剂量具有显著的升高血红蛋白浓度的作用。乳铁蛋白改善缺铁性贫血的最小有 效作用剂量为50μg/g?d。 2.9乳铁蛋白治疗反复呼吸道感染患儿的疗效(东南大学医学院附属江阴医院儿科;南京医科大学附属南京儿童医院新生儿医疗中心) 探讨乳铁蛋白对反复呼吸道感染(RRI)患儿免疫功能的影响。方法:RRI患儿98例随机分为2组。对照组48例予常规治疗;观察组5O例在常规治疗基础上予乳铁蛋白治疗2,3个月。治疗前后分别测定患儿T细胞亚群、免疫球蛋白及补体等指标，观察其变化情况。结果2组总有效率分别为86,和22.9, ，差异有非常显著性(P<0.005)。治疗后观察组免疫学指标CD3、CD4、CD4,CD8、IgG、IgA及IgM均明显升高(P <0.O1，0.05)，CD8较治疗前明显降低(P<0.05)。结论乳铁蛋白能增强RRI患儿的免疫功能。 2.10乳铁蛋白对牙龈卟啉菌和中间普氏菌的抑制效果研究(日本新泻大学研究生院医学和牙科研究所牙周病科;日本新泻大学研究生院医学和牙科研究所牙科及临床教育组) 乳铁蛋白是一种具有抗菌作用的铁结合蛋白，也存在于人体的唾液以及龈沟液中，由此推测在机体对抗口腔病原体如牙周细菌中将发挥作用。本实验研究了乳铁蛋白制剂对牙龈卟啉菌和中间普氏菌的抑制作用，这两种细菌存在于龈下菌斑形成的生物膜中。在这两种不同的细菌培养液中分别加入浓度从梯度130 μg/ml到8 mg/ml的人乳铁蛋白、未结合铁离子牛乳铁蛋白以及饱和铁离子的牛乳铁蛋白，和6 μg/ml抗菌肽牛乳铁蛋白肽B，结 果发现乳铁蛋白制剂对牙龈卟啉菌和中间普氏菌的抑制作用前5个小时一直加强，但到了8小时之后，这种抑制作用就逐渐变弱。研究还发现，如果在牙龈卟啉菌和中间普氏菌培养液中分别加入8 μg/ml的人乳铁蛋白、未结合铁离子乳铁蛋白和饱和铁离子的牛乳铁蛋白，结果24小时后，其菌斑生物膜的形成可被有效抑制。当菌液中同时加入不同的乳铁蛋白制剂以及牛乳铁蛋白肽B，培养5个小时后生物膜的形成也显著减少。在用未结合铁的牛乳铁蛋白同抗生素一起实验，结果发现当乳铁蛋白同环丙沙星、克拉霉素以及米诺环素一起作用24小时后，其抑菌效果同单个使用抗生素相比有显著性差异。本研究结果表明乳铁蛋白具有抑制牙龈卟啉菌和中间普氏菌的作用，因此在治疗或者协同治疗牙周细菌方面具有广阔的前景。 2.11 本章小结 乳铁蛋白(LF)是一种非常重要的营养物质，在母乳、牛乳等哺乳动物的乳汁当中，乳铁蛋白的含量是很丰富的，所以乳铁蛋白也得到了很广泛的应用。那么乳铁蛋白有哪些作用与功效呢, 研究表明，乳铁蛋白是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡;调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长;调节机体免疫功能，增强机体抗病能力;抑制人体肿瘤细胞的作用;能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。 近年来，随着生物工程技术的不断发展和成熟，越来越多的国家注意到乳铁蛋白的实用价值。科学家们利用分子生物学原理，进行了广泛的临床试验，确定了其对人体所具有的七大功效与作用。 一、乳铁蛋白具有广谱抗菌作用。 乳铁蛋白对革兰阴性菌和阳性菌的抑菌作用首先是由于乳铁蛋白高度结合铁，使细菌失去生长所需的基本养分铁。另外，乳铁蛋白通过氨基未端强阳离子结合区域，增加细菌细胞膜的通透性，使细菌的脂多糖从外膜渗出，达到直接杀菌作用。 二、乳铁蛋白具有抗病毒作用。 乳铁蛋白通过抑制病毒进入细胞，减轻对人体肝细胞的损害。 三、乳铁蛋白具有抗氧化作用。 