四环素类药物残留检测方法的比较.doc

四环素类药物残留方法的比较.doc 四环素类药物残留检测方法的比较 摘要:四环素类药物是一类广谱抗生素，常被应用于畜牧养殖业中，其药物残留会严重危害人体健康。目前国内对四环素类药物残留问题越来越重视，检测其残留量的方法成为研究的重点，同时国家也制定了相关的检测。该文对国内几种四环素类药物残留的主要检测方法的优缺点进行了比较和研究。 关键词:四环素类药物残留;检测方法;比较 中图分类号:S859.84 文献标识码:B 文章编号:1007-273X(2013)07-0063-04 四环素类药物是由放线菌产生的一类广谱抗生素，对革兰氏阳性及阴性细菌、衣原体、支原体和立克次氏体等均有良好的抑制作用。四环素类抗生素主要包括6种，即金霉素、土霉素、四环素、强力霉素(多西环素)、美他环素和米诺环素。其中前3种是天然品，后3种是人工半合成品，又称新四环素。 目前，我国在养殖生产环节中普遍存在滥用、乱用药物的不良现象，危害了人民群众的身体健康。四环素类药物在动物源性食品中的残留问题日益严重，已引起相关部门的高度重视。药物残留问题严重影响了我国在国际市场中的正常贸易，阻碍了畜牧业的健康发展。 1 四环素类药物残留对人体的危害 抗生素类药物的长期过量使用会导致细菌产生交叉耐药性。长期食用 含抗生素类药物残留的食物会导致人体内耐药性细菌的增多，人体本身的耐药性也会增强，抗生素的药效会不断降低，使用正常的剂量可能达不到理想的药效，必须不断加大给药剂量才可能产生药效，严重时甚至会完全失效，从而加大治疗疾病的困难性。 人们食用有药物残留的食品后可能出现中毒反应，如四环素类抗生素易阻碍儿童牙齿发育和骨骼生长，敌百虫在一定条件下会形成具有剧烈毒性的敌敌畏，氯霉素则可能引起颗粒性细胞缺乏症和再生障碍性贫血。某些药物残留极易对人体和动物产生包括致癌、致畸、致突变的“三致”作用。 四环素类药物易与人体中的钙结合，会在骨骼和牙齿中沉积，抑制骨骼和牙齿的生长发育，尤其对胎儿和婴幼儿的影响较大，还可导致牙齿持久染色变黄，俗称四环素牙。四环素类药物可在肝脏中沉积，长期累积会造成肝脏和肾脏的损伤。此外，四环素类药物还具有刺激性，可抑制蛋白质的合成，甚至有时产生致过敏反应。国家目前对动物源性食品中的四环素类药物残留限量有严格的规定，并相继开展四环素类药物残留检测方法的研究。 2 国内兽药残留分析技术 兽药残留分析是研究动物组织和动物样品中残留兽药组分的分析技术。其具有以下几个特点:需检测的物质组分浓度极低，大多数的残留浓度水平为1 ,1 000μg/kg;药物在动物体内经吸收、分布、代谢和排泄浓度变化较大，含量不稳定;检测药物残留的样品一般为动物组织和动物产品，其成分复杂，其中含有较多的干扰杂质，对检测造成一定的影响， 能否将杂质和待测药物分开是兽药残留分析中存在的主要问题。由于动物种类不一，动物体各组织的位置不一样，其组成成分有极为明显的差异，杂质干扰的程度与杂质峰出现的时间均有差别，所以兽药残留检测方法的通用性差。 现代的残留分析的发展方向是追求更高的灵敏度、更低的检测限;分析仪器的集成化、微型化和便携化;高选择性;多残留分析;联用分析;在线分析;现场快速分析等。 3 国内四环素类药物残留量的检测方法与比较 四环素类抗生素具有抑菌范围广、抗菌作用强、价格便宜等优点，在养殖业中被普遍应用，但是在防治动物疾病的同时，也带来一些负面的影响。抗生素类药物的残留日益严重，逐渐危害到人体的健康。国内外目前对四环素类抗生素的残留问题都十分关注，很多专家学者都在研究四环素类抗生素残留的检测方法。随着检测技术的不断发展，检测的药物种类逐渐增多，检测限越来越低，检测方法也越来越简便。 目前国内无公害水产品中四环素、金霉素、土霉素的最大残留限量均为100 μg/kg。中国农业部第235号公告中也规定了四环素、金霉素、土霉素的最大残留限量均为100 μg/kg[1]。欧共体对四环素类抗生素类在各类食源性动物组织中的最大残留限量是:动物肝脏600 μg/kg，卵200 μg/kg，肌肉100 μg/kg，乳汁100 μg/kg。联合国粮食与农业组织/世界卫生组织食品法典委员会制定在鱼和有壳类的肌肉中四环素、土霉素、金霉素的最高残留限量为200 μg/kg。美国食品药品监督管理局规定进口水产品中土霉素最高残留限量是10 μg/kg。 四环素类抗生素残留的检测方法主要有高效液相色谱法和高效液相串联质谱法。由于液质联用仪器昂贵，成本较高，尽管其具有精密度高、同时检测的药物种类更多的优点，但仍然不如高效液相色谱法普遍。