油茶籽粕中提取蛋白质的工艺研究[优质文档]

油茶籽粕中提取蛋白质的研究[优质文档] 仲恺农业学院 毕 业 论 文 油茶籽粕中蛋白质的提取工艺研究 姓 名 林华剑 院,系， 轻工食品学院 专业班级 食品质量与安全2008级(2)班 学 号 200810724228 指导教师 于辉 职 称 讲师 论文答辩日期 2012年5月7日 仲恺农业工程学院教务处制 学 生 承 诺 书 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。其中的实验数据全都是通过实验而得来的，没有抄袭别人的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。如违反上述要求，本人愿承担一切法律后果。 承诺人: 年 月 日 摘 要 本论文以油茶籽粕为原料，采用响应面设计，优化了油茶籽粕蛋白质的碱提酸沉法提取工艺，并在碱提的时候加入超声波辅助提取。响应面优化结果表明，油茶籽粕蛋白质的最佳提取工艺参数为:碱提工序油茶籽粕粒度为80目，料液比为1:25，pH值为11，超声波作用功率为800W，超声波作用时间为30min。在此条件下，油茶籽粕蛋白质的提取率为54.49%。 关键词 油茶籽粕 蛋白质 提取 超声波 目 录 1 前言..................................................... 1 1.1 国内植物蛋白质资源利用情况............................ 1 1.2 开发植物蛋白质资源的必要性............................ 1 1.3 蛋白质的分离纯化...................................... 2 1.4.2 油茶籽蛋白氨基酸组成................................ 5 1.4.2 油茶籽粕国内外研究情况.............................. 6 1.4.3 本论文研究的意义、目的及内容........................ 6 2 实验材料和方法.......................................... 7 2.1 实验材料............................................... 7 2.1.2实验原料 ............................................. 7 2.1.3主要试剂 ............................................. 7 2.1.4主要仪器设备 ......................................... 8 2.2 实验方法.............................................. 8 2.2.1 油茶籽粕基本组成成分测定............................ 8 2.2.2 油茶籽粕蛋白的提取工艺流程.......................... 8 2.2.3 油茶籽粕蛋白等电点的测定........................... 10 2.3 影响油茶籽粕蛋白提取率的单因素实验................... 10 2.3.1 碱提工序中油茶籽粕粒度对蛋白质提取率的影响......... 10 2.3.2 碱提工序中料液比对蛋白质提取率的影响............... 10 2.3.3 碱提工序中浸提液pH值对蛋白提取率的影响............ 10 2.3.4 碱提工序中超声波作用功率对蛋白质提取率的影响....... 10 2.3.5 碱提工序中超声波作用时间对蛋白质提取率的影响....... 11 2.3.6 碱提工艺的优化..................................... 11 2.3.7 酸沉............................................... 11 3 结果与............................................. 11 3.1 油茶籽粕基本组成成分测定结果......................... 11 3.2 油茶籽粕等电点的测定结果............................. 11 3.3 碱提工序中油茶籽粕粒度对蛋白质提取率的影响........... 12 3.4 碱提工序中料液比对蛋白质提取率的影响.................. 14 3.5 碱提工序中浸提液pH值对蛋白提取率的影响.............. 15 3.6 碱提工序中超声波作用功率对蛋白质提取率的影响......... 