乳铁蛋白(www.china-abid.com/rutiedanbai.php)能抑制铁诱导的脂质过氧化过程所产生的硫代巴比妥酸和丙二醛的生成。另外，牛乳铁蛋白能降解酵母中的转运RNA，具有核 糖果核酸酶的活性，且能抑制 超氧离子的形成。所有这些都可降低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏，达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的目的。 四、乳铁蛋白具有抗癌作用铁与其他微量元素的平衡。 乳铁蛋白在补充机体缺铁、降低铁在机体内沉积引起的铁过负荷，以及由此引发的一系列临床疾病中均发挥重要的预防和治疗作用。另外，乳铁蛋白对消化道肿瘤，如结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌，具有化学预防作用，并可抑制由此引发的肿瘤转移。最后，乳铁蛋白在启动宿主防御系统的初始活化反应，调控不同类型淋巴细胞比 例的改变对机体免疫反应的影响，提高免疫力和在预防丙型肝炎病毒的感染，治疗慢性肝炎方面都起到了积极作用。 五、乳铁蛋白调节机体免疫反应。 调节机体免疫系统是由于它右抑制作用与乳铁蛋白饱和度有关。另外，经研究显示，乳铁蛋白对抗体生成T细胞成熟、淋巴细胞中自然杀伤细胞比例都具有调节作用。 六、乳铁蛋白调节胃肠道铁的吸收。 乳铁蛋白通过它的氨基和羧基未端两个铁结合区域能高亲和性地，可逆地与铁结合，并维持铁元素在一个较广的PH范围内而完成铁在十二指肠细胞的吸收和利用。 七、乳铁蛋白同药物的协同作用。 乳铁蛋白粉能同多种抗生素和抗病毒药物协同作用，减少药物用量，降低抗生素或抗病真菌制剂对人体肝，肾功能的损害。同时，增强休内微生物对药物的敏感性。 正因为乳铁蛋白所具有的这七大功效，许多科学家和医学家开始把他应用到临床，在预防和治疗疾病芝程中进行了探索，并取得临床医学专家的认可。 第三章乳铁蛋白的提纯工艺 3.1乳铁蛋白的分离提取方法 乳铁蛋白是牛乳中的一种天然物质，是婴儿乳粉的重要添加剂，我国乳铁蛋白的生产技术还 不十分成熟，因此，其供应全部依赖进口。近些年来，很多学者对乳铁蛋白的提取技术进行了深入探讨，形成了很多重要的参考理论与方法，这对进一 步的工厂化生产技术研究提供了极好的基础。最早的乳铁蛋白分离技术研究起始于 1960年 ，Groveeslol使用 DEAE纤维素阴离子交换树脂，从牛初乳分离乳铁蛋白成分。目前乳铁蛋白的分离方法主要有离子交换色谱法、盐析结合凝胶层析法、超滤结合离子交换色谱法、混合模式扩张床吸附法、模拟移动床色谱连续分离纯化技术等方法。 1.1离子交换色谱法离子交换色谱法原理是根据离子交换剂对不同的离子或离子化合物的结合力不同而实现目标物质的分离。离子交换剂是由基质、电荷基团f功能基团)和反离子构成，它在水中呈不溶状态，它能与溶液中其它离子或离子化合物相互结合，其结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。由于蛋白质是两性电解质，在 pH低于其 等电点时，其带正电，能被阳离子交换剂吸附;在 pH高于其等电点时，其带负电，能被阴离子交换剂所吸附 l4l。吕立获等 (2005年 )讨论了从牛初乳中分离乳铁蛋白的工艺 J。结果表明 ，牛初乳经过f4800r,min，1 ,5?)，离心 30min脱脂得到脱脂乳，加入带羧甲基的弱酸性阳离子交换剂 CM—Sepharose FastFlow在 4 下进行动态吸附，用去离子水将没有吸附上的杂蛋白冲洗掉，然后使用质量分数为 1(5,和 5,的 NaC1溶液进行阶跃洗脱 ，经过两 步阶跃洗脱得到的乳铁蛋白纯度可达 95,以上 。傅维琦等(2006年 )从牛初乳中分离提取乳铁蛋白，建立快速分离纯化乳铁蛋白的工艺l6】。