下面简述几种国内现有的检测四环素类抗生素残留的方法。 3.1 畜禽产品中四环素类药物残留的检测 GB/T 5009.116-2003 畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定(高效液相色谱法)[2]:以5%高氯酸溶液为提取液，振荡离心，取上清液过0.45 μm滤膜，即可上机检测。该方法色谱柱选用ODS-C18柱，流动相为乙腈:0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH2.5)=35:65，流速是1.0 mL/min，检测波长为355 nm，柱温为室温。该方法检出限为土霉素0.15 mg/kg，四环素0.20 mg/kg，金霉素0.65 mg/kg。 GDFB 234-2004 动物源性食品中四环素族残留量的检验方法 高效液相色谱法[3]:该方法中检测的四环素种类是土霉素、四环素和金霉素。这3种四环素类抗生素是目前国内检测最多的几种四环素类抗生素。GDFB 234-2004标准中采用紫外检测器，色谱柱选用C18柱，流动相为乙腈:0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH2.5)=23:77，流速是1.0 mL/min，检测波长为355 nm，柱温25 ?。该方法采用5%高氯酸溶液作为提取液，离心后上清液过Oasis HLB萃取小柱，最后用甲醇洗脱，定容后作为供试品，其最低检测浓度是土霉素0.02 mg/kg，四环素0.04 mg/kg，金霉素0.04 mg/kg。 农业部958号公告-2-2007 猪鸡可食性组织中四环素类残留检测方法-高效液相色谱法[4]:该方法主要适用于猪、鸡的肌肉、肝脏和肾脏组织，检测的药物种类有四环素、土霉素、多西环素。样品经提取后离心，上清 液过Oasis HLB萃取小柱，洗脱液水浴吹干后用草酸溶液复溶。该方法选用C18柱，检测波长为355 nm，柱温35 ?，流动相为0.01 mol/L草酸溶液:乙腈:甲醇，梯度洗脱，0,10 min 3者的比例为83:11:6，10,25 min 3者的比例为60:30:10，流速为1.0 mL/min。该方法在肌肉中的检测限均为10 μg/kg，定量限均为20 μg/kg;在肝脏中的检测限均为25 μg/kg，定量限均为50 μg/kg;在肾脏中的检测限均为30 μg/kg，定量限均为50 μg/kg。回收率在70%,110%。 农牧发[1998] 17号 金霉素在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法[5]:此方法适用于鸡和猪的肌肉、肝脏、肾脏和脂肪的检测。样品经提取、离心后过C18柱，用6 mL 0.01 mol/L草酸-甲醇溶液洗脱，用水定容至10 mL，过滤后即可上仪器检测。该法选用C18色谱柱，检测波长为350 nm，流动相为甲醇:乙腈:0.01 mol/L草酸溶液=1.5:1.5:2.0(pH=2.0)，流速是1.5 mL/min，该方法的回收率为80%?20%，批内变异系数?10%，批间变异系数?15%。 GB/T 20764-2006可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定 液相色谱-紫外检测法[6]:该方法适用于牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和兔肉组织的残留检测。方法中采用紫外检测器，检测波长为350 nm，色谱柱是Mightsil RP-18 GP，柱温25 ?，流动相的成分为乙腈:甲醇:0.01 mol/L草酸溶液=2:1:7。该标准中4种药物的检出限均为5 μg/kg。其实验步骤为样品经提取离心，上清液过Oasis HLB萃取小柱和羧酸型阳离子交换柱，经流动相洗脱后经液相色谱-紫外检测器检测。土霉素的平均回收率为84.6%,96.8%，四环素的平均回收率为75.1%, 89.3%，金霉素的平均回收率为77.0%,90.8%，强力霉素的平均回收率为82.2%,84.9%。 农业部1025号公告-12-2008 鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测 液相色谱-串联质谱法[7]:该标准适用于猪肉、鸡肉中四环素、土霉素及金霉素的残留检测。