胚胎移植

动物胚胎移植技术研究与应用进展 姓名：王***  学号：******* 学院： 动物科技学院    专业：制药专业    班级：08级2班 摘要： 胚胎移植(Embryo transfer) ：是将从配种后的良种母畜(供体)体内取出的早期胚胎，或者是由体外受精及其他方式获得的胚胎，移植到同种的生理状态相同或相似的母畜(受体)体内，使之继续发育成为新个体的过程，所以也称作借腹怀胎。胚胎移植技术不仅在研究动物卵子和卵母细胞的成熟、受精过程、胚胎早期发育以及胚胎与子宫内环境的关系等繁殖生物学问题上有着重要的应用,而且在促进动物体外受精技术、性别鉴定技术、转基因技术、胚胎分割技术和核移植技术等方面也起着至关重要的作用。随着这一技术的日趋发展和成熟,它已与发情控制、人工授精、超数排卵、动物克隆等现代生物技术和遗传育种理论紧密地结合在一起,在畜牧生产中显示了广阔的应用前景。 关键词：牛羊等家畜  ；  胚胎移植  ； 状况及推广应用；   引言     胚胎移植技术作为现代生物技术中的一项重要的应用技术,将会随着研究的不断深入而不断完善、成熟.对胚胎移植相关学科和相关技术的研究,将会使人们对哺乳动物生殖机理有更进一步的认识,以解决目前还未彻底解决的问题,同时也将会加快动物生产性能的改良速度,特别在家畜育种方面将会实现常规选择和杂交不能实现的目标,从而培育出更多的符合人类需要的理想的动物品种 1.    胚胎移植的发展概况 1.1世界胚胎移植的发展情况 胚胎移植是1890年由英国学者Walter Heapel用兔子试验成功。 20世纪30年代以后，胚胎移植的研究越来越多，在多种家畜相继获得成功： 1933年Nicholas利用大鼠进行胚胎移植的研究又获成功，同年Cole & Millertjh 用 PMSG诱导排卵获得成功。 1934年绵羊（Warwick）胚胎移植获得成功。 1934年山羊（Warwick）实施了自身重移植获得成功。 1949年Warwick＆Berry又一次在山羊做了一次胚胎移植。 1949年Umbaugh做了奶牛胚胎移植，但发生流产。 1951年 Willett 等做猪的胚胎移植获得成功。 1951年 Kvasnickii在奶牛的胚胎移植获得后代。 1964年　Mutter等首次利用非手术法成功地对奶牛实施胚胎移植。 1965年Robinson的发情同期化试验获得成功。 1968年由Chang在雪貂上获得成功，表明野生动物的胚胎移植也开始研究 1972年，Whitenham et al.对鼠的胚胎冷冻保存获得成功。 1978年Steptoe & Edwars的人类第一例试管婴儿研究的成功。 1979年Willadsen成功地对胚胎进行分割 1.2我国胚胎移植技术的发展情况：(以牛、羊为例) 1.2.1我国牛胚胎移植发展情况 我国牛胚胎移植技术于1997年开始研究，1980年最为活跃。此时各大农业院校、科研 院所都在从事胚胎移植试验，但由于当时的国际交流少，牛胚胎移植技术和方法的研究进展 不快。)1985年后，随着联合国的大力资助，国际交流的加强，最先进的技术和设备的引进，我国牛胚胎移植的技术水平提高很快，此时牛头均获可用胚5.54枚、鲜胚移植受胎率达到 45%。但由于当时全国的良种奶、肉牛的价格低，移植产活一头良种牛比买一头良种牛要贵得多，牛胚胎移植商业运作受阻，绝大部分项目被迫停产，只有少数重点实验室在进行学术性研究。近年来，我国奶、肉牛产业化进程加快，高产良种奶、肉牛的供求缺口很大。用胎 移植方法解决高产良种牛短缺，成为极为有效的途径。目前我国牛的超数排卵、同期发情、胚胎移植、胚胎冷冻、胚胎分割、性别鉴定等技术已与国外基本同步。在正常情况下，平均每头供体牛获可用胚5.6枚，鲜胚移植受胎率为55%~70%，冻胚移植受胎率为45%~60%。