选择弱酸性阳离子交换剂 CM—SEPHAROSE FAST FLOW 装柱，脱脂牛初乳在 4?下进行动态吸附上柱后进行阶跃洗脱。通过对洗脱条件的比较优化，确定了分离提取乳铁蛋白的最佳工艺条件为:30 min。离子交换层析采用 Bio—Red的 BiologicLP 系统(柱型 1(6em×50on)，在 4?条件 下上柱速度 300mL,h，洗脱 剂的体积分数分别为 1(5,和5(0,的 NaC1，洗脱体积流速 200mL,h。洗脱后，采用截流相对分子量为 5000聚砜膜 的超滤膜进行超滤，经冷冻干燥得到冻干粉，纯度可达 98(98,，得率为 29(O,。李岩等 (2007年)将纯度为 50,左 右的乳铁蛋白溶液加入带羧甲基的弱酸性阳离子交换剂CM—SepharoseFastFlow进行动态吸附，采用质量分数为 1(6,和 5,的 NaCI溶液进行阶跃洗脱 ，并对层析过程和接样方法进行了优化 】。结果表明，经过对纯化方法的优化，乳铁蛋白纯度可达 96(7,。3(2 盐析和凝胶层析法结合徐丽萍等 (2007年)利用超滤、盐析和层析三种方法，采用单因素实验和正交实验对酸牛乳清中的乳铁蛋白进行分离和纯化，得到盐析的最佳条件为:使用 CA膜(醋酸纤维素)板式超滤器，工作压力 0(15MPa，料 液温度 4Oc。两次超滤 ，一次浓缩得到乳铁蛋白粗品。再以 50,硫酸铵 除去杂蛋白，然后在 30?，pH 8(5条件下 ，用 80,硫酸铵进行盐析。用 CM—SephadexC一100进行层析 ，进样量为 2mL，洗脱液 pH为 7(4时 ，可以得到乳铁蛋白纯品。SDS—PAGE凝胶电泳结果表明，牛初乳中乳铁蛋白的纯度为 92,，分子量约为 78000?2 000 DaI曲练达等(2006年 )采用 3次盐析法和 1次凝胶层析法从来源丰富的牛初乳中分离纯化。牛初乳在 4?条件下 ，4000r,min离心 40min，脱去脂肪。调 pH至 4(6，于室温放置 20min后 ，4?条件下，10000r,min离心 40ainr，除去酪蛋白，得到 乳清。用 30,的饱和硫酸铵沉淀 30min后 ，4?条件下 4000r,ainr离心 40min;将得 到的上清液再用 50,的饱和硫 酸铵沉淀 30min后 ，4?条件下4000r,min离心 40min，除去免疫球蛋白沉淀;将得到的上清液用 85,的饱和硫酸铵 沉淀 30min，在 pH 8(5的 条件下，4? ，4 000 r,min离 心 40 min，后进行凝胶层析。选用 SephadexG一100在20?条件下以 0(2mL,min的流速进行洗脱，洗脱液选用 pH 7(4，并利用电泳和分光光度法检测其纯度和含量，所获得的乳铁蛋白的分子质量为 90000U，纯度大约为 92,。 1.2超滤和离子交换色谱法结合牛初乳料液 pH 6(6，在 一4c,4?进行离心脱脂 江南大学卢蓉蓉等 (2006年 )采用酶法去除酪蛋白，膜分离技术和工业色谱技术相结合，从牛初乳中工业化分离乳铁蛋白12Ol。在牛初乳脱脂乳清中，加入皱胃酶液，加酶量控制在使初乳 10,15min凝固为宜，pH调节至 6(0，酶反应温度为40qC，初乳凝固后保温 30min，离心去除酪蛋白，经预过滤后采用板式膜组件和醋酸纤维素膜材取 25mL 角瓶，加入 0(1g介质和 20mL不 同浓度的乳铁蛋白或乳清溶液，水浴摇床(25?)振荡8h，进行静态吸附实验。