在高于米氏常数的底物浓度下用积分法测定尿酸酶活性

在高于米氏常数的底物浓度下用积分法测定尿酸酶活性 作者:廖飞,朱小云,王咏梅,曾昭淳,左渝萍 【关键词】 尿酸酶 【Abstract】 AIM: To test the reliability of the integrated method for the assay of enzyme activity at substrate concentration above the MichaelisMenten constant (Km). METHODS: Uricase reaction curve was monitored by absorbance at 293 nm, and it was fit to the integrated MichaelisMenten rate equation with the predictor variable of reaction time for irreversible, single substrate reaction with the background absorbance as a nonlinear parameter while Km as a preset constant. RESULTS: Vm was sensitive to residual substrate concentration while it was resistant to the background absorbance. With residual uric acid below 2.5 μmol/L, there were no differences among Vm at initial substrate concentrations from 10 to 70 μmol/L. There were linear responses of both Vm and initial rates to the amount of uricase with initial substrate concentration at 25 or 70 μmol/L if the residual substrate was below 2.5 μmol/L. The lower limits of Vm by this integrated method showed no difference at these two initial substrate concentrations and were comparable to those of initial rates. But the upper limit of Vm was twice above that of initial rate, and this difference was more pronounced at lower substrate concentrations. CONCLUSION: This integrated method with reaction time as the predictor variable in the integrated rate equation is reliable for enzyme activity assay at substrate concentration above the Km. 【Keywords】 The integrated Method; uricase; initial rate; predictor variable; upper limit; substrate concentration; enzyme activity assay 【摘要】 目的: 以尿酸酶为模型，考察在底物浓度高于酶米氏 常数(Km)时用积分法测定酶活性(Vm)的可靠性. : 用293 nm光 吸收记录尿酸酶反应曲线. 用以反应时间为自变量的积分速度方程， 以尿酸酶Km为常数而本底为非线性拟合尿酸酶反应曲线，搜寻 对应最好拟合的Vm. 结果: 此积分法测定Vm主要受剩余底物浓度 影响，本底基本没有干扰. 剩余底物低于2.5 μmol/L时用10~70 μmol/L起始底物所得Vm无差异. 用25和70 μmol/L起始底物浓度 时初速度和Vm都与酶量呈正比. 在此两种底物浓度下积分法的下限 相同，且与初速度法下限无明显差异. 但用积分法测定酶活性的上限 明显高于初速度法，而且起始底物浓度越低则差异越显著. 结论: 在 积分法中使用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线， 在高于Km的底物浓度下能可靠测定酶活性. 【关键词】 积分法; 初速度; 尿酸酶; 自变量; 上限; 底 物浓度; 酶活性测定 0引言 底物浓度受成本、溶解度或仪器直接测定底物的范围限制时，测定酶反应初速度上限通常很低. 用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，可用很低浓度底物测定最大反应速度(Vm)，而且上限很高,1-4,. 此积分法可用于单底物和双底物酶,3,，还可用于筛选酶抑制剂,4,. 理论上此积分法所测定Vm应和底物浓度无关,2,. 但当底物浓度高于芳香酯酶酶米氏常数(Km)的25,,2,，或高于谷胱甘肽S转硫酶观Km一半,3,，积分法所得Vm随底物浓度升高而逐步降低. 当酶Km很低且定量灵敏度很低时，积分法需要较高底物浓度才能获得足够数据用于曲线拟合. 但在较高底物浓度下此积分法是否可靠还未确定. 尿酸酶反应曲线容易测定，动力学过程简单,5,. 我们用纯化的candida utilis尿酸酶为模型，考察在高于酶Km的底物浓度下用积分法测定酶活性的可靠性. 1材料和方法 1.1材料 尿酸和candida utilis尿酸酶(EC 1.7.3.3)购自ICN, candida species 尿酸酶购自Sigma. 其余试剂为分析纯. 1.2方法 1.2.1反应曲线记录缓冲液为50 mmol/L硼酸钠(pH 9.2, 含50 mol/L铁离子络合剂二乙基三氨基五乙酸) ,5,6,. 测定体系含1.0 mL缓冲液，及适量底物和酶液共1.20 mL. 用Shimadzu UV 265在 (25?1)?记录启动反应30 s后的吸收变化曲线，间隔为10 s，直到光吸收变化降低到刚开始阶段的10,以下. 初速度为从对应起点开始反应半分钟的平均速度. 1.2.2测定Vm取尿酸在293 nm的消光系数(ε) 为11.5 (mmol/L)-1 ?cm-1. 对于存在恒定本底的反应体系，任意反应时刻(ti)的吸收(Ai)同尿酸浓度(Si)关系为Eq(1). Ai=ε×Si+Ab(1)设初始尿酸浓度为S0, 将其单底物不可逆反应速度方程积分得Eq(2),1-3,7-9,. ln(S0/Si)+(S0-Si)/Km=(Vm/Km)×ti(2)以启动反应40 s的数据点(ts, As,0)为起点(其吸收A0,s为起点吸收而反应时间为零，即t’i=ti-ts). 双倒数分析独立测定candida utilis尿酸酶Km 为12.5 μmol/L(未发表数据). 把被分析酶的Km设为对应的固定常数，则根据Eq(1)可将Eq(2)左边转变成yi. yi=ln(A0,s-Ab)+A0,s/(ε×Km)-ln(Ai-Ab)-Ai/(ε×Km)(3)长下调到-0.020)，据误差传递确定yi的误差，以其误差平方的倒数加权，方差分析为判据，用Eq,4,非线性拟合反应曲线,1-6,， yi=a+b×t’i(4)或同时以Km 为非线性参数拟合反应曲线，对应最好拟合的参数Ab, Vm/Km ,Eq(4)中的斜率,组合为所需参数，根据预设常数Km计算得Vm ,1-3,. 用经典积分法时数据转换同文献，仍然用本底为非线性参数在相同范围调节搜寻对应最好拟合的参数,7,. 1.2.3程序设计参照以前用Qbasic 4.5编写，数据转换和加权因子相应按上述方程确定,1-3,8,9,. 统计学处理: 用决定系数(R2)判断用Eq,4,拟合反应曲线及酶活性对酶量响应曲线的线性程度，用单因素方差分析比较均值的差异. 2结果 以Km为常数时此积分法测定candida utilis尿酸酶Vm受剩余底物浓度影响;但不受本底干扰. 初始尿酸为70 μmol/L时，剩余底物从2.5 μmol/L升高到10 μmol/L 使Vm增加50%;但剩余底物浓度在2.5 μmol/L以下变化所引起的Vm变化0.995 (n=5). 剩余底物低于2.5 μmol/L时用10~70 μmol/L底物所得Vm无显著差异而初速度随底物浓度呈显著变化 (Tab 1). 用此积分法在70 或25 μmol/L底物时所得Vm对尿酸酶量都成正比(Fig 1，回归分析决定系数>0.998). 以偏离响应直线小于回归估计标准差的两倍为界限，在25 μmol/L尿酸时此积分法测定Vm的上限同用70 μmol/L尿酸时相比无差异. 以回归估计标准差两倍为下限，只要剩余底物低于2.5 μmol/L，在上述两种底物浓度下测定Vm 的下限也无差异. 但初始底物为70 μmol/L时需要更长的反应时间才能达到所要求的剩余底物浓度.表1初始底物浓度对不同方法测定尿酸酶活性的影响(略)