PTC124治疗弹性纤维假黄瘤的初步研究

PTC124治疗弹性纤维假黄瘤的初步研究 分类号: R751 密 级:公开 PTC124 治疗弹性纤维 假黄瘤的初步研究 Study on the PTC124 treatment for Pseudoxanthoma elasticum 作者姓名:周勇 学科专业:皮肤病与性病学 导 师:李恒进 教授 答辩委员会主席: 张建忠 教授 论 文 答 辩 日 期:二〇一三年五月二十九日 院校地址:北京市复兴路 28 号 邮政编码:100853 解放军医学院 研究生学位论文原创性 秉承我院“忠诚、敬业、和谐、创新”的学风，本人声明:所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 日期: 指导教师签名: 日期: 解放军医学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为解放军医学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)。 论文作者签名: 日期: 指导教师签名: 日期: 目 录中文摘 要…………………………………………………………………1英文摘要…………………………………………………………………3前 言………………………………………………………………………5PTC124 对弹性纤维假黄瘤无义突变的通读作用………………………8 前 言……………………………………………………………………8 材料与方法……………………………………………………………8 试验方 法………………………………………………………………11 结 果……………………………………………………………………31 讨论……………………………………………………………………43 结论……………………………………………………………………47斑马鱼胚胎发育系统检测 ABCC6 多肽链功能的研究 …………………50 前 言……………………………………………………………………50 材料与方法……………………………………………………………50 试验方 法………………………………………………………………51 结 果……………………………………………………………………54 讨论……………………………………………………………………56全文结论…………………………………………………………………61文献综述…………………………………………………………………63致 谢………………………………………………………………………75 解放军医学院博士学位论文作 者:周勇学科专业:皮肤病与性病学导 师:李恒进 PTC124 治疗弹性纤维假黄瘤无义突变的初步研究 中文摘要 研究背景与目的 弹性纤维假黄瘤Pseudoxanthoma elasticum PXE，是一种少见的常染色体遗传性疾病，由 16 号染色体上的 ABCC6 基因突变引起的，主要累及弹性纤维和结缔组织，造成弹力纤维降解及组织钙化变硬可侵犯人体多个器官和系统主要表现为皮肤、眼、心血管系统损害，发病率约为 1:50 000。迄今为止，共发现 ABCC6基因突变近 600 个。无义突 变(nonsense mutation )是指由于某个碱基的改变，使代某种氨基酸的密码子突变 为终止密码子，从而使肽链合成提前终止，肽链合成中断。PXE 患者中无义突变的 比例近 40其中 R1141X 占 30，是主要的致病原因之一，目前缺乏有效的治疗手段。 PTC124(Ataluren)，是 PTC Therapeutics 公司生产的小分子药剂，主要通过降低 核糖体对早熟终止密码子(Premature Termination codon， PTC)的敏感性，或忽略 早熟终止密码子，从而实现对早熟终止密码子的通读(Read-through)。目前 PTC124 已经应用在治疗遗传性疾病的临床试验中，其中囊性纤维化(CysticFibrosis)已经 进入 III 期临床试验。 本实验通过体外研究，观察 PTC124 对 PXE 患者早熟终 止密码子的通读作用，为临床治疗提供新的思路和办法。 研究方法1(体外实验以 人 HEK 293 细胞为研究模型 在 PCMV6-hABCC6-DDK 质粒中建立已知的 7 种 不同的早熟终止密码子突变模型，转染至 HEK 293 细胞， PTC124 处理 72 小时， 免异荧光染色法和细胞内ELISA 法检测早熟终止密码子的通读效率。2(体内实验 以斑马鱼为研究模型 1 解放军医学院博士学位论文 R1141X 是最常见的无义突 ，根据 R1141X 早熟终止密码子通读后变化的氨基酸序列，在 变，占 35 BS/SK-hABCC6 质粒中，构建 3 种可能的错义突变模型，生成相应的 mRNA，显 微注射入斑马鱼胚胎进行拯救分析实验，观察斑马鱼胚胎的存活率而分析各种错义 突变的作用。 结果 1(体外实验以人 HEK 293 细胞为研究模型实验结果 ? PTC124 浓度在 0-40 umol/L 时无细胞毒性。?对 7 种无义突变，PTC124 可以提 PTC124浓度高早熟终止密码子的通读效率，浓度在 5 umol/L 时通读效率最高。? 在 5 umol/L 时，R1164X and R1275X 的通读效率最高， lt8。?早熟终止密码子的 通读效率不仅受药物浓度影响，还受早熟终止密码子后一位氨基酸序列影响，且当1 位置的序列为“C”时最高。 2(体内实验以斑马鱼为研究模型实验结果 ?早熟终止 密码子通读后 3 种可能的错义突变模型，生成相应的 mRNA，可以使斑马鱼胚胎 正常发育，存活率分别为 WT 90.6TGG 73.4，TGC 92.5，GGA84阳性对照组(注射 morpholino、R1141X)存活率 29，阴性对照组(注射standard control morpholino) 存活率 88，治疗组与 mopholino 对照组之间有显著性差异(plt0.05)。?3 种错 义突变模型之间和突变模型与阴性对照组，斑马鱼胚胎存活率无显著性差异 (pgt0.05)。 