方法中样品经提取、离心后过Oasis HLB萃取小柱，用甲醇洗脱，氮气吹干后用30%甲醇水溶液1.0 mL溶解残余物，过滤后作为供试品。该法选用色谱柱Xbridge C18色谱柱，柱温20 ?，流动相为A:0.3%的甲醇乙腈溶液，B:0.3%的甲酸水溶液，梯度洗脱:0,10 min，10%A线性变化至35%A ;10,15 min，35%A线性变化至10%A;15,25 min，10%A。流速为0.2 mL/min。质谱条件选用电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监 ，源温80 ?，雾化温度200 ?，锥孔气流速:50 L/h，测，电离电压2.5 kV 雾化气流速310 L/h。该方法检测限为5 ng/g，定量限为10 ng/g，回收率在60%,120%。 GB/T 5009.116-2003主要针对的是畜禽肉中的四环素类抗生素残留检测。该方法中使用5%高氯酸溶液作为提取液，对除土霉素、四环素和金霉素之外的其他四环素类药物的提取、回收率较差，且该方法中样品净化步骤较为简单，对干扰杂质的去除不彻底，影响目标药物的检测。农业部958号公告-2-2007中的提取液可以提取大多数四环素类药物，提取效果好，且在检测过程中，将洗脱液吹干后用草酸复溶可以降低检测基线对目标药物的干扰，同时该方法选用梯度洗脱，可以达到很好的分离效果。GB/T 20764-2006可以同时检测4种四环素类药物，检测种类较多。在样品纯化过程中使用了Oasis HLB柱代替以前常用的C18色谱柱，增加类羧酸型阳 离子交换柱净化，步骤虽然较复杂，但净化效果比较好，样品基质杂质干扰小。农业部1025号公告-12-2008用的是液相色谱-串联质谱法，检测限和定量限均比高效液相色谱法低，具有高灵敏性、分析时间快等优点。 王蕾等[8]建立的高效液相色谱法可测定7种四环素类药物残留。该法采用DiamonsilTMC18ODS色谱柱，检测波长为270 nm，流速为1.0 mL/min，甲醇:乙腈:0.01mol/L草酸为流动相梯度洗脱。虽然该方法并没有对任何实际样品中7种四环素类抗生素的残留进行实际检测，但是该方法的建立对实际样品的分析提供了一定的参考。该研究方法中检测的四环素类药物种类较多，流速比较快，如需检测实际样品中7种四环素类药物残留量时，会有某些四环素类药物和样品基质中的杂质分离效果不理想，所以在实际操作中需要对流速、样品纯化等进行适当的调整，以达到满意的分离度。 3.2 水产品中四环素类药物残留的检测 黄志勇等[9]建立了高效液相色谱法测定水产品中四环素、土霉素、金霉素残留量的方法。该方法采用高效液相色谱仪-紫外可见检测器，反向色谱柱，以4%高氯酸溶液作为提取液，流动相为乙腈:0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 2.8)=18:82(V/V)，流速为1 mL/min，检测波长为355 nm，柱温40 ?。最低检测限为土霉素45 μg/kg，四环素41 μg/kg，金霉素80 μg/kg。平均回收率为70.0%,90.0%。该方法纯化步骤简单，适用于样品杂质相对较少的水产品，如使用同种方法检测畜禽类等其他样品组织成分相对复杂的样品时，其样品纯化效果不佳，且该方法中检测的四环素类药物种类较少，且都是国内检测方法中最常见的种类。 3.3 蜂蜜中四环素类药物的检测 GB/T 18932.4-2002 蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法液相色谱法[10]:该方法采用的是紫外检测器，色谱柱选用的是Bondapak C18，检测波长为350 nm，柱温25 ?，流动相的成分比例为乙腈:甲醇:0.01 mol/L草酸溶液=20:10:70，流速为1.5 mL/min，进样量100 μL，4种药物的检出限均为10 μg/kg。其具体步骤是以30 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液(pH4.0)为提取液溶解样品，离心，上清液过Oasis HLB萃取小柱，用乙酸乙酯洗脱样品，洗脱液再过羧酸型阴离子交换柱，经流动相洗脱后供液相色谱检测。此方法与GB/T 20764-2006中的样品纯化步骤有部分类似，其检测的四环素类药物种类相同，均为土霉素、四环素、金霉素、强力霉素。在样品纯化过程中同样使用了Oasis HLB柱代替以前常用的C18色谱柱，增加类羧酸型阴离子交换柱净化，净化效果比较好，样品基质杂质干扰小。 