16 3.7 碱提工序中超声波作用时间对蛋白质提取率的影响......... 17 3.8 碱提工序的工艺条件优化............................... 17 3.8.1 响应面二次方程数学模型的建立及最佳化分析........... 17 3.8.2 因素间的交互影响................................... 20 3.9 酸沉蛋白质得率....................................... 22 4 结论与展望............................................. 23 4.1 结论................................................. 23 4.2 展望.................................................. 23 参考文献.................................................. 24 Abstract .................................................. 25 致 谢.................................................. 26 仲恺农业工程学院毕业论文(设计)成绩评定表 ................................................. 27 1 前言 1.1 国内植物蛋白质资源利用情况 我国是一个农业大国，历史上由于畜牧业不发达，植物性蛋白食品在我国一直占据着较重的地位。据1992年联合国粮农组织估算，我国每人每天食物供应中，蛋白质为67.4g,d(其中植物蛋白占88.8,，动物蛋白占l1.2,。低于世界 [1]人口平均供给水平(70.8g,d)，尤其是完全蛋白质供给量更低。 随着国民经济和畜牧业的发展，我国蛋白质食品供给的量和质都有了很大的发展。作为一个农业大国，具有利用植物蛋白质的明显优势，植物蛋白质种类多、资源丰富，主要有来自米麦等谷物蛋白、油料种子及其饼柏蛋白质、红花蛋白质、芝麻蛋白质、椰子蛋白质、籽粒苋蛋白质等，还有新开发出的一些其他蛋白质资 [2]源，如单细胞蛋白质、螺旋藻等。 由于我国人口众多，其发展水平远不能满足人民生活的需要。据估计，到2012年，我国人均占有粮食也只能徘徊在450,550kg左右，而不会有大的突破。这就是说，我国不可能拿出更多的粮食作饲料，发展养殖业大量地增加动物蛋白质的供给量。所以，我国必须走以发展植物蛋白加工业为主，以发展畜、禽、鱼 [3]养殖业为辅的道路。同时，采取有效措施增加脂质和蛋白质的有效供给，也是解决我国16亿人口在2030年的食物需求，保持基本营养平衡的最优先发展领域[4]。 1.2 开发植物蛋白质资源的必要性 当今世界，由于全球经济的快速发展，人们生活水平得到了极大地提高和改善，对肉、蛋、奶、禽、鱼的需求量成倍的增长，促使畜禽、水产养殖业的发展迅猛，造成了饲养畜禽所需饲料原料资源的紧张和短缺，特别是蛋白质资源更为紧张。 我国是世界第一人口大国、农业大国，以世界7%的土地、养活着世界22%的人口，多年来我国粮食总产量维持在4.5亿吨,4.9 亿吨，人均粮食占有量为400kg左右，只有美国的1/3。近5年来,我国粮食总产量连年下降，2003 年已从1998 年的5.1亿吨下降到4.3 亿吨。随着我国养殖业连续20 年来以平均9%以上的高速度增长，畜牧主产区的饲料资源短缺问题也将越来越严重，尤其是蛋白 质饲料资源近年年缺口将达到3000 万吨以上。目前，我国饲料年产量已达7000余万t，若按蛋白质平均含量16,计算，年需100,的蛋白质1100多万吨。能量饲料中蛋白质一般含量8,左右，在全价饲料中一般占到65,，就是这样也只能满足蛋白质需求量的400万吨左右，还短缺700余万吨纯蛋白。众所周知，蛋白质饲料中蛋白质含量平均按40,计算，最终还缺1750万吨蛋白质饲料。据计算，目前全国各种饼粕、血粉、饲料酵母、羽毛粉和国产鱼粉等总合起来也仅能满足70,,80,，余下的20,,30,必须依靠进口和国内资源进一步开发利用。当前若依靠进口蛋白质饲料是不现实的，如何把现有的蛋白质资源充分合理地利用，如何进一步开发新的蛋白质资源，愈来愈成为饲料工业迫切需要解决的问题。 1.3 蛋白质的分离纯化 1.3.1 蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 1.3.1.1 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等)。