结果表明，StreamlineDirectHST介质对乳铁蛋白的吸附容量较大，约I10mg，g介质，具有一定的耐盐特性;改变离子强度不能实现有效洗脱，改变 pH值是洗 脱的合适料、以错流方式操作的超滤系统，进行两步超滤， 途径;新鲜牛乳经室温离心除去脂肪，用 lmmol,L超滤工艺参数为:切向流速 3,4L,min，临界操作压力 0(10,0(15MPa，操作 温度 45? ,55? ，得到截留浓缩液即乳铁蛋白粗制品后，选用 SP SepharoseFastFlow强阳离子交换剂，装柱，柱尺寸为 7(0X20cm，以 pH值为 7(7,8(0，10mmol,L的磷酸盐为起始平衡缓冲液，截留浓缩液上样，洗脱速度 2L,h，先采用 0(5mol,L的 NaC1溶 液洗脱其它组分，至洗脱吸收值回复至基线水平，再采用1mol,L的 NaC1溶液洗脱乳铁蛋白组分，至洗脱吸收值再次回复至基线水平作为洗脱结束，收集该乳铁蛋白组分的洗脱液，经超滤脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到纯度为 90,以上 的乳铁蛋白精制品。初乳的 批处理量为 300kg。鉴定专家一致认为该工艺降低了生产成本，攻克了工业化分离纯化技术难点。 1.3 混合模式扩张床吸附法 扩张床吸附 (expandedbedadsorption，EBA)是项新型的生物分离技术，能直接从发酵液、细胞培养液或匀浆液中捕获目标产物，集固液分离、浓缩和初步纯化于一个操作单元之甲。混合模式吸附层析 (mixed—modechromatography)是近年开发的生物分离新方法，其功能配基同时含有疏水基团和离子交换基团，兼具疏水作用和静电相互作用，可以通过静电相吸来强化吸附或静电排斥来协助解吸，具有广阔的应用前景。同时配基密度通常比较高，具有典型的耐盐吸附性能，对目标蛋白有很强的捕获能力，可以从较低浓度的体系中富集目标蛋白，特别适合于生物对象初分离的要求。将扩He1调节 pH值至 4(6，静置后离心，除去乳酪蛋白，得到酸乳清，调节 pH值 至 4(7，电导率 为 5(5mS,cm，进行了扩张床吸附分离，采用 pH值阶跃洗脱，从牛乳清中分离得到不同乳清分离蛋白组分，20mmo1]LNaOH洗脱下得到乳铁蛋白，收率为 87(8,，纯化因子高达 l0(5，分离过程体现 了扩张床吸附的集成化优势 。 1.4高效低成本的模拟移动床色谱连续分离纯化技术 上述几种提纯方法中都或多或少的存在着一些不足，如分离效率低、提取纯度一般、处理量小、成本高等缺点。模拟移动床色谱连续分离纯化技术则能够进一步的提高分离纯化效率、降低生产成本、提高分离速度，与传统的色谱分离技术相比，其特点是采用连续分离操作，这一点为实现自动化分离操作奠定了极好的基础，其制备效率高，提纯效果较一般色谱分离高出 40,，最主要的特点是可降低设备投资，而且运行成本低，操作连续化，处理量大，提高分离效率高，吸附剂利用率高，加工效率高，便于自动控制，一般可使加工成本降低 50,，甚至 80,以上[24,25】。采用模拟移动床色谱分离纯化技术是基于普通制备色谱的数据条件之上建立的技术参数。首先将乳清液经过板框精滤后，再采用盐析、酶解方 法除去杂蛋白，选用 SP SepharoseFastFlow强 阳离子交换剂，装柱，柱尺寸为 1(0X100em，进行单柱制备色谱的分离参数确定。根据此数据，再进张床吸附和混合模式吸附层析有机地结合起来， 行模拟移动床色谱分离纯化技术参数的确定。以实现混合模式扩张床吸附，可以充分发挥二者的优势，达到低原料要求、高处理量和高选择性的分离目标[21,2J。 林东强等 (2009年 )采用混合模式扩张床吸附介质 StreamlineDirectHST，直接从 牛乳清中分离乳铁蛋白。考察了新型介质的扩张床膨胀特性和流体混合性能，确定合适的操作流选定膨胀率为 2，可以满足高处理量和床层稳定性的要求。