前几年每年实际移植受体牛在6000头以上. 1.2.2 我国羊胚胎移植研究特点 2.1　品种多元化　我国于1974年和1980年分别在绵羊和山羊鲜胚移植上取得成功,于1980年和1987年冻胚移植获得成功,当时用于胚胎移植研究的羊品种比较单一。自1995年开始,我国从国外引进波尔山羊,用于改良本地山羊,许多地方通过胚胎移植技术迅速扩大了纯种波尔山羊的数量。截至2001年,通过胚胎移植出生的波尔山羊数量达到2 000只以上,用于胚胎移植供体羊的绵羊品种有德国肉用美利奴、萨福克羊、无角陶赛特羊、特克塞尔羊、洛来羊、波德代羊、兰德瑞斯羊、以及最新引进的杜泊羊等。为了顺应养羊业发展趋势和适应市场需求,这些供体羊的共同特点是都为肉用品种羊。 2.2　操作逐步走向化　20世纪70年代初至80年代中期,中国科学院遗传研究所、中国农科院畜牧所、西北农业大学等单位开展牛、羊胚胎移植的试验研究,并先后在绵羊、牛、山羊上获得成功,但由于实验头数少,经费投入有限,好多操作都靠逐步摸索、总结,还没有足够的实践经验使胚胎移植操作实现程序化。随着试验群体的扩大和国内外胚胎移植学术交流的不断加强,我国的羊胚胎移植工作已经逐步走向规范化,胚胎移植操作规程基本成熟。 2.3　移植成功率不断提高　随着我国养羊业的不断发展和羊胚胎移植工作的大规模开展,胚胎移植及相关技术逐渐成熟,头均可用胚胎数和移植妊娠率不断提高。其中波尔山羊的胚胎移植效果最为显著(见表1)。据1999~2001年召开的3次全国养羊生产交流会不完全统计,波尔山羊超排头均可用胚胎大都超过10枚;新鲜胚胎移植妊娠率在50%~70%. 2 胚胎移植的应用范围 （1）在家畜改良方面的应用  人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种效能。但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是如此。通过超数排卵和胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer:MOET)牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80%和70%；产奶性状提高33%。 （2）在特定品种扩繁上的应用  牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要7-8个世代，15-20年。而采用MEOT法，一次就可获得一个纯种群体。n80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁。n2000年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移植进行扩繁的。 （3）在动物生物多样性上的应用 在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。 （4）其它方面应用 ①胚胎移植是克隆技术的必须过程；体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的继续 发育。 ②转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚胎移植 3 胚胎移植的生理学基础及原则 3.1胚胎移植的生理学基础 1．母畜发情后生殖器官的孕向发育   大多数自发排卵的家畜，发情后不论是否配种，或配种后是否受精，生殖器官都会发生一系列的变化，如卵巢上黄体形成，孕酮的分泌和维持，子宫内膜组织的增生和分泌机能的增强，这些变化都为胚胎的着床、发育准备了条件。在正常情况下，发情、配种、受精和妊娠都是连续发生的、不中断的自然生殖规律。所以，从生理过程看，母畜的每一次发情、配种都是受精、妊娠的前奏。由此可见，配种后受胎的母畜与未受胎的母畜在发情后的最初数日或十多天，其生殖系统发生的变化是相同的，而且在相同的时期，母畜所处的生理状态也大致相同。