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量 NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔/升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 1.3.1.2 有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内(度为10%，40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 1.3.2 蛋白质的分离纯化 1.3.2.1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶;当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低，更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升)，在这一溶 解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸)，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 1.3.2.2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(SepHadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。 1.3.2.3 根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。 离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂 上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 1.3.2.4 根据配体特异性的分离方法,亲和色谱法 亲和层析法(aflinity chromatograpHy)是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离(Separation)，提纯(Purification) 和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 1.4 油茶资源简介 1.4.1 油茶资源概况 油茶 (CamelliaOleifera)为常绿小乔木，属茶科，山茶属，是我国南方丘 陵地区的一种优良的木本油料植物。我国是产茶大国，仅油茶林的种植面积就达 2400万hm，是世界上油茶品种最多、分布最广、油茶籽产量最高的国家，年产油茶籽约60余万吨、茶油巧万吨、油茶籽副产品一油茶籽粕的年平均产量约为39.71万吨。油茶籽粕中蛋白质含量约为12%-15%，其氨基酸组成为16种，其中7种为人 [5]体必需氨基酸，组氨酸和精氨酸两种半必需氨基酸含量也较高。因此，油茶籽粕蛋白具有很高的经济价值，可将其作为生产蛋白饮料、冲调食品、焙烤食品的蛋白质强化剂以及作为酱油等发酵产品的蛋白原料。另油茶籽蛋白经酶解还可制 [6]备功能性多肤。 1.4.2 油茶籽蛋白氨基酸组成 [7]表1-1油茶籽粕蛋白的氨基酸含量分析结果 氨基酸含量(g/100g纯蛋白氨基酸含量(g/100g纯蛋名称 名称 质) 白质) 天冬氨酸 4.44 脯氨酸 1.76 丝氨酸 1.96 酪氨酸 1.34 谷氨酸 9.67 缬氨酸 1.70 甘氨酸 2.00 蛋氨酸 1.42 组氨酸 0.83 赖氨酸 1.78 精氨酸 5.10 异亮氨酸 1.84 苏氨酸 1.62 亮氨酸 3.28 丙氨酸 2.40 苯丙氨酸 2.24 由表1-1可知，油茶籽粕中蛋白氨基酸含量比较丰富，其中谷氨酸和精氨酸这两种具有重要生理功能的氨基酸含量比较可观。 1.4.2 油茶籽国内外研究情况 油茶籽的综合利用早在20世纪30年代就开始研究，而真正开始形成生产规 模并得到实际应用是近十年来的事情。但是油茶籽的综合利用研究仍然很欠缺， 有些地区只是把茶籽榨油，没有深度开发利用，造成了极大的浪费。随着科学技术的不断发展，对油茶籽的有效成分的研究不断深入，油茶籽的开发利用日益受到重视。油茶籽可开发出茶油、茶皂素、茶籽饼等产品，其用途十分广泛，可产生较大的经济效益和社会效益。 1.4.3 本论文研究的意义、目的及内容 研究意义、目的 我国是种植油茶的主要产区，具有优越的自然条件和社会经济条件。油茶的品种、土壤、加工工艺等都对茶油品质有重要的影响，但目前研究不多、也不够深入。本课题通过调查我国不同产地，不同土壤，不同品种的油茶籽与茶油质量的关系，筛选出几种品质较好的茶籽，并提出可能对茶油品质有影响的因素;并通过对加工环节、加工工艺的研究，了解影响茶油品质的加工因素，同时保留茶油提取过程中副产物的最大营养价值，最小程度地避免环境污染。