pH为 7(5,7(8，10 mmol,L的磷酸盐溶液为起始平衡缓冲液，截留浓缩液上样，洗脱速度 2L,h，先采用 0(5mol ,L的 NaC1溶 液洗脱其它组分，至洗脱吸收值回复至基线水平，再采用 1mol,L的 Na—cl溶液洗脱乳铁蛋白组分，至洗脱吸收值再次回复至基线水平作为洗脱结束，收集该乳铁蛋白组分的洗脱液，经超滤脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到纯度为 90,以上 的乳铁蛋白精制品。在接下来的实验里，我们采用超滤法提取研究。 3.2 材料与方法 3.2.1 主要材料 牛初乳:乳牛产犊后 72 h 内收集 ,由杭州双峰 牧场提供;CM2Sep haro se FF : Pharmacia ( Upp sala , Sweden) 公司产品; CM2Sep hadex C250 : Pharmacia ( Upp sala , Sweden) 公司产品; L F 标样 : ICN Bio2 medical Inc (Ohio ,U SA) 公司产品. 3.2.2 实验方法 1 . 2 . 1 工艺路线 原料乳过滤 ?脱脂 ?离子交换 层析 ?洗脱液 ?超滤浓缩 ?冷冻干燥 1 . 2 . 2 实验步骤 脱脂: 使用 TDL25000B 冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂) 在 - 4,4 ?进行离心 脱脂 30 min. 离子交换层析采用Bio2Red 的Biolo gic L P 系统 ( 柱型 1 . 6 cm ×50 cm ) , 脱脂乳以300 mL/ h的流速在 4 ?条件下动态上柱吸附 8 h .先用去离子水以 200 mL / h 的流速进行平衡 , 约10 h ;然后用质量分数为 1 . 5 %的 NaCl 洗脱 ,约需5 h ,待杂蛋白被洗脱下来 ,基线再度走平后 ,使用质量分数为 5 . 0 %的 NaCl 溶液洗脱 ,两步洗脱速度均 为 200 mL/ h ,洗脱剂 p H 在 6 . 7 左右 ,洗脱产物为L F ,出峰时间为 1 h 左右. 超滤浓缩: 利用 L abscale TFF System ( Millipo re , U SA ) ,采用截流相对分子 量为5 000 聚砜膜的超滤膜. 冷冻干燥 : 利用 AL2P HA122LD 真空冷冻干燥机( martin christ , germa2ny) 进行 - 55 ?冷冻干燥. 1.2. 3 分析方法 利用放射免疫扩散法[ 9 ] 测定牛初乳中 L F 的含量; SDS PA GE 电泳[ 10 ] 对 L F 进行鉴定; 运用H PL C[ 112] 对 L F 进行定量纯度检测. 3.3 结果与讨论 3. 1 离子交换剂的选择 由牛初乳的理化性质可知 , 当其 p H 在 6 . 5 ,7 . 0的条件下 ,牛初乳中质量密度最多的酪蛋白及乳清蛋白、乳白蛋白等将带有负电荷 ,而目标蛋白 L F由于其等电点在 8 . 0 附近将带有正电荷. 因此考虑选用阳离子交换剂进行分离. 强阳离子交换剂应用的 p H 范围广 ,弱阳离子交换剂应用的 p H 范围窄.但是强阳离子交换剂的选择性比弱阳离子交换剂的选择性小. 故强酸性阳离子交换剂虽然可以与许多种类的阳离子交换 ,但对正电荷的胶体和高分子阳离子都不易吸附或吸附很少. 由于牛初乳的 p H 稳定性很好 ,使用弱酸性阳离子交换剂来分离 L F 这样的碱性蛋白质效果比较好. 初步选定 CM2SEP H2AD EX C250 ( Soft t ype ) 和 CM2SEP HA ROSE FF( Hard t ype) 两种离子交换介质.从表 1 可以看出 , 相同单位量的牛初乳原料(L F 体积浓度测得 1 . 