【doc】甾体皂苷TSA对局灶性脑缺血大鼠运动感觉功能的影响

【doc】甾体皂苷TSA对局灶性脑缺血大鼠运动感觉功能的影响 甾体皂苷TSA对局灶性脑缺血大鼠运动感 觉功能的影响 ? 32?中国康复理沦』实践2009年1月第15卷第1期ChinJRehabilTheoryPract,Jan.2009,Vo1.15,No.1 基础研究 甾体皂苷TSA对局灶?眭脑缺血大鼠运动感觉功能的影响 李红艳,孙建宁,马百平,从玉文 [摘要]目的探讨甾体皂苷TSA埘脑缺再灌注大鼠恢复早期运动感觉功能的影响.方法建大鼠大腑中动脉缺『『?再灌 注模,随机分为模组,TSA15mg/kg,30mg/kg,60mg/kg给药组,安宫牛黄丸400mg/kg组以及假手术组.于造模后3,】4d 给约,术后3d,7d,10d,14d观察横小行走功能和揭除胶布的潜伏期,观察皮层运动感觉区神经细胞的形态结构,免疫组化法枪测 脑梗死周围区血管内皮生长因子(VEGF)的达以及微m管密度.结果与模型组比较,TAS30mg/kg,60mg/kg给药组能够增 强脑缺血大鼠横水行走的能力(P<o.05),缩短揭除胶布的潜伏期(P<0.05),减轻皮层运动感觉区的神经细胞损伤,升高梗死周 旧区VEG-F的表达以及微血管的数目.结论TSA可JJfJ怏大鼠局灶性脑缺血后运动感觉功能的恢复,其能的机制是促进了大脑 VEGF的表达和微血管的新牛. [关键词]脑缺【缸;甾体皂骨;感觉运动功能;血管内皮牛长网子(VEGF);血管新生;大鼠 EffectofSteroidalSaponinTSAontheRecoveryofSensorimotorFunctionafterCerebralIse hemiainRatsLIHong—yan.SUNJian— ning,MABaiping,eta1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China Abstract:0bjectiveToinvestigatetheeffectofSteroidalSaponinTSAontherecoveryofsenso rimotorfunctionaftercerebral ischemiainrats.MethodsCerebralischemiawasinducedbymiddlecerebralarteryocclusioninratswhichweredividedinto6 groups:vehicle,TSA15mg/kg,30mg/kg,60mg/kg,AngongNiuhuang(ANGH)400mg/kgandsham.Animalsreceiveddrug administration3,14dafterischemia.Sensorimotorfunctionwasevaluatedwithbeam— walkingandadhesivetape—exposingperform— ance3d,7d,10d,and14dafterischemia.Neuralcellinjuryinthesensorimotorcortexipsilateraltoischemiawasstudiedwithhe— matoxylineosinstain.Imnmnohistochemistrymethodswereusedtomeasurethevascularendothelialgrowthfactor(VEGF)protein andtheangiogenesisoftheareaaroundinfarctiontissue.ResultsAnimalsreceivingTSAatadosageof30mg/kgand60mg/kgre— coveredbetterinbeam— walkingandadhesivetapeexposingperformancethanvehicles,andtheimprovementbecamesignificant14d afterischemia.TreatmentwithTSA30mg/kg,60mg/kgalsosignificantlyreducedtheneuralcelllossinsensorimotorcortexandin— creasedtheexpressionofVEGFproteinandthemicrovasculardensity.ConclusionTSAcanimprovetherecoveryofsensorimotor functionfollwingfocalcerebralischemiainrats,whichmayinvolvetheneuralcellsprotection,promotingtheexpressionofVEGF andangiogenesisafterischemia. Keywords:cerebralischemia;steroidalsaponin;sensorimotorfunction;vascularendothelialgrowthfactor(VEGF);angiogene— sis;rats [中图分类号]R743.3[文献标识码]A[文章编号]1006977l(2009)01—0032—03 [本文着录格式]李红艳,孙建宁,-5平,等.