这对提高茶油品质具有重要意义。 油茶籽粕是茶籽提取油脂之后的副产品，含有多种有用的工业用料，具有很 大的再生利用价值。如以茶饼粕为原料提取茶皂素，多糖，蛋白等。我国有着 丰富的茶饼粕资源，但是茶饼粕的利用率却非常低，传统的利用方法是将茶饼 粕除去茶皂素后俗称脱毒作为动物饲料直接喂养动物，或者将茶饼粕投入鱼塘 中清塘消毒，茶饼粕中营养成分利用率低。还有大量茶饼粕甚至直接被焚烧掉， 肥田或作为废弃物丢弃，造成资源严重浪费，可见合理利用茶饼粕是急需解决 的问题。提取油茶籽粕的工艺研究可以提高油茶籽粕的再利用率，对油茶籽粕的再利用具有重大意义。 本论文研究内容 (1)分析油茶籽粕中的油脂、淀粉、灰分、粗纤维、蛋白质等含量，充分了解 其各种成分的含量，以便确定其研究价值。 (2)重点提取蛋白质，通过不同的方法测定，通过多次平行的方法，得出样品准确的蛋白质含量。 (3)通过改变浸提时的不同单因素条件(颗粒大小、pH值、料液比、超声波作用时间、超声波作用功率)，观察其对蛋白质提取率的影响，并得出最优条件。 (4)碱浸提时，加入超声波，观察其会否提高样品的蛋白质提取率。 (5)更变超声波的单因素(作用时间、功率等)，观察其蛋白质提取率的变化，并找出最优的作用条件。 (6)通过三因素三水平响应面优化实验，找出油茶籽粕中蛋白质的提取的便捷、高效率工艺。 2 实验材料和方法 2.1 实验材料 2.1.2实验原料 油茶籽粕:试验室自制，原料经冷榨，低温浸提工艺脱脂处理。 2.1.3主要试剂 氢氧化钠 盐酸 硼酸 硫酸铜 浓硫酸 过氧化氢 2.1.4主要仪器设备 表2-1主要仪器设备表 设备名称 生产厂家 磁力恒温搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司 酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司 紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司 数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂 冷冻干燥设备 博劢行仪器有限公司 电子天平 常熟双杰测试仪器厂 远红外消煮炉 四平电子技术研究所 凯氏定氮装置 瑞士Buchi公司 真空冷冻干燥设备 郑州南北仪器设备有限公司 2.2 实验方法 2.2.1 油茶籽粕基本组成成分测定 灼烧重量法，按 水分的测定:105?恒重法，按照GB/T 5497。灰分的测定: 照GB/T 5505。粗蛋白的测定:按照GB/T 5511。粗脂肪的测定:索氏提取法，GB/T 5512。粗纤维的测定:按照GB/T 5515。 2.2.2油茶籽粕蛋白的提取工艺流程 脱脂油茶籽粕一粉碎一碱提(pH:10)一离心(3 OOOr/min,20min )一上清液一酸沉一离心(3000r/min,20min)一冷冻干燥一蛋白质。 原粉 碱提 NaOH 离心 弃去 上清液 沉淀 过滤 酸沉 HCl 离心 弃去 沉淀 上清液 冷冻干燥 油茶籽粕蛋白 图2-1工艺流程图 [9]蛋白质提取率(%)=(提取液中蛋白质含量/油茶籽粕中蛋白质含量)X 100% 2.2.3 油茶籽粕蛋白等电点的测定 称取lOg样品，料液比为l: 20，用NaOH调pH至10，温度30?磁力搅拌浸提1h。离心(3000r/min,20min)取上清液，分取上清液7份各10ml，加盐酸调pH为3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0，离心(30001/min,20min)，弃上清液后称重，重复一次，绘出沉淀量与pH值的曲线图，图中沉淀量最大时的pH为蛋白等电点。 2.3 影响油茶籽粕蛋白提取率的单因素实验 2.3.1 碱提工序中油茶籽粕粒度对蛋白质提取率的影响 将脱脂油茶籽粕于105?下干燥1-2 h，取等量分别粉碎至40, 60, 80, 100,120目，按料液比l: 20投入pH 10的浸提液中，超声波功率600W，超声波作用10min,测定蛋白质的提取率。 2.3.2 碱提工序中料液比对蛋白质提取率的影响 将过80目筛的脱脂粕，取等量，按不同料液比浸提l: 10, l: 15, 1: 20, l:1: 30，调浸提液pH至10, 超声波功率600W，超声波作用10min,测定蛋白质的提取率，绘制图表分析。 2.3.3 碱提工序中浸提液pH值对蛋白提取率的影响 将过80目筛的脱脂粕，取等量，按料液比1: 20，用NaOH溶液调整浸提液的pH值分别为7, 8, 9, 10, 11,12,13 超声波功率600W，超声波作用10min,测定蛋白质提取率，绘制图表分析，得出最佳pH值。 