05 g/ L ) 进行实验 , CM2 SEP HAD EX C250 作为交换剂所洗脱得到的 L F 与 CM2SEP HA ROSE FA S T FL O W 相比 ,后者收率较 大. 而在使用相同的装柱方法时表明 ,CM2SEP HA2ROSE FA S T FL OW 作为一种硬胶 ,比 CM2SEP H2AD EX C250 更容易操作 ,且在实验过程中体积不会发生变化 ,更利于实现工业化控制. 图 1 CM2SEPHADEX C250 穿透曲线 表 1 CM SEPHADEX C 50 与 CM SEPHAROSE FF 阶跃洗脱效果比较 2 2 2 2 2 Tab. 1 Step elution comparison of CM SEP HAD EX C 50 wit h CM SEP HA ROSE FF - 1洗脱剂选择 ρ(L F 洗脱液) / (g ?L ) L F 得率/ % 初乳吸附前 p H 初乳吸附后p H CM SEP HAD EX C 50 6 . 37 6 . 32 26. 25 21 . 5 2 2 2 2 6. 63 6 . 84 17. 13 29 . 0 CM SEP HA ROSE FF 3. 3 . 1 不同洗脱离子的影响 利用体积分数分别为 1 . 5 %和 5 . 0 %的洗脱离子进行阶跃洗脱的比较如表 2 所示. 结果发现 ,Na + 作为洗脱离子的洗脱效果最好 ,L F 纯度达到 98 . 98 % ,得率为 29 . 0 %. 3 . 3 . 2 不同离子强度的影响 在进行阶跃洗脱的 第二步时 ,将 NaCl 体积分数固为 5 . 0 % ,进行第 一步 NaCl 离子强度选择优化的阶跃洗脱比较如表 3所示. 结果发现 ,当 NaCl 体积分数为 1. 5 %时 ,洗脱效果最好 ,L F 纯度达到 98. 98 % ,得率为 29. 0 %. 阶跃洗脱的第一步将 NaCl 体积分数固定为1 . 5 % ,进行第二步 NaCl 离子强度选择优化的阶跃洗脱比较如表 4 所示. 结果发现 ,当 NaCl 体积分数为 5 . 0 %时 ,洗脱效果最好 ,L F 纯度达到 98 . 98 % ,得率为 29 . 0 %. 表 2 不同洗脱离子效果比较 Tab. 2 Comparison of elution effect wit h different eluant w (L F纯度 ) / % L F 得率/ % 洗脱离子 + 91. 56 22 . 4 K2 + Ca92. 48 23 . 3 + Na 98. 98 29 . 0 表 3 第一步ρ( NaCl) 不同的洗脱效果比较 Tab. 3 Co mpariso n of elutio n effect wit h different ρ( NaCl) in first stage - 1ρ( NaCl) / ( g ?mL ) w (L F 纯度) / % L F 得率/ % 0 . 01 93. 15 25 . 1 0. 015 98. 98 29 . 0 0 . 02 97. 26 26 . 3 表 4 第二步ρ( NaCl) 不同的洗脱效果比较 Tab. 4 Co mpariso n of elutio n effect wit h different ρ( NaCl) in seco nd stage - 1ρ( NaCl) / ( g ?mL ) w (L F纯度 ) / % L F 得率/ % 0 . 03 92. 37 25 . 1 0 . 05 98. 98 29 . 0 0 . 07 96. 48 28 . 2 3 .3 . 