结论 1( PTC124 可以提高早熟终止密码子的通读效率，浓度在 5 ug/mL 时通读效率最高; 2(早熟终止密码子的通读效率不仅受药物浓度影响，还 受早熟终止密码子后一位氨基酸序列影响，且当1 位置的序列为“C”时最高; 3(早 熟终止密码子通读后 3 种可能的错义突变，生成相应的 mRNA，可以使斑马鱼胚 胎正常发育，存活率与对 morpholino 照组组之间有显著性差异(plt0.05)。 4(PTC124 对弹性纤维假黄瘤患者有潜在的治疗作用，需要进一步研究 关键词 弹 性纤维假黄瘤 无义突变 早熟终止密码子通读作用 PTC124 斑马鱼补救分析 2 解 放军医学院博士学位论文作 者:周勇学科专业:皮肤病与性病学导 师:李恒进 Study on the PTC124 treatment for Pseudoxanthoma ElasticumResearch Background and Objectives Pseudoxanthoma Elasticum PXE is an autosomal recessive metabolic disorderwith estimated prevalence of 1:50000 but with no current effective treatment. PXE iscaused by mutations in the ABCC6 gene and more than 300 different mutations areknown to cause PXE more than 35 of these being nonsense mutations.Methods1. Study on HEK 293 cell in vitro We investigated the therapeutic potential of the premature termination codon PTCreadthrough-inducing drug PTC 124 in treating PXE in an in vitro system. The ability ofdrug to readthrough PTC was examined in HEK293 cells transfected with sevendifferent ABCC6 nonsense DNA-constructs linked to a DDK peptide tag at the 3’ endassociated with PXE. The efficacy of the read-through was evaluated byimmunofluorescence and In-Cell ELISA at 72 hours after treatment with the drug..2. Study on zebrafish model in vivo Considering the redundancy of the genetic code it was postulated that in case ofp.R1141X the read-through may result in substitution of the arginine 1141 by glycinetryptophan or cysteine. The potential pathogenicity of these three missense substitutionswas tested in a novel zebrafish mRNA rescue assay.Results PTC124 did not exhibit toxicity at concentrations up to 40 μg/ml and the highestreadthrough efficiency was observed at dosage of 5 μg/ml when a series of doses weretested within a range from 0 to 40 μg/ml. In addition PTC124 at 5μg/ml was moreefficient on R1164X and R1275X than on other mutants tested including R1141Xindicating that induced readthrough is not only a dose-dependent but also a 3 解 放军医学院博士学位论文context-dependent process. The zebrafish mRNA rescue study suggested that all threemRNA transcripts were able to rescue Abcc6 morpholino-induced mortality ofdeveloping zebrafish embryo similar to wild-type mRNA indicating that they are notpathogenic.Conclusions1. PTC124 enhances the read-through efficiency of premature termination codonmutation of ABCC6 gene. Higher efficiency was observed with 5-10ug/ml a dosewithout cell toxicity.2. Readthrough is not only a dose-dependent but also a context-dependent