2.3.4 碱提工序中超声波作用功率对蛋白质提取率的影响 将过80目筛的脱脂粕，取等量，按料液比1: 20，浸提液pH值为10，分别于超声波功率400W、500W、600W、700W、800W作用下，超声波作用10min，测定蛋白质提取率，结果绘制图表分析。 2.3.5 碱提工序中超声波作用时间对蛋白质提取率的影响 将过80目筛的脱脂粕，取等量，超声波作用功率600W条件下浸提60所示。按料液比1: 20，浸提液pH值为10，超声波作用时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，测定蛋白质的提取率，绘制图表分析，得出温度影响提取率的曲线。 2.3.6 碱提工艺的优化 在单因素实验的基础上，对影响油茶籽粕蛋白提取率的浸提液pH值、料液比、超声波功率进行响应面优化实验，分析最佳提取条件。 2.3.7 酸沉 取4g样品，在最优的碱提条件下进行碱提工序，取提取液离心(5000 r/min，20 min),得上清液用 1mol/L 的 HCl 溶液调节 pH 值至 4.0，离心(5000 r/min，20 min)后再用蒸馏水洗涤沉淀 2 次，最后用适量蒸馏水溶解沉淀(调 pH 至 4.0)，透析 24h 后冻干得茶籽粕蛋白样品。 3 结果与分析 3.1 油茶籽粕基本组成成分测定结果(表3-1) 表3-1油茶籽粕各主要成分测定结果 成分 含量(%) 水分 7.00 蛋白质 8.93 脂肪 1.39 灰分 2.30 粗纤维 10.83 3.2 油茶籽粕等电点的测定结果 表3-2油茶籽粕等电点的测定结果 pH 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 沉淀量(g) 0.752 0.853 0.892 0.753 0.427 0.172 0.16 图3-1等电点的测定结果 加酸至等电点是从提取液中分离蛋白的最简便方法(它能确保提取液中蛋白质最大量的沉淀。因此，等电点的选择是关键。由图表3-2可知:油茶籽粕蛋白的沉淀量在pH值4时最大，故油茶籽蛋白提取最佳等电为4。 3.3 碱提工序中油茶籽粕粒度对蛋白质提取率的影响(图3-2) 图3-2油茶籽粕粒度对提取率的影响 由图表3-2可知:粉碎粒度大小对蛋白的提取率会有不同的影响，其中过80目筛的效果最好，提取率达52.37,，当粉碎粒度超过100目时蛋白提取率有下降趋势，因此粉碎度取80为宜。 3.4 碱提工序中料液比对蛋白质提取率的影响(图3-3) 图3-3料液比对提取率的影响 由图表3-4可知:蛋白质的提取率随料液比的增加而升高(但当料液比增加到1:25以后蛋白提取率增加速度减缓，故取适当的料液比1:20较为适宜。 3.5 碱提工序中浸提液pH值对蛋白提取率的影响(图3-4) 图3-4pH值对提取率的影响 由图表3-5可知:随着pH值的增大，蛋白质的提取率增高，pH值大于10增高幅度明显减缓，且有研究表明。碱性太强可引起脱氨、脱羧、肽键断裂。引起胱 [8]赖反应，将氨基酸转变为有毒化合物。故浸提液的pH值取11为宜. 3.6 碱提工序中超声波作用功率对蛋白质提取率的影响(图3-5) 图3-5超声波功率对提取率的影响 由图3-5可知:蛋白质的提取率随超声波作用的功率升高而升高(但当超声波功率增加到700W以后蛋白提取率增加速度减缓，故取适当的超声波功率800W较为适宜。 3.7 碱提工序中超声波作用时间对蛋白质提取率的影响(图3-6) 图3-6超声波作用时间对提取率的影响 由图3-6可知:蛋白质的提取率随超声波作用的时间的增大而升高(但当超声波作用时间增加到30min以后蛋白提取率增加速度减缓，而过长的作用时间会使浸提液的温度升高，可能导致成分的改变，故取适当的超声波作用时间30min较为适宜。 3.8 碱提工序的工艺条件优化 3.8.1 响应面二次方程数学模型的建立及最佳化分析 由上述单因素实验可知，油茶籽粕蛋白质碱提过程中受多方面因素的影响，其中pH、液料比、超声波功率对油茶籽粕蛋白质提取率影响较大，因而上述3个因素，以蛋白质提取率为优化指标，采用响应面分析法对它们进行优化。响应面因素水平、实验结果、预测值与实测值回归方程图及响应面方差分析结果见表3-3、表3-4、表3-5、图3-8、图3-9、图3-10所示。 根据实验结果，由Design-Expert软件得出的蛋白质提取率关于三因素的二次回归拟合方程: -3蛋白质提取率=-347.17533+2.93516×A+64.77698×B+0.042666× C-5.75×10× 22-3-4-ABA×B-3.56260×10×A×C+7.425×10×B×C-0.05847×-2.97672×-7.40736×10 62×(其中A为液料比，B碱提pH值，C为超声波作用功率) C 表3-3碱溶提取响应面分析因素及水平表 水平 因素 -1 0 1 A-液料比 15 20 30 B-碱提pH值 9 10 11 C-超声波功率(W) 600 700 800 表3-4碱溶提取设计实验及结果 碱提pH实验序号 液料比 超声波功率(w) 蛋白质提取率(%) 值 1 25 11 600 53.70 2 20 10 700 48.70 3 20 11.68 700 41.73 4 15 9 800 39.40 5 20 8.32 700 32.43 6 20 10 700 48.73 7 20 10 700 49.40 8 28.41 10 700 51.30 9 15 11 800 43.47 10 25 9 800 49.56 11 15 9 600 38.93 12 25 11 800 54.23 13 25 9 600 48.32 14 20 10 531.82 40.78 15 20 10 868.18 49.80 16 20 10 700 49.60 17 11.59 10 700 31.43 18 15 11 600 45.14 19 20 10 700 47.80 20 20 10 700 49.60 当“Prob>F”值小于0.05即表示该项指标对模型影响显著，从表3-5可以看出，整体模型的“Prob>F”值小于0.05，表明该二次方程模型显著。在选定的水平条件下，各因素对模型影响大小为液料比 >pH值 >超声波作用功率。而从图3-7可知，模型预测值与实际值之间较为吻合，线性相关性较好，不存在显著差异，因此，该模型在本文选定的因素水平范围内，实际应用可行。 图3-7实测值回归方程图 根据碱溶提取响应面分析方差分析结果，取得油茶籽粕碱提的最佳工艺条件为pH值为10.38，液料比为25，超声波作用功率为800W，此时蛋白质提取率为54.49%。在上述预测工艺参数条件下，取pH值为10.5，液料比为25，超声波作用功率为800W，做5次平行实验，实测蛋白质提取率平均值为53.62%，与预测值无显著差异。这一结果证实实验优化的工艺参数是可行的。 表3-5 碱溶提取响应面分析方差分析结果 变异来源 平方和 自由度 均方 MS F值 P值 显著性 模型 646.69 9 71.85 5.24 0.0081 * A-pH值 382.62 1 382.62 27.89 0.0004 B-液料比 94.74 1 94.74 6.91 0.0253 C-提取时间 18.14 1 18.14 1.32 0.2770 AB 6.613E-003 1 6.613E-003 4.819E-004 0.9829 AC 1.10 1 1.10 0.080 0.7826 BC 1.02 1 1.02 0.074 0.7911 2A 30.79 1 30.79 2.24 0.1650 2B 127.70 1 127.70 9.31 0.0122 2 C0.079 1 0.079 5.758E-003 0.9410 残差 137.21 10 13.72 失拟项 134.73 5 26.95 54.37 ，0.0002 2.48 5 0.50 净误差 校正项 793.90 19 3.8.2 因素间的交互影响 图3-8液料比与pH值的交互影响 图3-8显示了液料比和pH值对蛋白质提取率的交互影响。在液料比一定的条件下，pH值在9,10.50范围内，随着pH值的增加有利于蛋白质提取率的提高;不过在pH值大于10.50时，这种增长趋势不仅不上升，反而会有所下降。从图也可看出，在pH值一定时，随着料液比的上升蛋白质提取率随之提高，在料液比大于25时，提取率基本趋于稳定，略有下降。 图3-9料液比与超声波功率的交互影响 图3-9显示了液料比和超声波功率对蛋白质提取率的交互影响。在pH一定的条件下，从图中可知，液料比增加，随着超声波功率的增长，蛋白质提取率都是先提高后趋平稳。超声波功率过高,浸提液的温度升高，淀粉颗粒中的淀粉分子从颗粒中分离出来，增加了体系的粘度,使淀粉和蛋白质不易分离，故蛋白质提取不再增加。 图3-10 pH值与超声波功率的交互影响 图3-10显示了碱提pH值和超声波功率对蛋白质提取率的交互影响。从图中可知，当pH值从9,10.5时，随着超声波功率的增加蛋白质提取率也随之增加，大于800W提取率基本趋于稳定。这是因为超声波功率增大，超声波具有波动和能量两种属性，对物质有空化效应和机械作用，能显著提高细胞内容物提取率，使蛋白质提取率增大。 3.9 酸沉蛋白质得率 茶籽粕蛋白的提取采用碱溶酸沉法。将在最优碱提条件下进行碱提工序后的提取液离心(5000 r/min，20 min)，得上清液用 1mol/L 的 HCl 溶液调节 pH 值至 4.0，离心(5000 r/min，20 min)后再用蒸馏水洗涤沉淀 2 次，最后用适量蒸馏水溶解沉淀(调 pH 至 4.0)，透析 24h 后冻干得茶籽粕蛋白质样品。 表3-6酸沉蛋白质得率 样品(g) 蛋白质样品(g) 蛋白质样品得率(%) 4 0.2325 5.81 最终所得干燥蛋白质样品的蛋白质含量为:80.25% 4 结论与展望 4.1 结论 (1) 考察了碱提工序pH、料液比、样品粒度、超声波作用功率和超声波作用时间5个单因素对油茶籽粕蛋白质提取率的影响。试验表明，碱溶工序pH、液料比、提取时间对油茶籽粕蛋白质提取率影响较大。 (2) 采用响应面法，优化了碱提工序pH、液料比、超声波作用功率对油茶籽粕蛋白质的提取工艺条件，确定了碱溶工序中油茶籽粕白质提取率的拟合方程。由Design-Expert软件得出的白质提取率关于三因素的三次回归拟合方程为: 蛋白质提取率=-347.17533+2.93516×A+64.77698×B+0.042666× 2-3-3-4AC-5.75×10×A×B-3.56260×10×A×C+7.425×10×B×C-0.05847×-2.97672× 22-6CB-7.40736×10×(其中A为液料比，B碱提pH值，C为超声波作用功率) 3) 根据响应面优化结果，油茶籽粕白质的最佳提取工艺参数为:碱提工( 序料液比为1?25，油茶籽粕粒度为80目，超声波作用时间为30min，超声波作用功率为800W，pH值为11.0，酸沉pH值为4.0。在此条件下，油茶籽粕蛋白质的提取率为54.49%。 4.2 展望 因学校实验室设备限制及研究时间仓促，未能对油茶籽粕蛋白质进行总氨基酸分析，以及利用电泳实验分析蛋白质的分布情况，这部分有待进一步研究。 另外，油茶籽粕还缺少对于家禽、家畜的营养、消化、生长、毒理试验研究，对油茶籽粕蛋白质的加工特性、功能特性也有待进一步深入研究。 参考文献 [1] 魏东等.螺旋藻——工业生产中的高新技术[J].中国食品工业, 1997, (1 ): 32,34. 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In these conditions, the extraction rate of protein reaches 54.49%( Key words: camellia seed meal ;protein;extraction;ultrasonics 致 谢 本论文是在于辉老师的悉心指导下完成的，从论文的选题、试验设计、到撰写修改等工作，都凝结着导师的心血和汗水，在论文完成之际，谨向导师于辉表示衷心的感谢～此外，在实验期间，曾得到曾晓房老师、陈悦娇老师、陈祖佑老师以及杨兵、张洁霞、林佳燕、李二丽等多位同学给予的支持和帮助。在此致以最真挚的谢意～ 整个大学期间，所有任课老师都为我付出了很多的心血，还有同学们的关心和帮助，在此，本人致以最由衷的感谢～ 仲恺农业工程学院毕业论文(设计)成绩评定表 姓 名 林华剑 学 号 200810724228 2012届 院(系)别 轻工食品学院 专业、班级 食品质量与安全082班 毕业论文(设计)题目 油茶籽粕中蛋白质的提取工艺研究 指导教师姓名、职称 于辉 讲师 指导教师评语及评分: 签名 年 月 日 评阅老师评语及评分: 签名 年 月 日 答辩记录: 1、赵老师:1)响应面优化分析与正交实验的区别, 答:正交实验偏向于试验条件的优化，对试验数据的分析。响应面优化实验，在数据分析的基础 上，建立了试验的模型。 2)单因素结果分析，以及原因。 答:按照各个单因素的结果，进行介绍，分析形成的原因。 2、杨老师:1)碱提工序中的原始pH值是多少, 2)酸沉蛋白质得率的结论与实验不统一，只有结论，没有具体的实验方案。 答:碱提工序中的统一pH值设定为10。由于我的疏忽没在实验方案的工艺流程上明示，论文的内容和结构也不够完善，会在接下来的论文修改上补充完整。 3、于老师:论文的题目不通顺。 答:按照老师给的建议，论文题目改为:油茶籽粕中蛋白质的提取工艺研究 4、赵老师:论文的格式在某些地方不太正确: 1)图表里横纵坐标的标示 2)英文摘要的个别标点与语法 3)排版不够统一 4)某些词语，在整篇论文中使用不统一，如:蛋白质与蛋白 答:会针对论文的格式，认真进行排版与修正格式。 答辩秘书: 年 月 日 答辩小组评价意见及评分: 答辩组长: 年 月 日 指导老师(40%) 评阅老师(20%) 答辩小组(40%) 总评分 等级 折算分 折算分 原始分 折算分 原始分 折算分 原始分 折算分 论文(设计)成绩 院系答辩领导小组 (委员会)审核意见 签章 年 月 日 注:1、论文(设计)成绩一栏中，折算分分别由指导老师(40%)、评阅老师(20%)、答辩小组(40%)给 出的原始分乘以各自百分比例所得。总评分由折算分相加所得。 2、“等级”:90分以上为“优秀”、80―89分为“良好”、70―79分为“中等”、60―69分为“及格”、 59分以下为“不及格”。