3 不同洗脱方法的比较 从表 5 可以看出 ,采用阶跃洗脱的效果明显好于梯度洗脱 ,阶跃洗脱所得到的洗脱液中 L F 的体积分数比梯度洗脱要高的多 ,同时单位体积牛初乳中乳铁蛋白的得率也比梯度洗脱要高的多. 表 5 阶跃洗脱与梯度洗脱效果比较 Tab. 5 Comparison of step elutio n and gradient elutio n L F 得率 初乳吸附 初乳吸附 ρ(L F 洗脱液) 2. 4 优化后一步法分离 LF 的洗脱方法 - 1/ ( g ?L ) 前 p H 后 p H / % 阶跃洗脱 6 . 84 6 . 63 17 . 13 29 . 0 电泳结果利用 Bio2Red 的 梯度洗脱 6 . 70 6 . 40 4 . 00 16 . 0 ChemicDoc EQ 凝胶成像系统对 L F ( w ( NaCl) = 5 %) 梯度洗脱 6 . 76 6 . 55 5 . 00 18 . 0 产品进行鉴定 ,结合 labwo rk 软件分析表明 ,L F 纯度达到 97 %. 3.3.4高效液相色谱结果经高效液相色谱分析表明 ,L F 标样的纯度为95 . 63 % ,如图 4 所示; L F 产品纯度达 98 . 98 % , 得率可达 29 . 0 % ,结果如下图 所示. 结论 利用 CM2SA P HA ROSE Fast Flow 装柱 ,采用脱脂牛初乳作为原料 ,在 4 ?下动态吸附上柱 ,然后用离子体积分数为 1 . 5 %和 5 . 0 %的氯化钠溶液进行两步阶跃洗脱可获得高纯度 L F 洗脱液. 洗脱液 经过超滤和冻干 ,L F 产品得率达到 29 . 0 % ,纯度可达 98 . 98 % ,高于 ICN Bio medical Inc ( Ohio , U SA ) L F 标样. 本工艺方法 ,快速简便 ,获得的 L F 纯度符 合开发天然生物药的要求. 其分离纯化工艺为高纯 度乳铁蛋白的产业化提供了可靠依据. 参考文献: [1] 郑峥,马彦科. 牛初乳的开发利用及研究进展[J].生物技术通讯,2010, 21(5):746-749 [2]曹劲松,段海霞(口服牛初乳及其组分的保健功能[J](中国乳品工业,2004,32(8):11,13( [3]陈明,张勇,冯炜(功能性食品原料牛初乳[J](食品工业,2006, (3):19,22( [4] 李延华等. 牛初乳的营养保健功能及其生物活性成分的开发利用 [J].食品科 学,2007,4:265-268 [5]车云波. 牛初乳功能食品的开发利用[J].农业与技术,2010,3(30):52-55. 刘浩强(牛初乳中活性物质含量分析[J](中国奶牛, 2007,(4):54,57 [6]丁连才, [7]高学飞,王志耕(β,乳球蛋白应用研究[J](乳品加工,2009,(5):41,44( [8]曹劲松(初乳功能性食品[M](北京:中国轻工业出版社,2000: 17,48( [9]赵名,刘宁(免疫调节功能性食品,牛初乳[J](中国食物与营养,2006,(5):55,57( [10]Playford R J,Floyd D N,McDonald C E,et al(Bovine-colostrum is a health food supplement which prevents 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[25] 郭本恒 , 孔保华 .保健与功能食品 [M].黑龙江省科技出版该实验通过采用超滤分离、盐析分离和柱层析 [26] 陈季旺,姚惠源,张小勇,陈正行. 米糠可溶性蛋白的提取工艺和特性研究[J].中国油脂, 2003, 28 (2): 46,50. 