process3. These 3 subsitution of mRNA transcripts were able to rescue Abcc6morpholino-induced mortality of developing zebrafish embryo indicating that they arenot pathogenic.4. We set up an evaluation system working well not only for the PTC124 andaminoglycoside catalog but also for the more and more novel drugs in development totreat the nossense mutation in PXE and other genetic dermatologic disease.This studyprovides valuable information concerning the potential of pharmacological treatment forPXE.Key wordsPseudoxanthoma Elasticum(PXE) nonsense mutations PTC124premature termination codon(PTC) read-through Zebrafish rescue assay 4 解放军医学院博士学位论文 PTC124 治疗弹性纤维假黄瘤的初步研 究 前 言 遗传性疾病很久以来就受到人们的关注，随着遗传学和分子生物学研究的 快速发展，人们从细胞分子水平对疾病的认识的不断深入，遗传性疾病治疗已进入 了一个全新的时代。 弹性纤维假黄瘤Pseudoxanthoma elasticum PXE，是一种少见 的常染色体遗传性疾病，由16号染色体上的ABCC6基因突变引起的，主要累及弹性 纤维和结缔组织，造成弹力纤维降解及组织钙化变硬可侵犯人体多个器官和系统主 要表现为皮肤、眼、心血管系统损害，发病率约为1:50 000。迄今为止，共发现ABCC6 基因突变近600个1，2。突变的类型可分为错义突变和无义突变，其中无义突变是指 因为某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子突变为早熟终止密码子 (premature termination codon， PTC)，从而使肽链合成提前终止，形成不完整的、 无功能的肽链，使基因无法合成蛋白质发挥作用而导致发病。PXE患者中无义突变 的比例达40其中R1141X占3534，是PXE目前发现的最常见的突变之一，目前缺乏有 效的治疗手段。 PTC124(Ataluren)，是PTC Therapeutics公司生产的小分子药剂， 是通过高通量筛选技术筛选出的化合物，主要通过降低核糖体对早熟终止密码子的 敏感性或忽略早熟终止密码子，从而实现对早熟终止密码子的通读56。PTC124与核 糖体60S亚基结合7，结构与恶二唑(oxadiazole)类似，但与氨基甙类抗生素截然不 同，并且没有抗细菌作用。PTC124口服即可达到治疗需要的血药浓度，方便患者使 用。研究显示，在杜兴氏肌肉营养不良症的细胞系和小鼠模型中，PTC124均显示出 较庆大霉素为高的抑制PTCs效率的作用8。在囊性纤维化(CF)的小鼠模型中， PTC124修复了24-29的野生型蛋白功能9，是目前在囊性纤维化和杜兴氏肌肉营养不 良患者的临床试验中，最成功的通读药物，几乎没有任何毒副作用。PTC124不影响 正常的终止密码子，这点从临床试验前的健康志愿者的药理和毒理学研究中可以得 到证实10。目前PTC124已经应用在治疗遗传性疾病的临床试验中，其中囊性纤维化 (Cystic Fibrosis)已经进入III期临床试验。 本实验通过体外构建PXE无义突变模型， 观察PTC124对PXE患者早熟终止密码 5 解放军医学院博士学位论文子的通读作 用，然后根据R1141X早熟终止密码子通读后变化的氨基酸序列，在BS/SK-hABCC6 质粒中，构建3种可能的错义突变模型。斑马鱼的基因中含有hABCC6相关基因，与 斑马鱼的正常发育密切相关11，将相应的mRNA显微注射入斑马鱼胚胎进行补救分 析实验，观察斑马鱼胚胎的存活率而分析各种错义突变的作用，进一步阐明PTC124 的治疗作用，为临床治疗提供新的思路和办法。 参考文献1. Uitto J Li Q Jiang Q. seudoxanthoma elasticum: molecular genetics andputative pathomechanisms. (2010) P J Invest Dermatol. 1303:661-6702(Jiang Q Uitto J. (2009)Pseudoxanthoma elasticum is a metabolic disease. J InvestDermatol. 2 348-3543. Li Q Jiang Q Pfendner E Váradi A Uitto J. 2009 Pseudoxanthoma elasticum:clinical phenotypes molecular genetics and putative pathomechanisms. Exp Dermatol.1:1-114. Hu X Peek R Bergen AA. (2003) Analysis of the frequent R1141X mutation inthe ABCC6 gene in pseudoxanthoma elasticum. Invest Ophthalmol Vis Sci.5:1824-1829.5. Laure Bidou Vale rie Allamand. et al. 2012 Sense from nonsense: therapies forpremature stop codon diseases. Trends in Molecular Medicine. 