糖化血红蛋白检测原理及意义

糖化血红蛋白（HbA1c）测定的原理方法及临床意义综述 2007年3月19日           糖化血红蛋白（HbA1c）测定的原理方法及临床意义综述                                               冯念伦  范卫华 刘捍东                                          （山东省立医院  济南 250021） 糖尿病(DM),主要是2型糖尿病的发病率，目前在世界上无论发达国家还是发展中国家均明显增加，占免疫病的比率，在发达国家高达2-5%，而我国糖尿病的发病率亦达2-3%，并且每年还以1‰的速度增长。糖尿病是一种终生性疾病，其并发症已经成为病人至残和早亡的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。 有资料说美国用于糖尿病的治疗费约有1000亿美元，糖尿病已经成为世界各国的主要保健卫生问题，对糖尿病及其并发症防治的研究是2０世纪后２０年国际卫生保健研究的重点之一。 临床上广泛采用血糖参数来判定糖尿病，而血糖参数只代抽血时的血糖水平，对确诊有局限性。近年来的医学研究证明：血液中的糖化血红蛋白（HbA1c）浓度相对稳定，其浓度值能准确反映最近2-3个月期间的血糖水平，便于医生对糖尿病进行早期诊断；也可用于糖尿病人的血糖监控及慢性并发症的判断等，受到临床的广泛重视，目前我国各大、中型医院正逐渐开展糖化血红蛋白（HbA1c）占总血红蛋白（Hb）的百分含量的测定项目。有些发达国家已将HbA1c的测定列入中老年人的常规体检项目。测定HbA1c有多种方法，目前临床上比较常用的方法有两种：乳胶凝集反应法和离子交换高压液相色谱法；分别用生化分析仪和糖化血红蛋白自分析仪进行测定。 1、 糖化血红蛋白（HbA1c）的形成及特点 血液中红细胞内的血红蛋白Hb会在高糖的作用下发生缓慢的非酶促糖化反应, 血红蛋白Hb的β链N末端缬氨酸上的氨基与葡萄糖的醛基发生可逆的加成反应,，形成不稳定的中间产物--- 醛亚胺（前GHbA1c）迅速重排成不可逆的酮胺，然后缓慢重构形成HbA1c。 糖化血红蛋白HbA1c的特点： 1．1 糖化血红蛋白HbA1c的百分比含量与即时所检测到的血糖水平无关。 1．2 由于红细胞在外周血中的寿命是90 －120天，所以糖化血红蛋白HbA1c百分比反映了测定前２－３个月的血糖平均水平。而GHbA1c的合成始终在进行，其糖化程度与血液中的葡萄糖浓度及持续时间呈正相关；病人用药治疗后，较血糖、尿糖含量下降晚３－４周，糖化血红蛋白HbA1c的百分比含量是对糖尿病长期控制有重要意义的一项指标 。 2、 测定糖化血红蛋白HbA1c的方法 测定糖化血红蛋白HbA1c的方法有（1）离子交换高压液相色谱法 HPLC；包括：离子交换色谱及亲和色谱；（2） 微柱法；（3）免疫分析法，包括：放射免疫法、酶免疫法和乳胶免疫凝集法。（3） 电泳法 （4）电喷离子质谱等。 2.1、离子交换色谱分析法的原理：用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。  离子交换剂可以分成两种：阳离子交换剂和阴离子交换剂。     亲和色谱法是利用生物高分子能与相应的专一配基分子可逆结合的原理将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统。带有杂质的高分子分离目的物在一定条件下，能以某种次级键与已固相化的配基结合，而杂质则不吸附，除去杂质后变换条件，又可以使待分离的高分子物质重新解离，获得纯化。 化糖血红蛋白被一种牢固的但可逆的五环络合物所结合，通过它们的顺-乙二醇基被硼酸固定住。首先洗脱的是非糖化血红蛋白，随后用含有山梨醇的缓冲液将糖化组分洗脱下来，此缓冲液与结合在柱上的糖化血红蛋白竞争硼酸结合位点。 2.2、免疫分析法使用单克隆或多克隆抗体直接测定血红蛋白β-链上糖基化的N末端的4-8个氨基酸，因此对HbA1c上的糖基特异性好。 但是许多同源的糖化血红蛋白变体也有相同的N末端结构，从而对结果造成干扰。 2.3、电泳法的分析原理是：非糖化血红蛋白游离的氨基末端能与硫酸根反应，改变分子的电泳迁移率。而化糖血红蛋白不能与硫酸根反应，电泳迁移率不变。血红蛋白容易受到琼脂板介质中磺酸盐基团或以醋酸纤维膜作支持物的缓冲液中的硫酸右旋糖的硫酸盐基团作用，经过电泳分离，可以将糖化血红蛋白从血红蛋白中分离出来。 2.4、电喷离子质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)法  研究证明，ESI-MS法测出的是真正的HbA1c，而目前临床上使用的各种方法测出的实际上是一系列混合物，包括糖化的a链、a链和b链双糖化及b链其他部位被糖化的产物。因此，用ESI-MS法测出的数值要低于目前临床习用的各种方法。由于ESI-MS法对仪器设备的要求较高，目前尚难广泛用于临床。 3、 临床常用的测定糖化血红蛋白HbA1c的方法 3.1、乳胶凝集反应法 乳胶凝集反应法是利用抗原抗体直接测定总血红蛋白Hb中的糖化血红蛋白HbA1c的百分含量。目前有国内外几家厂商可以提供HbA1c测定的试剂盒。这种免疫反应是由被测血样品中的总Hb和HbA1c与试剂中的抗体结合而形成凝集，凝集量随HbA1c浓度的大小而变化。使用生化分析仪器来进行比浊测定HbA1c的浓度，采用终点法，生化仪通过测定反应液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出HbA1c占Hb的百分含量，测定时，仪器多采用660nm单色光做主波长，800nm单色光做副波长，通过曲线得出实测值。由于这种试验其标准曲线是非线性的，所以在测定前，首先用随试剂盒一起带有的5种不同浓度的定标液，做出5点非线性标准曲线。曲线和数值存在生化仪的贮存器中，测定样品时，实测出的吸光度值A与标准曲线比较，由仪器CPU求出实测样品中的HbA1c百分含量。乳胶凝集反应法测定HbA1c简便、不用增加仪器，可直接用自动生化分析对样品进行快速测定。该方法也可以用手工的方法，在酶标仪进行测定，是目前使用较多的方法。但是许多同源的糖化血红蛋白变体也有相同的N末端结构，所以乳胶凝集反应法其准确性和重复性均有欠缺。 3.2、离子交换高压液相色谱法HPLC 使用离子交换高压液相色谱HPLC（high pressure liquid chromatography）来测定HbA1c的百分含量目前被认为是分析HbA1c的金标准。采用HPLC方法工作的全自动糖化血红蛋白分析仪器，以其快速、简便、精巧、准确等特点，受到越来越多用户的欢迎。 3.2.1、 高压液相色谱分析的基本原理及发展史 色谱分析是一类利用混合物的各组分在不同相上的分配差别，在两相物质相对运动过程中，将混合物中的各种成份分离开的一种分析技术。液相色谱是以液体或固体为固定相，以液体为液动相的色谱法的总称。色谱法又叫色层或层析，这一技术在生命科学研究中用于生物活性物质的分析；生物活性物质是以混合物形式存在，人类血液中的蛋白质有上千种，只有把混在一起的被测蛋白分离出来，才能准确测定；在HbA1c的测定时，可以通过高精度HPLC，将HbA1c从Hb中分离出来，才能得到准确的数值。在生命科学研究中，活性物质的分离主要应用的是液相柱色谱。这种技术诞生于20世纪初叶，俄国化学家茨维特把植物色素混合液置于装有碳酸钙吸附剂的玻璃管顶端，用石油醚洗脱后，在玻璃柱上出现了几组颜色不同的色带，这些色带随着不断的洗脱，越分越开，先后从玻璃柱下端流出，茨维特把这样一种用流体洗脱色素混合液，使之通过碳酸钙做固定相从而实现分离的技术，起名叫“色谱法”。这种方法被推广用于分离许多混合物中的各种物质，被分离物质已和颜色无关了，但“色谱”分析的名称仍沿用至今。当然更贴切的名称应该叫“层析法”。早期的“色谱柱”体积大，做固定相的物质颗粒大，分离时需要大量的洗脱液。并且洗脱液靠重力流动，分离时间长，效率低。随着科学技术的进步，20世纪60年代，人们研制出新型液相柱，同时采用高压输液泵自柱上端为洗脱液加压，大大加速了洗脱液的流速，开发出相应的高灵敏度的检测器，新的分析仪器—高压液相色谱仪在70年代诞生，很快就占领了分析化学的舞台。特别是在生命科学的研究中，HPLC技术由于对被测物活性影响小，几乎可以测定生物医学中所有的非发挥性物质，如近年来利用离子交换HPLC法测定血液中的HbA1c的百分含量，被认为是糖尿病诊断的金标准。 3.2.2、离子交换HPLC法测定HbA1c 离子交换HPLC法，是利用能交换离子的材料为固定相来分离离子型化合物的方法。HbA1c的百分比测定使用阳离子交换柱；当一定量的全血样品被取样针吸入到进样装置内，在稀释部分被溶血，释放出红细胞中的血红蛋白Hb，并由稀释液稀释，稀释好的已经溶血的样品，由高压泵注入离子交换柱。柱内的固定相是最新开发的非多孔性，不溶和可渗透的交联高聚物，上面分布固定的带电荷基团和能游动的配衡离子；样品通过过滤器从交换柱顶端加入后，由三种不同浓度的盐洗脱缓冲液（流动相）洗脱，使样品向下移动。此时溶液中所含血红蛋白（Hb）的各种组份即与固定相上能移动的离子进行交换，样品中的血红蛋白多种组份在固定相上连续进行可逆的交换吸着和解吸作用，而3种不同离子浓度的盐液，形成线性梯度洗脱，洗脱液No1叫起始缓冲液，含低离子浓度的盐，洗脱液No2、No3缓冲液，其离子浓度依次增高很多，这种流动相离子浓度的改变对分离效果的影响非常明显，前面洗脱出来的组分分离效果好，色谱峰很窄，后面组分也能在很短时间内洗脱出来，大大缩短了分离时间；所以全自动血红蛋白分析仪，在1分多钟内、Hb中的多种成份被分离成6个部分，其中的HbA1c、HbF、HbA1被有效、精确的分离；由交换柱流出的Hb成分到达仪器的检测器，检测器内装有发射单色光的发光二极管，通过双波长可见光比色法测定HbA1c、HbF、HbA1三个参数。仪器的检测器检测出分离后HbA1c、HbF、HbA1组分的吸光度值，与HbA1c标准品吸光度值比较，分析计算出结果，最后以百分率表示的Hb组分结果与色谱图一起打印出来。 离子交换柱HPLC法对全血直接测定HbA1c，其批内和批间变异系数CV均可以小于1%（CV< 1%），结果精确，HbA1c检测结果不受存在的变异型血红蛋白及其衍生物的影响，特别适合于糖尿病人的监控。 4 平均血糖数值与糖化血红蛋白HbA1c的关系和换算 血糖 （mmol/L） >10 8- 10 < 8 4．7 6．3 8．2 10 11．9 13．9 HbA1c （ % ） > 8 7- 8 < 7 5．0 6．0 7．0 8．0 9．0 10．0 糖化血红蛋白HbA1c 正常值的参考范围：4.7 – 6.4 % 。 平均血糖数值的正常值的参考范围：3.9 – 6.3 mmol/L 。 5、糖化血红蛋白HbA1c的临床应用 糖化血红蛋白是一项说服力较强、数据较客观、稳定性较好的生化检查，不受偶尔一次血糖升高或降低的影响。能反应糖尿病患者2-3个月以内的糖代谢状况，同时与糖尿病并发症尤其是微血管病变关系密切，在糖尿病学上有重要的临床参考价值。 可以作为长期糖尿病人病情的控制指标；用于糖尿病的预测和筛查等。 5.1 、糖化血红蛋白HbA1c增高：糖尿病患者；用含葡萄糖的透析液作血透的慢性肾衰病人，地中海贫血和白血病病人亦增高。 5.2、HbA1c降低：溶血性及失血性贫血，慢性肾衰，慢性持续性低血糖症等。 5.3、作为糖尿病的病情监测指标 5.3.1、作为轻症、Ⅱ型、“隐性”糖尿病的早期诊断指标。 5.3.2、不是诊断糖尿病的敏感指标，不能取代现行的糖耐量试验。 5.3.3、可以列为糖尿病的普查和健康检查的项目。 5.4、当HbA1c ＞9％时，说明患者存在着持续性高血糖，可以出现糖尿病肾病、动脉硬化、白内障等并发症。临床经常以糖化血红蛋白作为监测指标来了解患者近阶段的血糖情况，以及估价糖尿病慢性并发症的发生与发展情况。 5.5、对预防糖尿病孕妇的巨大胎儿、畸形胎、死胎，以及急、慢性并发症发生发展的监督具有重要意义。 5.6、对于病因尚未明确的昏迷或正在输注葡萄糖（测血糖当然增高）抢救者，急查糖化血红蛋白具有鉴别诊断的价值；如果HbA1c％升高，则是尿糖性昏迷。 5.7、对于糖化血红蛋白特别增高的糖尿病患者，应警惕如酮症酸中毒等急性合并症的发生。  参考文献： 1、Krishnamuriti U,Stekfes MW,Glycohemoglbin:a primary predictor of the development or reversal of complications of diabetes mellitus.Clin Chem 2001;47: 2、Tominaga M,Kobayashi I,Kuwa K,et,al,Report of the Committee on Standardization of Labortory Testing Related to Diabetes Mellitus,National Survery on Glycohemoglobin,J Japan Diabetes Society 2001;44. 3、Kenneth E MD 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