枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用

枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 山东农业大学学士学术论文 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 作者:2007级生物工程4班 陈聪 指导教师:马传营 技术员 摘要:介绍了生物菌肥的种类和特点，分析了菌肥在提高土壤肥力、协助营养吸收、促进矿质 营养释放、改善品质及增产和减少病虫害等方面的作用。分析了生物菌肥相对于化肥的优势以 及国内外对生物菌肥的研究情况，并对其发展进行了展望。枯草芽孢杆菌作为一种具有研究、 应用和商业价值的微生物菌种在生物菌肥的研究中起到了重要作用，近年来国内外对枯草芽孢 杆菌的研究应用有了很大的进展，利用其对玉米小斑病菌的拮抗作用可研发生产有效防治玉米 小斑病的生物菌剂。 关键词:生物菌肥;枯草芽孢杆菌;玉米小斑病菌;拮抗作用;生物防治 The application of Bacillus subtilis in bio-fertilizer Abstract: Describes the types and characteristics of bio-fertilizer, analyses the function of fertilizer to improve soil fertility, help nutrient absorption, promote the release of mineral nutrients, improve crop quality, increase crop production and reduce pests and diseases etc. Analyses the advantages of the biological fertilizer compared to the chemical fertilizers and the research situation in China and abroad, also discussed its development in the future. Bacillus subtilis as a kind of microbial strains has played an important role in the study of bio-fertilizer because of its research, application and commercial value, in recent years，the research and application of Bacillus subtilis in China and abroad has gained a great progress, using its antagonistic mechanism on Bipolaris maydis can produce new biological agents to effectively prevent the southern leaf blight of corn. Key words: bio-fertilizer; Bacillus subtilis; Bipolaris maydis ; Antagonism; Biological Control 1 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 1 引言 1.1 生物菌肥的发展 长期以来，由于我国在农业生产中大量使用化学肥料，使得所施肥料的利用率低，致使土壤板结、土壤微生物区系发生变化、食品质量不安全，还造成大量的经济损失和环境恶化等一系列的社会问，由于化学农药的大量使用，使病虫产生了抗药性，化肥农药的残留严重危害了人类健康。在当前农业可持续发展的形势下， [1]开辟微生物肥料部分替代化肥日益受到重视。生物菌肥是近年来发展起来的一种新型肥料，它是一种多元素肥料，主要由固氮菌、解钾菌及多种微量元素和腐殖酸组成。由于含有大量的微生物，生物菌肥主要以微生物生命活动的产物来活化土壤，改善作物营养条件和生长环境，另外，生物菌肥还具有改良土壤、抗旱、培肥地力、促早熟、抵抗病虫害等功效，还能解决土壤化肥农药残留等问题，从而发挥土壤的潜在肥力，提高农产品的产量和品质。 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。是一种好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，广泛存在于自然界中如土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。该菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用，在极端的条件下，还可以诱导 .[2]产生抗逆性很强的内源孢子由于该菌能产生耐热的芽孢，既易于生产，进行剂型 [3]加工，又易于存活，定殖与繁殖。枯草芽孢杆菌的批量生产简单，成本较低，施用方便，储存期长，而且其制剂的稳定性，与化学制剂的相容性和在不同植物、不同年份防治效果的一致性方面均优于不产生芽孢的细菌和真菌生防菌株，是一种较理想的生防微生物。 1.2 生物菌肥的种类及特点 狭义的生物肥料，是通过微生物生命活动，是农作物得到特定的肥料效应的制品，它本身不含营养元素，不可替代化肥。广义的生物肥料既含有作物所需的营养元素，又含有微生物制品，是生物、有机和无机的结合体，也可以说是利用高科技手段将野外环境中筛选出来的微生物经诱变、复壮后，再经工业发酵精加工而成的一种高含菌量的生物制品。 1.2.1 生物菌肥的分类 生物菌肥从作用上可分为:生物固氮菌剂;分解土壤有机物菌剂(有机磷细菌肥、综合细菌肥);分解土壤难溶性矿物质的菌剂(硅酸盐细菌肥料、无机磷细菌肥料);抗病与刺激作物生长的菌剂(抗生菌肥料)。 2 山东农业大学学士学术论文 从成分上可分为:单纯生物肥和有机-无机-生物复合肥。单纯生物肥只富含微生物，单独使用不能给农作物供给充足的营养，需与化肥或者有机肥混合使用;有机-无机-生物复合肥综合了各类肥料的特点，可以提供较为全面的营养需要。 1.2.2 生物菌肥的特点 生物菌肥作为一种生物制剂与化学肥料相比具有以下特点:?不破坏土壤结构，保护生态，不污染环境，对人、牲畜和植物无毒无害;?肥效持久;?提高作物产量和改进作物产品品质;?成本低廉;?有些种类的生物菌肥对作物具有选择性;?其效果往往受到土壤条件(如养分、有机质、水分、酸碱度等)和环境因素(如温度、通气、光照等)制约;?一般不能与杀虫剂、杀菌剂(杀真菌或杀细菌) [4]混用;?易受紫外线的影响，不能长期暴露于阳光下照射。 1.3 生物菌肥的作用 1.3.1 促进土壤形成 微生物在土壤形成过程中起到了至关重要的作用，土壤中含有的有机质和微生物的活动使土壤中含有丰富的矿物质元素，从而可以培养农作物，生物菌肥含有大量的微生物，进一步提高了土壤培养农作物的能力。 1.3.2 提高土壤肥力水平 微生物在生命活动中，不断分解土壤中的有机质，产生多种有机酸(如腐殖酸)，增强土壤的保肥能力。在改善土壤物理性质、化学性质和生物性质的同时，生物菌肥的使用也很大程度提高了土壤的全氮量，使得土壤全量养分的含量提高。另外，生物菌肥使土壤养分可以重复利用，如氮、钾、磷等，提高了土壤养分的有效性。 1.3.3 提高作物产量 调查结果显示:生物菌肥在于化肥结合使用下，比传统化肥施用方式增产5%-10%，占增产报道总数的30.8%，增产10%-15%的占到22.0%，增产15%-20%的占13.8%，报道增产20%以上的占20.8%。 1.3.4增加作物抗性 在生物菌肥进入土壤之后，一方面有益菌在植物根际大量繁殖，在植物根区形成优势种群，同时有益菌在生长繁殖过程中，还会分泌出多种有机酸和抗生素等物质，从而抑制病原菌等有害菌的繁殖;另一方面，有些有益菌群在植物根部形成一 [5]道生物屏障，以阻止有害菌的入侵和定殖。 1.3.5 减少环境污染 3 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 化肥的滥用、污水灌溉造成环境污染、土壤质量下降、农产品质量下降等问题，而生物肥料不会带来着这些负面影响，反而会帮助解决工业垃圾和生活废弃物的处理，增加土壤肥力，降解土壤中残留农药化肥，减少环境污染。 1.3.6提高作物品质 国内外大量研究和实验证明，生物菌肥的科学使用不尽能够提高作物产量，减少成本，保护环境，而且能够明显提高农产品的品质，如蛋白质、糖、维生素等物质的含量均有所提高，在有些情况下，改善产品品质比提高产量的好处更大。 1.4 生物菌肥中的有效微生物 自然界中不少微生物(病毒、细菌、真菌和线虫)具有杀虫、杀菌、除草及植物生物调节活性。此类微生物具有很高的专一性，其对靶标害物具有极高的选择性，而对其他生物却十分安全。利用微生物的这种特性生产的菌肥分为细菌肥料、放线菌肥料、真菌类肥料、光合细菌肥料、复合菌剂肥料等。 枯草芽孢杆菌作为细菌的一种，也具有作为有效生物菌肥菌种的潜质。 1.4.1 枯草芽孢杆菌在农业中的应用 随着科学技术的发展，人们对微生物的研究更加深入。由于生物防治对环境生态和人类健康无毒害的优点而备受重视，从而得到了越来越广泛的应用。枯草芽孢杆菌作为一种有效恢复土壤活性及防治害虫的优良菌种，具有较悠久的研究历史，目前在全球范围内有数百株野生型枯草芽孢杆菌记录保存，该细菌可以产生40余种抗菌物质，其中很多具有优良性状的菌株已应用于生产实践，例如，美国的GEO3、MBI600、QST713和B. subtilis. var. amyloli quefaciens,澳大利亚开发的B. subtilis A213, 日本东京技术研究所的B. subtilis RB-14,中国研发的B916、B908、B3、B903、XM16[6]等。 1.4.2 枯草芽孢杆菌国内研究概况 国内对枯草芽孢杆菌的研究主要包括大田作物的叶部病害、果实病害和土传病害等。枯草芽孢杆菌可以从植物体内分离出来，研究表明植物内生菌对植物生长具有促进作用，内生菌可增进宿主植物对N、P等营养元素的吸收，对宿主植物的生 [7]长起促进作用。不同菌株的作用机理存在很大的差异。现已从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出多株可以拮抗不同作物病害的枯草芽孢菌株，并对这些菌株进行了发酵条件的研究，对其中分离处得抗菌物质进行了特性研究，同时开展了温室和大田试验。 4 山东农业大学学士学术论文 国内已成功开发并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有麦丰宁、纹曲宁、依天得、百抗、根腐消等。其中麦丰宁对小麦纹枯病田间防效达50,~80,，它主要产生一种抗菌物质来一直病原菌菌丝的生长、菌核形成及萌发。纹曲宁是100亿活芽孢,ml枯草芽孢杆菌水剂和2.5,井冈霉素的复混制剂。“百抗”已在多个省推广使用。百抗对水稻纹枯病防效70,以上，其作用机制为位点占领、营养竞争等。根腐消主要防治三七根腐病。枯草芽孢杆菌为细菌性植物保护剂，是多种植物病原菌的竞争性抑制剂。它通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长，能在植物表面迅速形成一层保护膜，使农作物免受病原菌为害。枯草芽孢杆菌还能分泌抑菌物质，抑制病菌孢子发芽和菌丝生长。下表1列出了国内研发的主要枯草芽孢杆菌制剂。 5 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 [8]表1 我国已注册的枯草芽孢杆菌菌剂产品 Table 1 Bacillus subtilis bacterium agent products registered in China 产品名 公司 有效成分 剂型 主要防治对象 江苏农业科学院B. subtilis 植保研究所 B916+井冈霉文曲宁 水剂 水稻纹枯病、稻曲病 素 云南农业大学，水稻纹枯病，三七、烟 中国农业大学和草、花卉、小麦、白菜百抗 B. subtilis 可湿性粉剂 云南星耀生物制等土传病害 B908 品厂 光华化工股份有白粉病、灰斑病、炭疽台湾宝 B. subtilis 可湿性粉剂 限公司 病等疾病 麦丰灵 南京农业大学 B. subtilis B3 粉剂 小麦纹枯病 香港经纶全汛有水稻纹枯病、稻瘟病、亚宝 B. subtilis 可湿性粉剂 限公司 甘蓝黑斑病 枯草芽孢杆菌 武汉天惠生物有黄瓜白粉病、草莓白粉 BS-208杀菌限公司 病和灰霉病、番茄灰霉B. subtilis 可湿性粉剂， 剂 病、棉花黄萎病、枯萎Bs-208 水剂 病和立枯病等 中国农业大学植活体微生物生长调节 物生态工程研究剂，对作物具有壮苗、增产剂 Bacillus. spp 可湿性粉剂， 所与上海农乐生抗病及增产作用 水剂 物工程为制品厂 浙江大学生物技B. subtilis +绿有效防治猝倒病、根瘤 术研究所 色木霉+毛壳病、立枯病、枯萎病等威绿达 菌肥 酶 病害，促进作物生长， 增加作物产量 6 山东农业大学学士学术论文 1.4.3 枯草芽孢杆菌国外研究概况 二十世纪四十年代，枯草芽孢杆菌被证明具有防止植物病害的作用。自此之后，对枯草芽孢杆菌的研究成为各国的研究热点。枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害、豌豆根腐病等。迄今为止，已有多种枯草芽孢杆菌制剂应用于农业生产中，例如由美国研发并登记注册的杀菌剂Serenade和Souata AS, 可防治蔬菜水果灰霉病、白粉病等真菌和细菌病害。韩国研制的杀菌剂Mildewide, 主要防治霜霉病、白粉病等真菌病害。俄罗斯开发的可湿性粉剂Alifine-B, 主要防治做种作物真菌病害。迄今为止美国己有 4株枯草芽抱杆菌 ( B1 subtilis)生防菌株 (QST713 、 MB1600、 GB03和 FZB24 )得到了美国环保署( EPA)商品化或有限商品化生产应用许可。QS T713为美国 Agra Quest公司开发出来的活菌制剂, 商品名Serenade , 不仅通过美国环保局 ( EPA)的登记而且还得到食用作物病害应用的审批和认可,通过叶面施用能防治蔬菜、樱桃、 葡萄、葫芦和胡桃多种作物的白粉 [9]病、 烂根病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌引起的病害。下表2详细列出了近年来世界各国研发的主要枯草芽孢杆菌制剂。 7 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 表2 美国已注册的防治植物病害的枯草芽孢杆菌生物制剂 [10] Table 2 Selected B. subtilis-based plant disease bio-control products in American Formulation Product name Company Bacillus component Primary target type Agra Quest. WP. aqueous Fungi. bacteria on Davis. CA suspension multiple vegetable, Serenade B. subtilis QST713 fruits Novozmew. B. lichoniformis SB Sclerotinia Salem. VA 3086 homoeocarpa on Eco Guard Howable turf Gustafson. WP(Conc.) Fungi. on cotton. Plano. TX floeable large-seeded Kodiak B. subtilis GB03 legumes. soybeans Yield shield Gustafson B. pumillus GB34 WP(Conc.) Fungi in soybeans B. amyloli Fungi on bedding quefaciens plants in potting Bio Yield Gustafson Dry flake GB99+B. subtilis mixes GB122 Fungi on cotton, large-seeded Subtilex Microbio Ltd B. subtilis MBI600 WP(Conc.) legumes, soybeans Hi Stick L Beker B. subtilis Fungi on soybeans, Flowable +Subtilex Underwood BI600+rhizobium peanuts 1.5 枯草芽孢杆菌的研发存在的问题 尽管在枯草芽孢杆菌生物菌剂研究中已经取得了相当瞩目的成就，但仍然存在 着一些迫于解决的问题。枯草芽孢杆菌作为一种生防微生物，在对农作物施用过程 中易受到土壤PH、温度、土壤微环境及作物生长状况等因素的影响，从而使得生物 防治效果不稳定，还不能够适用于大范围的作物施用。大多数的枯草芽孢杆菌制剂 8 山东农业大学学士学术论文 还处于实验室研究阶段，没有进入实际应用。 1.5.1 产品标准化 在衡量农药产品的标准中，只把侧重点放在药效上而忽略了有害杂质的含量，没有明确要求对对有害杂质进行限量导致一些农药产品产生副作用。2004年国家工商总局组织辽宁地区市场抽查，共抽查了38个经销单位的60个产点，杀菌剂的合 [11]格率仅为3.7%。现在国内没有严格的标准来衡量枯草芽孢杆菌的有效成分，有些以有效杀菌成分为标准，有些以活芽孢数位标准，而且国家统一的标准来进行有效杀菌成分的检测。 1.5.2 生产成本高 在枯草芽孢杆菌发酵过程中分泌的有效杀菌物质较低，而且在生产发酵过程中容易感染杂菌，种种因素使得发酵操作要求的成本过高，研究开发一种新产品所花费的时间较长，应用于农作物后效果不明显，防治对象单一等等问题都提高了生产成本。 1.5.3 实际应用中存在问题 枯草芽孢杆菌菌剂从实验室研发到走向田间是一个复杂的过程，主要问题是菌剂的货架储存期短。另外，关于枯草芽孢杆菌的基础理论研究不够多，在实际应用过程中，往往要考虑多方面的因素，而不单单是菌剂的作用机理，例如，土壤的温度、湿度、pH等都可能对枯草芽孢杆菌的活性造成影响，从而使枯草芽孢杆菌活性降低或者使其产生的有效杀菌物质降解，因此防治效果不理想。另外，由于菌剂的价格问题，使得许多农业生产者不会选择这类制剂。 1.6 立题依据 玉米小斑病是由Bipolaris maydis所引起的一种真菌病害，是甜玉米生育期的常发性病害。病菌以菌丝和分生孢子在病株残体上越冬，第二年产生分生孢子，成为初次侵染源。分生孢子靠风力和雨水的飞溅传播，在田间形成再次侵染。其发病轻重，和品种、气候、菌源量、栽培条件等密切相关。一般，抗病力弱的品种，生长期中露日多、露期长、露温高、田间闷热潮湿以及地势低洼、施肥不足等情况下，发病较重。近年来随着种植面积的逐年扩大和感病品种的扩种，发病有加重趋势，已成为甜玉米的严重病害之一。目前生产上用于防治玉米小斑病的化学试剂主要是常用的杀菌剂，玉米小斑病主要用40%克瘟散，50%多菌灵，75%代森锰锌等 [12]药剂500-800倍进行页面喷雾防治。但效果不是很理想，由于枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌的生长具有抑制作用，因此探讨玉米小斑病的生物防治具有重要意义。 9 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 2. 材料与方法 2.1 实验材料与器材 2.1.1 实验材料 蔗糖，马铃薯，麦芽糖，酵母膏，琼脂，燕麦片，胰蛋白胨，牛肉膏，硫酸铵，KHPO,5%孔雀绿溶液，0.05%碱性复红溶液，香柏油，擦镜液，无菌水 24 2.1.2 实验菌种 枯草芽孢杆菌A16(Bacillus subtilis A16) 玉米小斑病菌(Bipolaris maydis) 2.1.3 实验仪器 显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，吸水纸，胶头滴管，试管，试管夹，培养皿，三角瓶，烧杯，控温摇床，移液枪，高压蒸汽灭菌锅，电子天平，PH测试仪，接种环，直尺，无菌操作台 2.2 实验方法 2.2.1 发酵种子培养 2.2.1.1 配制LB培养基 ?用烧杯称取32g马铃薯，32gNaCl, 16g酵母膏放至锅中，烧杯用水冲洗，加入部分水，使药品溶解 ?用30% NaOH调pH,至7，补齐3200ml水 ?分装至6个三角瓶中，每个500ml ?121?灭菌23min。得6×500ml LB培养基,待用 (以下实验部分需用不同容量及数量的LB培养基，按照比例重新配置即可) 2.2.1.2 活化菌种 ?将装有Bacillus subtilis A16的种子瓶拿入无菌操作室，同时将200ml的LB培养基拿进超净工作台，紫外灭菌20min. ?按1:1000比例，每瓶培养基中加入200μl种子 ?将接种完的LB培养基放入摇床内36?,200r/min培养过夜 ?将种子瓶放回冰箱4?保存 2.2.1.3 菌种扩大培养 ?将上步得到的200ml接种枯草芽孢杆菌的LB培养基，18×500ml LB培养基拿入无菌操作台，开紫外灯对超净工作台灭菌20min左右 10 山东农业大学学士学术论文 ?把上步试验中接种到200ml培养瓶中的菌种按照3%的接种量接种到500ml的LB培养基中，共有9L×18个大瓶 ?36?,200r/min摇床培养，预得上罐前种子 2.2.2 发酵生产监测,对0004,0005,0006罐进行实验室发酵罐模拟实验, 2.2.2.1 取样 从0004,0005,0006三罐中分别取样 2.2.2.2 压片复染 ?制作菌种常规涂片:取洁净载玻片，滴一滴取样液于玻片中央，室温自然干燥，涂面朝上，通过火焰2-3次进行热固定 ?于图片上滴3-5滴孔雀绿溶液;用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计时约4-5min;倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止;用0.05%的碱性复红溶液进行复染1min，水洗; 2.2.2.3 观察结果 将制作好的压片置片干燥后用油镜观察 2.2.3 Bacillus subtilis A16与Bipolaris maydis的拮抗实验 2.2.3.1 各种培养基的配制 ?酵母浸膏培养液:蔗糖`，酵母浸膏12g，KHPO4g,无菌水1000ml 24 ?酵母浸膏培养基:酵母浸膏培养液+琼脂20g ?燕麦培养基:燕麦片30g，琼脂18g，无菌水1000ml 2.2.3.2 玉米小斑病菌,Bipolaris maydis,的培养 将玉米叶表面分离的玉米小斑病菌移植于燕麦片培养基上，25-30?培养7d左右，待菌落表面达培养皿面积2/3时，22?光照培养3d 2.2.3.3 拮抗细菌,Bacillus subtilis A16,的培养 将A,B,C三罐的枯草芽孢杆菌分别接种于盛有150ml酵母浸膏培养液的三角瓶中，30?，240r/min震荡培养48h 2.2.3.4 拮抗实验 以玉米小斑病菌为靶标菌，采用平板对峙法测定枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌的拮抗作用。将2mm×2mm大小的玉米小斑病菌菌丝块接在燕麦培养基中央，25?培养3d，在离接种处25mm处的左右两边等距划线接种枯草芽孢杆菌，对照组只接 11 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 种病原菌玉米小斑病菌，25?培养5d，每组处理3次重复 3 实验结果 3.1 发酵生产监测(0004,0005,0006实验室种子罐) 0004罐发酵试验进行得比0005,0006罐相对早一些，比0005和0006提前进入发酵阶段，0005和0006罐进行同步发酵试验，以下表格记录三天内三个罐的发酵情况 12 山东农业大学学士学术论文 表3 0004，0005,0006罐的发酵情况记录 Table 3 Fermentation conditions record of fermentor0004,0005,0006 发酵罐编号 发酵情况记录 第一天上午 0004 视野内大量菌体，少量芽孢，应处于对数生长期末期 0005 视野内菌体量多，无污染，正处于对数生长期 0006 视野内菌体量多，无污染，正处于对数生长期 第一天下午 0004 视野内芽孢占大概65%，处于发酵生产末期 0005 视野内大量菌体，少量芽孢，处于对数生长期末期 0006 视野内大量菌体，少量芽孢，处于对数生长期末期 第二天上午 0004 视野内大量芽孢，几乎发酵结束 0005 视野内大量杆菌，发酵正常，与正常发酵周期相符 0006 视野内大量杆菌，发酵正常 第二天下午 0005 视野内大量杆菌，少量芽孢，发酵正常 0006 视野内大量杆菌，发酵正常 第三天上午 0005 视野内大量菌体，少量芽孢，发酵正常 0006 视野内菌体与芽孢数量都较少，有较多杂质 第三天下午 0005 视野内大量菌体，芽孢较上午多一些，发酵正常 0006 视野内大量杂质，应该已污染 13 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 3.2拮抗实验结果 3.2.1 菌丝直径 表4 菌丝直径 Table 4 diameter of mycelium 组号直径 1 2 3 实验组直对照组直实验组直对照组直实验组直对照组直天数 径/mm 径/mm 径/mm 径/mm 径/mm 径/mm 1 15 17 17 18 16 18 2 34 36 35 36 36 34 3 41 43 40 43 40 44 4 42 48 40 49 42 48 5 42 51 40 52 42 52 为了更清楚地显示枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌生长的一直情况，将第一组的量组数据绘制成折线图显示如下 60 515048 4342424140 363230 20菌丝直径/mm 1715 10 0 12345 时间/天 图1 菌丝直径与时间的关系 14 山东农业大学学士学术论文 Fig.1 the relationship of mycelium diameter and time 3.2.2 拮抗实验观察 在拮抗实验的过程中，无论是对照组还是实验组，前两天菌丝的生长都较快，从第三天开始，接种了枯草芽孢杆菌的培养皿中病原菌的菌丝生长几乎停滞，而对照组的病原菌菌丝仍处于继续生长状态。在培养基上培养了3d之后，接种了枯草芽孢杆菌的培养基上已经明显出现了抑菌带，在菌丝直径与时间关系图表中也可以明显地看出没有接种枯草芽孢杆菌的对照组菌丝生长状况比实验组要好一些。实验观察结果显示，在接种了枯草芽孢杆菌的培养基上，玉米小斑病菌的菌丝较对照组所占的培养皿面积少很多，菌体生长受到抑制。 4 讨论 4.1 实验室发酵生产监测 工业生产之前一般都要进行实验室小规模的发酵罐实验，在该实验发酵生产监测过程中，实验室小罐发酵周期与工业生产发酵周期基本相符。在最初阶段，菌体处于对数生长阶段，因为对数生长期的种子是发酵生产中的最适种龄，此时菌体尚未达到最高峰。待菌体进入稳定期之后，发酵进入产物合成阶段，菌体稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义，例如，对生产菌株或与菌体生长相平行的 [13]代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵来说，稳定期是产物的最佳收获期。在该发酵模拟试验中，当取样观察发现视野内有大量芽孢存在时，既说明发酵已经处于发酵末期。在发酵前期过程中观察0006罐一直发酵正常，但从第三天观察发现发酵罐里含有大量杂质而菌体量和芽孢量很少，可能原因就是发酵过程中被污染，应属于发酵中期污染，在该种情况下会严重影响产生菌的代谢，杂菌大量产酸致使培养液pH下降，糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会会使已产生的产物分解。在染杂菌的情况下，如果情况较轻，可以降低培养，减少补料，如果发酵单位到达一定遂平可以提前放罐,对于0005罐，整个实验发酵过程中情况良好，基本与工业化生产发酵的周期相同，菌体生长状况正常，发酵条件控制恰当，无污染情况发生;0004大罐较0005和0006大罐早进行发酵试验一天左右，所以观察到的情况与0005和0006大罐不一致，但是总体的趋势是一样的，没有污染发生，并且整个发酵过程几乎与工业生产的正常发酵周期相符，所以0004和0006大罐发酵试验较为理想。 4.2 枯草芽孢杆菌拮抗实验分析 在枯草芽孢杆菌抑制玉米小斑病菌生长的试验结果表明，枯草芽孢杆菌A16对 15 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 玉米小斑病菌的生长的确起到了一定的抑制作用。 在拮抗实验中，接种枯草芽孢杆菌的培养基中玉米小斑的有明显的抑菌带，说明枯草芽孢杆菌的拮抗性强且稳定，对玉米小斑病菌有较好的拮抗作用，在第一天和第二天，实验组和对照组的病原菌菌丝生长状态几乎同步，因为所接种的枯草芽孢杆菌距离病原菌距离较远，还不能对病原菌的生长起到一定的抑制作用，从第三天开始对照组与实验组的菌丝生长状况开始出现变化，实验组的枯草芽孢杆菌已经明显发挥抑菌作用而使得病原菌菌丝的生长几乎停滞，而对照组的菌丝仍然处于生长状态，可见枯草芽孢杆菌是一种较为理想的拮抗细菌，在植物病害尤其是农作物的生物防治方面表现出一定的生防潜力。 该实验只是粗略地测定了枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌生长的抑制作用，对于枯草芽孢杆菌作用的最适条件还应有进一步的要求，比如培养基成分、培养温度、溶氧量、pH等。对于此拮抗关系，需要进行更进一步的研究来确定枯草芽孢杆菌作用的最适条件，为以后更好地防治玉米小斑病奠定基础。 5 存在问题及展望 5.1 枯草芽孢杆菌生物肥料研发的展望及应用对策 在对枯草芽孢杆菌已有的研究基础上，再进行进一步的研发，如对植物内外微生物区系及微生态平衡的影响;对土壤性质改良的长效机理;也可以研发在畜禽鱼免疫方面的研发，扩大其应用范围。同时，枯草芽孢菌剂在不同条件下使用时，对菌体本身可能产生的影响，密切注意它们的变化趋势和可能发生的不良变异和影 [14]响，并提出合理有效的预防方法。通过这些作用机理的研究，可以有效指导枯草芽孢杆菌制剂的产品生产工艺和应用技术方法，是其的应用和研究水平有更大的发展和提高。 为了解决大多数菌剂还在实验室开发阶段而不能大范围施用的问题, 目前主要采用与化学农药复配防和与其他拮抗微生物协同防病这两种措施。这样在某种程度上实现了枯草芽孢杆菌菌剂的使用，也使得其使用效果在其他微生物的协同作用下得到提高。 在产品标准化的问题上，国家应逐步建立、完善行业生产及检测标准，制定有关法律及实施，使生产标准化。同时建立与完善市场检查和监督机制，一旦发现不合格产品，立刻依据法律给予对应的处罚。 5.2 生物菌肥研发使用中存在的问题 16 山东农业大学学士学术论文 我国的微生物肥料行业还处在起步阶段，很多的肥料生产企业还徘徊在幼稚发展阶段，没有完善的，生产技术还有待发展，没有明显的效益。现在，国家对农业生产资料有相应的免税政策，其中包括饲料、农膜、部分化学农 药与部分化学肥料，对销售种子、种苗、农机、化肥、农药的销售商也有相应的免税政策，但这些都不包括微生物肥料行业与产品。与化肥行业、农药行业相比，微生物肥料行业还处在稚嫩的发展阶段，但是，它又与我国农业可持续发展战略息息相关，在有机食品生产方面有着不可替代的地位，是我国肥料行业发展的方向之 一。 现在市场上出售的生物菌肥大部分对土壤的温度、湿度、pH等要求比较严格，使得施用后菌种可能不能发挥最大的作用。在施用过程中，受到一些因素的影响，比如与杀菌剂、杀虫剂等混合使用会造成菌肥中生物菌的死亡;高温、低温、干燥等较恶劣的条件不可施用。 生物菌肥的研发面临的一个问题是生物菌的生物活性如何在产期保存的情况下保存完好，有些菌肥只能进行短期保存，这样对工业生产来说会造成较大负担。另外新菌种有待开发来生产更多功效的菌肥，能用于工业生产的微生物只占所有微生物很小的一部分，所以对新型工业菌的开发研究是当前一项有待解决的任务。 5.3 生物菌肥的推广使用及展望 5.3.1 生物菌肥的推广使用 从目前的农业生产形势和肥料使用状况来看，农药化肥将逐步被生物肥料、生物农药所取代，化学制剂防治害虫是一种治标不治本的方案，虽然在短期内可能达到消灭害虫，提供作物营养的目的，但是但是时间久了害虫杂草逐渐产生了抗性，土壤中残留大量的化肥农药，都将严重影响人类及牲畜的健康以及环境的协调稳定。 从农业生产特点的角度来讲，推广生物菌肥具有一定的重要性。由于过去农田耕作大量使用化学肥料，土壤中的氮过量，难溶解的磷、钾又不能被植物吸收，使得土壤越来越板结，农作物的耕种也就越困难，从而导致了农作物的质量与产量的下降。生物菌肥中的有效微生物可以同通过其新陈代谢的产物来降解难溶物质，活化土壤，促进植物对磷、钾等元素的吸收，从而提高农作物的品质及产量。 从示范和施用效果的角度来看，推广和应用生物菌肥具有一定的可行性。大量的调查显示，使用生物菌肥的农田作物产量均比未使用前不同程度的提高。在生物菌肥的推广使用过程中，强有力的调查结果会提供更好地说服力。 从生物菌肥使用的范围来看，其推广应用具有一定的广泛性。不同的生物菌肥 17 枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 可以适应不同的种植环境，从而改善不同质量的土壤，也就是说，生物菌肥的多样化使得生物菌肥在各种地质上都能发挥充分的效果。 各级农业技术推广部门要加强生物菌肥的推广，从生物菌肥产品的特性、作用 [15]功能、使用方法等方面，进行多角度、全方位的推广。从而响应“发展绿色农业，发展生态农业”的号召。 5.3.2 生物菌肥的发展前景 生物菌肥的作用已逐渐被人们认可。现已有70多个国家进行生物菌肥的生产机推广使用。尽管现在生物菌肥的生产量以及应用量远比不上传统的化学肥料，但是由于其显著的作用，已初步形成了小规模的生产并取得了一定的经济效益。 经过长期的研究开发，生物菌肥已形成了以下几种趋势:(1) 由单一菌种向复合菌种转化;(2) 由单一功能向多功能转化;(3) 由豆科作物接种剂向非豆科作物肥料转化;(4) 由单一接种剂向复合生物肥转化;(5)由用无芽胞菌种生产向用有芽胞 [16]菌种生产转化。现已有部分国家对生物菌肥的监测衡量制定了一个明确的标准，以便对生物菌肥规格有一个明确的规定，避免了市场销售及应用的混乱。为了促进国内微生物肥料行业的发展，建议国家在相关法律上给予生物菌肥一定的优惠政策，比如免收增值税。同时，国家应该加强菌种资源的管理，加大执法力度，完善检测体系，市场，保证微生物肥料的产品质量。另外，国家应该加大对微生物肥料基础研究的投入，收集更多宝贵的资源，对微生物肥料的作用机理进行更加深 [17]入彻底的研究，使我国的微生物肥料行业可以更好的发展。现在，我国也制定了农业部标准和成立微生物质量检测中心，并已于1996年正式对微生物肥料制品进行产品登记、检测及发放生产许可证等工作。 随着环境问题在全球范围内越来越受到重视以及农业可持续发展策略的应用，生物菌肥的开发、生产及应用力度在不断扩大。随着科学技术的不断发展，生物菌肥的研制一定会取得突破性进展，逐步形成大规模的应用，从而对土壤修复，农作物增产等发挥其应有的作用。 生物菌肥作为一种无毒无害的产品将越来越受到人们的青睐，生物菌肥的推广势将成为肥料发展的必然趋势。 18 山东农业大学学士学术论文 参考文献 [1] 葛诚，吴薇.我国微生物肥料的生产、应用及问题「J」.中国农学通报,1994,(3);24-28 [2] 沈卫锋，牛宝龙，翁宏飚等.枯草芽孢杆菌作为外源基因表达系统的研究进展[J].浙江农业 学报，2005，,1(4):234-238 [3] Monica LE Elizabeth ADJ, William EBJ. et al. 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