11 679-6886. Renata Bordeira-Carrico. et al. 2012 Cancer syndromes and therapy by stop-codonreadthrough. Trends in Molecular Medicine. 11 667-6787(Rowe S.M. and Clancy J.P. 2009 Pharmaceuticals targeting nonsense mutations ingenetic diseases: progress in development. BioDrugs 23 165–1748(Welch E.M. et al. 2007 PTC124 targets genetic disorders caused by nonsensemutations. Nature 447 87–919(Du M. et al. 2008 PTC124 is an orally bioavailable compound that promotessuppression of the human CFTR-G542X nonsenseallele in a CF mouse model. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 2064–206910(Hirawat S. et al. 2007 Safety tolerability and pharmacokinetics of PTC124 a 6 解放军医学院博士学位论文nonaminoglycoside nonsense mutation suppressor following single- and multiple-doseadministration to healthy male and female adult volunteers. J. Clin. Pharmacol. 47430–44411. Li Q Uitto J. (2010) The abcc6a gene expression is required for normal zebrafishdevelopment. J Invest Dermatol. 11:2561-2568 7 解放军医学院博士学位论文 第一部分 PTC124 对 弹性纤维假黄瘤(PXE) 无义突变的通读作用 前 言 PTC124，商品名为 Ataluren， 是通过高通量筛选技术筛选出的化合物，是通过特殊设计来诱导核糖体进行无义突 变通读，用以治疗早熟终止密码子(premature termination codon，PTC)。PTC124 结 构与恶二唑(oxadiazole)类似，与核糖体 60S 亚基结合，降低核糖体对 PTCs 的 敏感性，发挥其药理作用，但不影响正常的终止密码子。目前囊性纤维化(CF)、 杜兴氏肌肉营养不良症(DMD)12和血友病患者中，正在进行 PTC124 的临床试 验。 弹性纤维假黄瘤Pseudoxanthoma elasticum PXE，是一种少见的常染色体遗传 性疾病，由 16 号染色体上的 ABCC6 基因突变引起的，主要累及弹性纤维和结缔 组织，造成弹力纤维降解及组织钙化变硬可侵犯人体多个器官和系统主要表现为皮肤、眼、心血管系统损害，发病率约为 1:50 000。迄今为止，共发现 ABCC6基因突变近 600 个。PXE 患者中无义突变的比例达 40，其中 R1141X 占 3534，是 PXE 目前发现的最常见的无义突变，目前缺乏有效的治疗手段。 本实验通过体外研究，观察 PTC124 对 PXE 患者早熟终止密码子的通读作用，为临床治疗提供新的思路和办法。 材料与方法一、实验材料(一)主要仪器设备CO2 孵箱 Forma Scientisic 公司37?恒温摇床 美国 Lab Line 公司J2-21M 低温高速离心机 美国 Bechman 公司Hermle 低温台式离心机 Labnet 公司台式离心机 Eppendorf 公司-80?超低温冰箱 New Brunswick 公司垂直电泳及电转移槽 E-C Apparatus Corporation 公司 8 解放军医学院博士学位论文稳压稳流电泳仪/电转仪 E-C Apparatus Corporation 公司96 孔板读板器(Model 680) 美国 Bio-RAD 公司LSM 510 META 荧光显微成像系统 Zeiss 公司PCR扩增仪 Eppendorf公司-20?生物组织包埋机 AVANTIK 公司超净台 Forma Scientisic 公司水浴锅 美国 Bechman 公 ) Boekel Scientic 公司NanoDrop Lite 司台式恒温箱(Model 136400 Spectrophotometer Themo Scitific 公司(二)药品及试剂Ataluren(PTC124) PTC Theraputics 公司Kanamycin Sulfate 美国 Invitrogen 公司Opti-MEM medium 美国 Invitrogen 公司Lipofectaine2000 美国 Invitrogen 公司胎牛血清 GIBCO 公司GIBCO DMEM 培养液 美国 Invitrogen 公司小牛血清白蛋白 BSA 美国 Sigma stratagene 公司MTT Assay Kit 公司QuikChange II Site-Directed Mutagenesis 试剂盒 Promega 公司EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 公司QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN .