巨细胞病毒DNA检测在筛查巨细胞病毒感染中应用

巨细胞病毒DNA检测在筛查巨细胞病毒感染中应用 巨细胞病毒DNA检测在筛查巨细胞病毒感 染中应用 作者单位,537100 广西贵港市妇幼保健院 通讯作者,钟伟明 【摘要】 目的 探讨荧光定量聚合酶链反应,FQ-PCR,方法检测婴儿尿液人巨细胞病毒,CMV,DNA在儿科CMV感染诊断中的价值。方法 对565例临床疑诊CMV感染患儿分别应用荧光定量聚合酶链反应,FQ-PCR,、酶联免疫法,ELISA,检测尿液CMV-DNA及血清CMV-IgM抗体。结果 FQ-PCR检测尿CMV-DNA的阳性率为42.83%,ELISA检测婴儿血清CMV-IgM抗体阳性率为20.18%。两种方法对CMV感染诊断符合率为76.46%,前者诊断阳性率显著高于后者,χ233.59,P<0.01,。结论 FQ-PCR检测尿液CMV-DNA是早期诊断婴儿CMV感染的敏感有效的方法。 【关键词】 荧光定量聚合酶链反应, 酶联免疫法, 巨细胞病毒 巨细胞病毒感染是由人巨细胞病毒,CMV,引起的病毒感染性疾病,可累及多脏器、多系统,临床症状多样且轻重不一。婴儿感染可导致黄疸、肝脾肿大、皮肤出血点及淤斑 1 等,重症病死率高,并可导致运动、听力、视力及智力等多种严重的后遗症,1,2,,因而受到儿科医生的极大关注。由于CMV感染临床表现的非特异性,所以敏感和可依赖的实验诊断指标显得非常重要。目前常用的实验室诊断方法有病毒分离、ELISA检测CMV特异性抗体、抗原血症pp65的检测及DNA的定量检测。不同的方法各有优缺点。本研究采用荧光定量PCR方法检测婴儿尿液CMV DNA,并与血清抗体检测进行比较,旨在探讨尿液CMV DNA定量检测的诊断意义。 1 资料与方法 1.1 一般资料 2009年7月,2010年10月在本院儿科住院的临床疑似CMV感染,3,的患儿565例。年龄14天,2岁。 1.2 标本收集 采集所有被检验者静脉血2 ml,3000 r/min,离心5 min分离血清,置4 ?冰箱保存,24 h内进行CMV-IgM检测。同时,留取所有被检验者尿液5,10 ml,-20 ?冰箱保存,24 h内进行CMV DNA检测。 1.3 试剂及实验设备 荧光定量PCR,FQ-PCR,检测,采用中山医科大学达安基因诊断公司CMV DNA荧光定量试剂盒。包括DNA提取液,单人单管反应液,CMV阳性,阴性对照。实时荧光定量PCR扩增仪,DA7600,,中山大学达安基因股份公司生产。CMV IgM抗体检测,采用 2 美国Hope公司ELISA试剂盒进行常规血清CMV IgM抗体检测。 1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理,计数资料比较采用卡方检验。以P,0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 疑诊CMV感染565患儿尿液中CMV DNA定量检测阳性242例,阳性率为42.83%。565例患儿血清中CMV IgM抗体检测阳性114例,阳性率为20.18%。两种检测均阳性108例,均阴性317例,二者对CMV感染诊断的一致率为76.46%。FQ-PCR方法检测尿液CMV DNA阳性率显著高于ELISA方法检测血清CMV IgM阳性率,两者比较,差异有统计学意义,χ233.59,P<0.01,。 2.2 感染年龄分布 疑诊CMV感染565患儿中尿液CMV DNA定量或血清中CMV IgM抗体检测阳性共248例,其中14,30天8例,1,3个月182例,4,12个月49例,1,2岁9例。 3 讨论 儿童巨细胞病毒感染多发生于婴幼儿期,巨细胞病毒感染是我国儿科婴儿期最为常见的一种肝脏疾病。表现为黄疸型、非黄疸型肝炎,轻中度肝脾肿大,常有不同程度淤胆,4,,严重的宫内感染可影响中枢神经系统导致发育畸形及生长 3 落后。CMV感染引起的疾病缺乏特异临床表现,诊断困难。实验室检查是诊断巨细胞病毒感染的重要手段。病毒分离作为“金标准”显然是不实用,无法广泛推广的。目前我国主要是以间接酶联免疫吸附法,ELISA,检测血清CMV IgM抗体作为实验室诊断指标。IgM阳性提示近期有CMV活动性感染或潜伏的病毒可能被激活。但是CMV抗体产生有一段“窗口期”,由于IgM抗体产生本身有滞后性,当患者被病原体感染后约2周后IgM抗体才能达到被检测到的水平。另一方面,有些患者,尤其是部分婴幼儿,免疫系统发育不完善,不能产生被测量的特异性IgM抗体或滞后产生IgM抗体,易造成假阴性结果。CMV IgM抗体检测阳性114例中,其中108例尿液CMV DNA检测阳性,说明FQ-PCR检测对于CMV活动性感染诊断有很好的敏感性。本文248例病例中有190例为30 d内感染,占76.61%,与文献报道婴幼儿期高发相符,5,。 FQ-PCR是目前准确和快速的微生物定量方法,6,,能早期、灵敏检测到病毒感染,甚至比出现临床症状的时间提前3,10 d,7,。且可以进行抗病毒治疗效果监测,8,。由于尿液标本取材方便、无创,易为家长和小儿接受。本研究中,FQ-PCR方法检测尿液CMV DNA阳性率显著高于ELISA方法检测血清CMV IgM阳性率,两种方法比较有显著性差异,χ233.59,P<0.01,,说明了尿CMV DNA定量检 4 测方法的敏感性高于血清CMV IgM抗体检测法。尿FQ-PCR检测CMV DNA可以提高小儿CMV感染的检出率。与定性PCR方法相比,实时荧光定量PCR采用完全闭管检测,无PCR后处理,避免了交叉污染,通过探针杂交进一步提高了特异性,检测信号实时检测产物,定量结果准确,重复性好,可用于体内CMV的动态监测。实时荧光定量PCR法测定尿CMV DNA 含量可用于临床早期快速诊断小儿CMV感染,对于指导临床治疗、评价观察抗病毒治疗的效果具有重要意义。 参 考 文 献 ,1, Leung AK,Sauve RS,Davies HD.Congenital CytomeGal-ovirus infection.J Natl Med Assoc,2003,95,3,,213-218. ,2, 王勇,陈珊,胡君,等.婴儿期特发性血小板减少性紫癜与人巨细胞病毒感染的关系.实用儿科临床杂志,2006,21,15,:1006-1007. ,3, 中华医学会儿科分会感染消化学组.巨细胞病毒感染诊断.中华儿科杂志,1999,37,3,:441. ,4, 王晓红,郭红梅,朱启锭,等.婴儿巨细胞病毒感染与胆道闭锁的关系.实用儿科临床杂志,2005,20,3,:274-275. ,5, 胡艳,陈黎,舒静,等.婴儿巨细胞病毒肝炎88例.实用儿科临床杂志,2009,24,19,,1496-1498. 5 ,6, Kuypers J,Wright N,Ferrenberg J,et al.Comparison of real-time PCR assays with fluorescent- antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children.J Clin M icrobiol,2006,44,7,:2382-2388. ,7, R isatti GR,Callahan JD,Nelson WM,et al.Rapid detection of classical swine fever virus by a portable Real-Time reverse Transcriptase PCR assay.J Clin Microbiol,2003,41,1,:500-505. ,8, 徐锦,陈剑平,丁韵珍,等.尿巨细胞病毒定量检测在 巨细胞病毒感染诊断中的意义.实用儿科临床杂志,2006,21 ,10,:596-597. ,收稿日期,2011-03-18, ,本文编辑,梅宏伟, 6