甾体皂苷TSAx,tJgj灶性脑缺血大鼠运动 感觉功能的影响[J].中冈康复理论'j 实践,2009,l5(1):32--34. 甾体皂苷为一类重要的中药活性成分,具有良好 的心脑血管活性.研究表明,知母皂苷通过调控血管 内皮细胞功能以及抗血栓形成,发挥抗急性心脑缺血 再灌注损伤的作用.].甾体皂苷TSA为中药来源的 主要含甾体皂苷的提取物,本研究探讨TSA对脑缺血 损伤大鼠感觉运动功能的影响及其作用机制. 1材料和方法 ,雄性,体重280,300g,由 1.1实验动物SD大鼠 北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号: SCXK(京)2002—2003. 1.2实验试剂及仪器甾体皂苷TSA,由中国军事医 基金项日:北京市科委创新药物研究开发再点项F1 (D0206001043391). 作者单位:1.北京中医药大学中药学院中药药理系,』七京市 100102;2军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京市100850.作 者简介:李红艳(1979),女,贵州贵阳l人,博士研究生,主要研究方向: 腑缺血神经药理.通汛作者:孙建宁. 学科学院放射与辐射医学研究所提供,为浅黄色粉末, 用0.5羧甲基纤维素钠(CMC)配置成混悬液;安宫 牛黄丸原料粉,北京同仁堂提供,用0.5K0CMC配成 混悬液;兔抗大鼠血管内皮生长因子(VEGF)抗体,兔 抗大鼠CD.抗体:博士德生物技术有限公司;Sp两步 法免疫组化染色试剂盒:GENETECH公司;其他试 剂为国产分析纯.外科手术灯:上海医疗器械五厂;钓 鱼尼龙线,直径0.25Film:德国;平推式石蜡切片机:日 本;NIK0N显微镜:日本. lI3模型的制备参照文献方法制作大鼠大脑中 动脉缺血(MCAO)模型.大鼠用10水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉,仰卧位固定.常规消毒皮肤,颈正 中切口,分离右侧颈总动脉,颈内动脉及颈外动脉,穿 线备用,结扎颈外动脉与颈总动脉,以动脉夹夹闭颈内 动脉远心端后,于颈外动脉与颈内动脉分叉处作一切 口,从切口处插人头端磨成球形的光滑尼龙线(头端直 径0.27mm,距头端18inm处做标记),有阻力感时停 中国康复理论与实践2009年1月第15卷第1期 ChinJRehabilTheoryPract,Jan.2009,Vo1.15,No.1 止进线并缺血时间,插入深度18mm左右.结扎 切口处,固定尼龙线,逐层缝合肌肉和皮肤,消毒.2h 后将尼龙线头端轻轻拔出到近切口处.假手术组只暴 露和分离右侧颈总动脉.脑缺血及再灌注过程中保持 室温23?,常规分笼饲养.按照ZeaLonga5级评分 法,于大鼠完全清醒后进行评定,1,3分大鼠人选后 续的实验. 1.4分组及给药入选大鼠分成5组:模型组,TSA 15mg/kg,30mg/kg,60mg/kg给药组,安宫牛黄 400mg/kg对照组.假手术与模型组给等量0.5 CMC溶液.术后3,14d灌胃给药,每天1次. 1.5运动感觉功能检测 1.5.1横木行走实验[5横木宽2.0cm,长12Ocm, 厚1cm,距地面80cm水平悬空放置,横木一端连接一 个暗盒(长25C1TI,宽22cm,高18cm),用强光刺激大 鼠通过横木走进暗盒.评分:0分,大鼠不能停留 在横木上;1分,大鼠能停留在横木上但不能移动;2 分,大鼠试图通过,但从横木摔下;3分,大鼠走上横 木,但损伤的后肢滑落次数超过5O;4分,后肢滑落 超过1次但不到5O;5分,仅滑落1次;6分,顺利通 过.缺血前训练2d,让大鼠学会顺利走过横木.以缺 血后3d,7d,10d,14d为观察时问点分别进行检测. 1.5.2触觉刺激实验用0.7×0.7cm的医用胶布 贴在大鼠左前肢腕部腹侧面作为触觉刺激,记录大鼠 揭除胶布的潜伏期.术前训练2d,1次/天,使大鼠能 够在20s内完成揭除胶布的动作.以缺血后3d,7d, 10d,14d为观察时间点分别进行检测. 1.6取材运动感觉功能检测结束后,大鼠腹腔注射 1O水合氯醛0.35g/kg麻醉,经左心室插管,分别用 生理盐水及预冷的4多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH一 7.2)灌注,大鼠僵硬后断头取脑,浸泡于4多聚甲醛 溶液中固定24h,常规脱水,石蜡包埋,取前囟前1.7 , 2.2mm组织块,冠状位连续切片,片厚3m. 1.7组织病理学及免疫组织化学染色每组取5例 进行HE染色及免疫组织化学染色(Sp两步法).200 倍光学显微镜下,每张切片在梗死周围区选取3个固 定视野拍照,用Image—ProPlus(v5.1,SilverSpring, Maryland,USA)软件进行图像分析,观察皮层运动感 觉区神经细胞的形态结构,计数200倍视野(HP)内神 经细胞的数目;测定梗死灶周围脑组织VEGF阳性细 胞(细胞浆出现棕黄色颗粒)的积分光密度(IOD)以及 微血管的密度(MVD).MVD按Weidner等方法进 行,凡染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为 一 个血管计数,不以出现血管腔为唯一计数标准,计算 出每Film面积内微血管的数量,取3个视野的均值作 为测定结果. ?33? 1.8统计学方法采用SPSS13.0forWindows统计 软件进行数据统计分析,数据用(?)表示,组问比较 采用单因素LSD方差分析. 2结果 2.1横木行走实验假手术组大鼠横木行走能力没 有变化,各缺血组大鼠横木行走能力明显降低,观察期 内未恢复到正常水平.TSA3Omg/kg,6Omg/kg给 药组,安宫牛黄组大鼠术后14d行走能力较模型组提 高(P<0.05).见表1. 表1各组大鼠横木行走实验评分比较 假于术 模 TSA15rag/kg TSA30rag/kg TSA60mg/kg 安宫牛黄丸 560士0.49 】20?06 100土045 1O0土063 100土060 109土O51 往:与模剞习【比较,a:'u05;b:u0l. 2.2触觉刺激实验各缺血组大鼠缺血对侧前肢的 触觉敏感度以及精细运动执行能力明显减弱,虽然在 观察期中逐渐有所恢复,但术后14d仍低于假手术 组.与模型组比较,TSA3Omg/kg,60mg/kg给药组 大鼠揭除胶布的潜伏期缩短(P<O.05).见表2. 表2各组大鼠触觉刺激实验潜伏期比较(s) 假手术10l880土3061930土38O18.4O上23716l0?2.26 模型l033520士36.17259.90土2858146.2O士12.397170士922 TSA15nag/kEl0317.7O士37.0525190?16O71354O士195973.00士l375 TSA3Omg/k1132855?3956245.64?l57ll4209?l62l6082士997a TSA6Orag/kl134009士3l6123109?32.71l3754土1l3660l8士8.92a 安官牛黄丸113O709?38.3423264土38.51145oo土19.686709土767 柙':侵型组比较,a:<005. 2.3神经元损伤模型组大鼠皮层运动感觉区以及 新纹状体神经细胞大量变性坏死,排列散乱,胞膜胞核 轮廓不清,胞核固缩深染,胞体皱缩,神经元密度降低, 神经元脱失明显,间质疏松呈筛状.TAS30mg/kg, 6Omg/kg给药组,安宫牛黄组与模型组相比,神经元 数量明显增多(表3),变性坏死组织范围较小,程度较 轻. 表3各组大鼠皮层运动感觉区神经元数目比较(/rip) 注:与模型组比较,a:P<0.01. 2.4血管新生及VEGF表达假手术组大鼠在皮层 及纹状体可见少量棕黄色微血管及VEGF阳性神经 元和内皮细胞;脑缺血各组大鼠皮层及纹状体梗死周 围区可见大量神经元,胶质细胞和内皮细胞均呈 VEGF阳性,散布或丛集呈簇的CD.阳性细胞及其形 ? 34?中围康复理论与实践2009年1月第15卷第1期CbinJRehabilFheoryPract,Jan.2009,Vo1.15,No.1 成的毛细血管分布于梗死周围区,并向梗死中心延 3.6).其中TAS30mg/kg,60rag/ 伸(中插彩图3.1, kg给药组,安宫牛黄组与模型组比较,VEGF表达增 多.微血管数日增加(P<0.05).见表4. 表4各组大鼠血管新生及VEGF表达比较 注:与模兰儿比较,a:1J<(j.05;b:<O.01. 3讨论 大鼠局灶性脑组织缺m再灌注后,损伤导致皮层 运动感觉区及新纹状体大量神经细胞变性坏死,肢体 运动感觉功能发生障碍,运动协调平衡能力明显降低. 尽早建立缺m组织的血液供应是神经功能恢复的关键 环节.本研究在缺血后的哑急性期(第3,14天),通 过TSA(30mg/kg,60mg/kg)给药干预后,大鼠的感 觉运动功能得到明显改善,皮层运动感觉区的神经细 胞损伤减轻. 血管VEGF是内皮细胞特异性的有丝分裂原,在 血管发生和形成过程中起着主要的调控作用.VEGF 及其受体在缺?fL性脑』f『L管疾病中的表达明显上调,参 与整个脑缺血病理过程的发生发展,发挥神经元保护, 抑制神经元捌亡,促进齿状旧和脑室下区的神经发生 的作用,并刺激缺血半暗带新生血管的形成和侧支循 环的建立. CD.为内皮祖细胞(EPCs)表面标记之一,EPCs 是能分化为m管内皮细胞的前体细胞,不仅在胚胎发 育中起作用,而凡在成人机体的血管新生中同样起重 要作用.由于CD.能突出地显示较小的和不成熟的 微血管或单一的内皮细胞,因此我们把CD标记的 内皮细胞及其微血管作为新牛血管进行计数. 本研究示,TSA(30mg/kg,60mg/kg)能够明 显减轻缺血大鼠皮层运动感觉区神经细胞的损伤;增 加梗死周围区神经细胞,内皮细胞以及胶质细胞 VEGF的表达,同时,相应区域CD.标记的微血管数 目也密集分布,表明VEGF的表达和血管新生的趋势 基本一致.VEGF阳性细胞及新生微血管集中在梗死 周啊区,并向梗死中心区延伸,距离梗死区越近表达量 越多,距离越远表达则越少,推测坏死导致的炎症细胞 趋化反应信号可能参与了VEGF的表达.另外我们 还观察到.在缺血对侧脑组织对应的部位也有较多的 VEGF阳性纳胞和微血管出现,提示局灶性脑缺血可 引起健侧脑的修复反应,但足如何影响健侧神经血管 的功能重建及其作用机制尚待进一步研究. 脑缺血后,缺血缺氧启动组织损伤修复机制,建立 新的侧支微血管网,积极向梗死区提供营养以及血运 支持,保护缺血半暗带尚未坏死的神经细胞的功能,阻 止组织进一步变性坏死.这种代偿性血管新生反应使 得损伤脑组织得到一定修复,血管新生的程度与范围 直接关系到梗死灶周围血流的改善,影响神经功能的 恢复,从而决定预后.TSA干预后有可能加强了这 一 内源性代偿机制,激活了脑内神经细胞,内皮细胞和 胶质细胞大量表达VEGF,引发了VEGF信号介导的 一 系列神经保护,神经发生和促血管生成的病理生理 反应,活化了神经和血管之间的相互作用,从而加快神 经,血管系统的修复与重塑,改善了肢体的运动感觉功 能. 治疗性血管新生是通过适当途径,给予外源性基 因,蛋白或其他药物,以促进血管生成.经过逐步深入 研究,TSA在脑缺血亚急性期的促血管新生作用有可 能为缺血性疾病提供一种新的治疗选择. [参考文献] [1]李泽松,李德良,黄,等.心血管相关基因芯片的制备及其知母皂 苷作用机理研究中的应用EJ].药学,2003,38(7):496—500. Eel金有豫,耿朝晖.知母皂甙D对于心肌缺『f『L/复灌性损伤的保护作用 的分析EJ].首都学院,1994,15(2):138. [3]吴非,钟雷,程玉芳,等.知母总皂对脑缺血再灌注损伤的保护机制 [JJ.中国临床康复,2006,10(31):22—24, E4]KoizumiJ,YoshidaY,NakazawaT,ela1.Experimentalstudiesof ischemiabrainedema.】:Anewexperimentalmodelofcerebral embolisminratSinwhichrecirculationcanbeintroducedintheis chemicareaEJ].JpnJStroke,1986,8:l一8. [5]FeeneyDM,GonzalezA,I,awWA.Amphetamine,haloperidoland experienceinteracttoaffecttherateofrecoveryaftermotorcortex injuries[J].Science,1982,217:855857. [6]WeidnerN,Scruple儿,WelchWR,ela1.Tumorangiogenesisand metastasis—correlationininvasivebreastcarcinomas[J].NEngl1 Med,l9(j1,324:18. [7~EmanueliC,SchratzbergerP,KirchmairR,eta1.Paracrinecontrol ofvascularizationandneurogenesisbyneur0trophins[J].BrJPhar— macol,2003,140:6146]9. [8]KalkaC,MasudaH,TakahashiT,eta1.Transp1antationofexvivo expandedendothelialprogenitor(:ellsforthene.vascu1arizat1.n[J]. 1roeNatlAcaDSciUSA,2000,97(7):3422—3427. [9]XIONGZheng—wen,XUChangfu,IIHongwei,eta1.Comparison ofCD34,CD3landFVIIIservedaslabelstoshowthemicrovascular densityinnon—smallcelllungeancerEJ].ChinJThoracCardiovasc Surg,2003,19(4):223225. [10]KrupinskiJ,KaluzaJ,KumarI,eta1.Roleofangigenesisinpa tientswithcerebralischemicstroke[J].Stroke,l994,25:1794 1798. (收稿H期:20080902)