附录 牛乳铁蛋白(是牛初乳形成阶段、泌乳期、调乳期和乳牛乳房腺体分泌物中主要的糖蛋白之一，是一种铁结合蛋白，相对分子质量约为8 U ，具有广谱抗菌、抗病毒、阻断氧自由基、调节胃内铁吸收和免疫应答等功能 。笔者按一类新药的要求并借鉴《中国人民共和国药典》对牛乳铁蛋白进行研究，通过参考相关文献 ，采用反相高效液相色谱法对该产品含量的测定进行了研究，该法操作简单，结果准确可靠。研究牛乳铁蛋白的质量。采用化学及高效液相色谱法进行定性鉴别;采用高效液相色谱法法对牛乳铁蛋白的含量进行测定 牛乳铁蛋白的浓度在 90与其峰面积成良好的线性关系 ，该法操作简便，精密度好，结果准确可靠，可作为牛乳铁蛋白质量标准的重要指标。 致谢 时光的流逝也许是客观的，然而流逝的快慢却纯是一种主观的感受。当自己终于可以从找工作、毕业设计的压力下解脱出来，长长地吁出一口气时，我忽然间才意识到，原来三年已经过去，到了该告别的时候了。一念至此，竟有些恍惚，所谓白驹过隙、百代过客云云，想来便是这般惆怅了。 可是怅然之后，总要说些什么。大学三年，生活其实很简单，只是一些读书、写字和考试的周而复始。如果把这种单调的生活看作一场场循环的演出，提供那么我只是一个安静的演员。这篇毕业设计致谢也称不上什么精彩的台词，只不过是这种循环演出即将告一段落时的谢幕词。但是无论多么蹩脚的演员，无论台下有多少观众，即使是只说给自己听，在他谢幕时也总要感激一些人，是这些人帮助他走上舞台，成功或者不那么成功地“演出”。 我在这里首先要感谢的是我的毕业设计指导老师——王传兴老师。这篇毕业设计从开题、资料查找、修改到最后定稿，如果没有他的心血，尚不知以何等糟糕的面目出现。我很自豪有这样一位老师，他值得我感激和尊敬。 感谢和我共度三年美好大学生活的2013级应化1361班的全体同学。感谢化工学院的所有授课老师，你们使我终身受益。感谢所有关心、鼓励、支持我的家人、亲戚和朋友。 青岛科技大学本科毕业设计(论文)任务书 毕业设计(论牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究 文)题目 题目类型 课题来源 院(部) 指导老师 王传兴 专 业 应用化工技术 班 级 学生学号 学生姓名 毕业设计(论文)的主要任务及目标: 毕业设计(论文)的主要内容: 毕业设计(论文)的基本要求: 主要参考文献(要求至少外文二篇,中文三篇): 设计(论文)各阶段主要任务 起止日期 1 2 进3 度4 安 排 5 6 7 8 院(部)审核意见: 院长(主任)签章: 年 月 日 青岛科技大学本科毕业设计(论文) 毕业设计(论牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究 文)题目 院(系、化工学院 指导老师 王传兴 部) 专 班 级 业 学生学 学生姓名 号 目前国内外研究进展概述(或立题依据): 主要研究内容: 毕业设计(论文)的设计及思路: 毕业设计(论文)工作计划安排: 指导教师意见: 指导教师签名: 系(或教研室)审核意见: 系(或教研室)主任签章: 年 月 日 青岛科技大学本科毕业设计(论文)综合评定意见表 毕业设计(论牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究 文)题目 院(系、部) 化工学院 综合成绩(Y) 专 业 应用化工技术 班 级 学生学号 学生姓名 指 导 教 师 评 语 (满分30分)成绩(X): 指导教师签名: 年 月 日 1 评 阅 教 师 评 语 (满分10分)成绩(X): 评阅教师签名: 年 月 日 2 答 辩 组 评 语 (满分60分)成绩(X): 答辩组组长签名: 年 月 日 3