3.4 牛奶中四环素类药物残留的检测 农业部1025号公告-20-2008 动物性食品中四环素药物残留检测酶联免疫吸附法[11]:该方法是在样品组织中加入8.0 mL柠檬酸缓冲液提取其中的四环素类药物，涡旋混匀后振荡30 min，10 000 r/min高速离心10 min，取上清液5.0 mL过C18固相萃取小柱，用1.0 mL 20 mmol/L草酸-甲醇溶液(取草酸1.8 g，加甲醇溶解并稀释定容到1 000 mL)洗脱，用稀释液稀释后供酶联免疫法测定。其在肌肉组织中的检测限低于15 ng/g，添加浓度为100 ng/g样品其回收率为40%,120%。该方法适用于牛奶，牛、猪、鸡的肌肉，猪肝脏和带皮鱼肉中四环素、土霉素、金霉素及 强力霉素残留的检测，其检测结果并不精确，只适合于快速筛选大量样品。 4 小结与讨论 目前国内研究四环素类药物残留检测方法有很多，使用的方法有高效液相色谱法、液质串联法、薄层色谱法、酶联免疫吸附法等。提取液多采用弱酸性溶液，如5%高氯酸、5%三氯乙酸和EDTA缓冲液。样品纯化一般使用C18或Oasis HLB萃取小柱，但在GB/T 18932.4-2002和GB/T 20764-2006两种方法中样品纯化过程同时使用了Oasis HLB萃取小柱和羧酸型阴/阳离子交换柱，净化步骤虽然复杂了，但是净化效果更好。流动相大多选用乙腈:磷酸二氢钠和乙腈:甲醇:草酸溶液，且pH需调节至酸性。 上述的几种四环素类药物残留的检验方法中以高效液相色谱法最为普遍，具有灵敏度高、稳定性好、重现性好等优点，但是检验过程中受样品基质中的杂质干扰较大，可同时检测的药物种类偏少，检测多种四环素类药物时分离度不理想，必要时使用梯度洗脱才能达到理想的分离效果。液相色谱-串联质谱法具有更高的灵敏度，可以达到更低的检出限和定量限，检测过程中受样品基质的干扰较小，可以同时检测更多种类的四环素类药物，但是仪器成本较高，样品纯化过程更为繁琐。其他的检测方法一般适合筛选样品，不适合精确的定量检测。 目前检测四环素类药物的种类集中在金霉素、土霉素、四环素，对强力霉素、美他环素和米诺环素等新四环素的检测方法研究较少，特别是缺乏同时检测4种以上四环素类药物残留的方法。检测的样品种类也以畜禽产品居多，水产品、蜂蜜和牛奶中的四环素类药物残留的检测方法较少， 且能检测的四环素类药物种类较少，在今后的工作中应加强对这方面的研究，可尝试通过调整色谱条件和改进样品处理方法来同时检测不同基质中多种四环素类药物残留，以满足不同动物源性组织中四环素类药物残留量检测的需要。 参考文献: [1] 中华人民共和国农业部公告第235号.动物性食品中兽药最高残留限量[S].2002. [2] GB/T 5009.116-2003 畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的检测(高效液相色谱法)[S].2003. [3] GDFB 234-2004 动物源性食品中四环素族残留量的检验方法 高效液相色谱法[S].2004. [4] 农业部958号公告-2-2007 猪鸡可食性组织中四环素类残留检测方法-高效液相色谱法[S].2007. [5] 中华人民共和国农业部.金霉素在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法[S].1998 [6] GB/T 20764-2006 可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定 液相色谱-紫外检测法[S].2006. [7] 农业部1025号公告-12-2008 鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测 液相色谱-串联质谱法[S].2008. [8] 王 蕾，徐智秀，张晓松等.反向高效液相法快速测定7种四环素类抗生素[J].分析化学研究简报，2003，31(1):52-54. [9] 黄志勇，蔡洪基，黄高凌，等.水产品中四环素类抗生素残留量 的高效液相色谱测定方法[J].福建分析测试，2005，14(1):2093-2105. [10] GB/T 18932.4-2002 蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法 液相色谱法[S].2002. [11] 农业部1025号公告-20-2008 动物性食品中四环素药物残留检测 酶联免疫吸附法[S].2008.