只是到了一定期限(相当于周期黄体的寿命，时间长短固动物品种不同而异)，配种后受胎的母畜其生殖系统朝着妊娠的方向继续发生变化以适应胚胎发育的需要，如黄体的持续存在及孕酮的高水平分泌和维持，子宫内膜的持续发育和为胚胎提供组织营养的加强。而对于配种后未受胎的母畜，其生殖系统则会退回到发情前状态，这时其黄体消失，子宫内膜复原。因此，排卵后形成的黄体，只有在这时才能判断是妊娠黄体还是周期黄体。此后，未受胎的母畜重新表现发情，生殖器官再一次开始为受精和妊娠作准备，重复上述过程。可见，在发情后的最初一段时间(周期性黄体期)，不论是否配种或受精，母畜生殖系统均处于受精后的生理状态之下，在生理现象上，怀孕和未孕并无区别。妊娠特异性的生理变化是在这个阶段之后才逐步出现。因此，发情后母畜生殖器官的孕向变化是进行胚胎移植时，受体母畜接受供体母畜胚胎并代之完成妊娠、分娩过程的主要生理学基础。只要移植时受体的生理状态与胚胎的发育阶段相适应，胚胎即可继续发育。 2．早期胚胎的游离状态   胚胎移植技术得以实施的另一个重要的生理学依据是胚胎在发育的早期有相当一段时间是游离存在的。这时的胚胎尚未与母体建立起实质性的联系，其发育主要靠自身贮存的养分。这样，将胚胎从母体内取出，在短时间内胚胎不至于死亡，而当将胚胎置入与母体相类似的环境中时，胚胎可以进一步发育成新个体。 3．胚胎移植基本不存在免疫问题   受体母畜的生殖道对于植入的具有抗原性质的胚胎，一般来说，在同一物种之内并不产生排斥现象。这一点对于将胚胎移植技术应用于生产实践是极为有利的。但是在猪，胚胎自体移植的受胎率及产仔率均高于异体移植。 4．胚胎和受体的联系   经移植的胚胎，如果得以存活，胚胎必将在较短的时间内和受体母畜的子宫内膜及其内分泌系统建立起生理上和组织上的联系，从而确保正常发育所需要的环境和营养物质。 5．胚胎的遗传特性   胚胎的遗传物质来源于供体母畜及与之交配的公畜，受体母畜对胚胎并不产生遗传上的影响，不会改变新生个体的遗传特性，也不会减弱其优良性状在出生后的表现程度。 3.2胚胎移植的基本原则 3.2.1．胚胎移植前后所处环境的一致性 指胚胎移植后的生活环境与胚胎的发育阶段相适应，具体包括以下几个方面。 (1)供体和受体种属上的一致性   即二者属于同一物种，但这并不排斥种属不同但在进化史上血缘关系较近、生理和解剖特点相似个体之间胚胎移植成功的可能性。一般来说，在分类学上亲缘关系较远的物种，由于胚胎的组织结构、胚胎发育所需要的条件以及发育进程差异较大，经移植的胚胎绝大多数情况下不能存活或只能存活很短时间。例如将绵羊、猪、牛的早期胚胎移植到兔的输卵管内，仅可存活数日。胚胎日龄的增加更降低了异种之间胚胎移植成功的可能性。 (2)生理上的一致性 即受体母畜和供体母畜在发情时间上的同期性。一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降。 (3)胚胎收集和移植部位的一致性 即从供体输卵管内收集到的胚胎应该移植到受体的输卵管内，从供体子宫内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫内。   胚胎移植之所以要遵循上述同一性原则，是因为发育中的胚胎对于母体子宫环境的变化十分敏感，后者在卵巢类固醇激素的作用下，处于时刻变化的动态之中。在一般情况下，受精和黄体形成几乎是在排卵后相同时间开始的，受精后胚胎和子宫内膜的发育也是同步的。胚胎在生殖道内的位置随胚胎的发育而移动，胚胎发育的各个阶段需要相应的特异性生理环境和生存条件。生殖道的不同部位(输卵管和子宫)具有不同的生理生化特点，与胚胎的发育需求相一致。了解了上述胚胎发育与母体生理变化的原理，就不难理解受体母畜与供体母畜生理状况同期化的重要性。一旦胚胎的发育与母体生理状况的变化发生脱节或紊乱，这将意味着彼此之间的关系遭到破坏，其结果将导致胚胎的死亡或流产。 3.2.2．胚胎发育的期限   从生理学的角度讲，胚胎收集和移植的期限不能超过周期黄体的寿命，最迟要在周期黄体退化之前数日以及胚胎附植之前进行。因此，胚胎收集多在发情配种后的3～8天内进行，受体在相同的时间内接受胚胎移植。 3．2.3胚胎的质量     在胚胎移植的操作过程中，胚胎不应当受到任何不良因素(物理的、化学的、生物的)的影响，移植的胚胎须经过鉴定确认是发育正常的。 按照上述原则，胚胎移植只是胚胎生存空间位置上的改变，而不是生理环境的改变。这种空间位置上的改变不会影响胚胎的生长发育。所以将胚胎从一头母畜直接移植到另一头母畜，或经过运输再移植，仍可以存活并正常发育，直到分娩。胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序包括供体和受体的准备，供体超数排卵处理和配种，胚胎的收集，胚胎的检查，胚胎移植等     为了从供体母畜得到较多供移植的胚胎，需对供体母畜进行超数排卵处理。同时，胚胎移植成功与否和供体、受体发情同期化成度密切相关，故需人为地控制供体和受体地发情时间，进行同期化处理。所以，超数排卵和同期发情是进行胚胎移植必须首先完成地两个基本步骤。 4 胚胎移植的技术程序 4.1 供体和受体母畜的准备 供体应该是良种母畜，不仅应具有较高的育种价值，而且应该有良好的繁殖机能。经产母畜应在生殖机能恢复正常后方可作为供体。如猪和牛在分娩两个月后方可用作供体母畜，已证明对超数排卵处理发应良好的母畜可反复用作供体。   每头供体需准备数头受体，受体母畜可选用非良品种的个体，但应具有良好的繁殖性能和健康状态，体况中上等。在拥有大量母畜的情况下，可选择与供体发情时间相同的自然发情个体作受体，供体与受体母畜发情时间前后相差不宜超过一天。由于在一般情况下难以找到足够数量的自然发情母畜作受体，所以多采用对受体母畜进行同期发情处理，其方法见发情控制技术。         如图（胚胎移植的过程） 4.2超数排卵处理     在母畜发情周期中的适当时间，注射促性腺技术，是卵巢上有比自然生理状态下更多的卵泡发育并排卵，这种方法称超数排卵（Superovulation），简称超排。   1．超排处理的意义 很显然，如果不能得到足够数量的胚胎，就无法充分发挥胚胎移植的优势。所以对供体母畜进行超排处理已成为胚胎移植技术程序中不可缺少的一个环节。     从理论上讲经超排处理后排出的卵子越多越好，而事实上如果一次排出的卵子太多，往往会因为促性腺激素使用剂量过大而影响胚胎的质量，出现受精率降低，同时胚胎的收集率也降低。对于牛和羊一般认为一次排出10－15枚卵子的超排效果较为理想。     2．超排处理方法 在母畜发情周期的适当时期，利用外源性促性腺激素处理，增进卵巢的生理活性，诱发许多卵泡同时发育成熟并排卵。     （1）母牛 在发情周期的第16或17天肌肉或皮下注射PMSG1500－2000IU。该方法是按照发情周期的规律，在黄体期即将结束，卵泡期即将来临前，顺势促进较多的卵泡生长和成熟。这种超排方法必须和发情周期的进程配合好，所以在时间安排上受到限制，应用很不方便。另一种方法是在发情周期的中期，在注射促性腺激素的同时，注射或子宫灌注PGF2a 或其类似物以溶解黄体。一般是在发情周期第10～13天内进行。具体做法是在注射PMSG后，隔日肌肉注射PGF2a或5～10mg，或子宫灌注PGF2a2～3mg。如用FSH，则连续注射4～5天，每天两次，总剂量为30～40mg（国产品400～500大鼠单位），在第5次注射FSH的同时注射PGF2a。     （2）母羊 在发情周期的第16～18天，一次肌注（或皮下）PMSG750～1500IU，或每天注射两次FSH，连3～4天，出现发情后或配种当日再肌注hCG500～700IU。也可象母牛一样，在发情周期中期处理，即在注射PMSG之后，隔日注射PGF2a或其类似物。如采用FSH，用量为10～20mg（或200～300大鼠单位），分3天6次注射，第5次同时注射PGF2a。     用PMSG超排处理牛、羊，虽然使用方便，仅需注射一次，但由于其半衰期长，会产生后效应，导至发情期延长。因此，用PMSG进行超排受到局限，结合注射PMSG抗血清可以消除半衰期过长的副作用。目前多采用FSH进行超排，连续注射3～5天，每天2次，剂量均等或递减，效果较好。     超排效果受动物的遗传特性、体况、年龄，发情周期的阶段、产后时间的长短、卵巢功能、季节、激素的品质和用量等多种因素影响。所以，不同的品种，不同的个体，对超排处理的反应差异极大，超排效果很不稳定。这方面迄今仍是胚胎移植中有待改进的问题之一。4.3供体母畜的配种     经超排处理夫人，母畜，在表现发情后，应根据育种的需要，选择优良公畜的精液，适时进行人工授精。为了得到较多得发育正常的胚胎，应使用活率高、密度大的精液，而且可适当的增加人工受精的次数，两次受精间隔8～10个小时. 4.3.1胚胎的收集     胚胎的收集是利用冲卵液将胚胎由生殖道中冲出，并收集在器皿中。收集胚胎有两种方法，即手术法和非手术法，前者可用于各种家畜胚胎的收集，后者仅适用于牛、马等大家畜，且只能在胚胎进入子宫角后收集。     收集胚胎时应考虑配种时间、排卵的大致时间、胚胎运行的速度和发育阶段等因素。只有这样才能顺利地完成胚胎的收集过程，并得到较高的胚胎回收率。各种家畜授精后胚胎发育的速度和运行情况见表。     胚胎收集的时间不应该早于排卵后的第一天，最早应在受精卵完成第一次卵裂之后，否则不易辨别卵子是否受精。收集时间一般在配种后的3～8天，牛最好是在配种后的6～8天，即胚胎发育至桑椹胚或者早期囊胚，以便非手术法收集和移植。     1．手术法收集胚胎 根据畜种的不同及外科手术的要求，在腹中线或腹侧作一切口，先将一侧输卵管及子宫角移出腹腔，用注射器吸取冲卵液注入输卵管或子宫角内进行冲洗，并观察卵巢上的排卵情况。然后将该侧送回腹腔，并移出另一侧，用同样方法进行冲洗。 手术法冲洗胚胎有以下几种方式。一种方式是用注射器的磨钝针头刺入子宫角顶端，注入冲洗液，然后再输卵管的伞部接取冲卵液，这种方式适用于牛、羊、兔等。另一种方式冲洗的方向与此相反，即由伞部注入冲洗液，在子宫角上端接取。猪和马的子宫角与输卵管的接合部有一活塞结构，用第一种方式，冲洗液不易通过，因此多采用第二种方式。上述两种方式是当胚胎还处于输卵管时采用。当确认所有的胚胎都已进入子宫角内时，可采用冲洗子宫角的方式，即从子宫角上端注入冲卵液，由基部接取，或者相反。这种方式适合于各种家畜。冲卵液用量以子宫角容积大小而异。冲卵操作，要求迅速准确，以防止对伤口、生殖器官和冲卵液的污染，力求避免给动物带来刺激和对生殖器管造成损伤。一般来说，术后生殖器官容易发生不同程度的粘联，严重时会造成不孕，这是手术法收集胚胎最大的缺点。冲洗之后，应立即缝合伤口，母畜应单独饲养，并随时观察其伤口的愈合情况。 2.非手术法  非手术法主要用于牛。冲卵液多选用杜氏磷酸缓冲液（PBS）。 4.4胚胎检查方法 收集到的冲洗液移至37℃温箱内的培养皿内，静置10min。胚胎沉入培养皿底部，移去上层液，在20 倍左右的解剖显微镜下检查，然后在放大到50～100倍. 非手术法收集胚胎 牛、马也可采用非手术法收集胚胎，由于它比手术法简单易行，而且对生殖器官的伤害程度较小，因此在生产中较多采用此法     牛的非手术法收集胚胎可利用双通式或三通式导管冲卵器，其差别在于双通式采卵器冲卵液注入和流出是经同一管道完成的，而三通式采卵器冲卵液的注入和流出是经过两个不同的管道完成的。无论是双通式还是三通式，其外管前端均连接一气囊。当冲卵器插入子宫角内时，充气冲卵液流入子宫体并沿着子宫颈口流出。每侧子宫角需冲卵液100～500ml。冲卵液的导出应顺畅迅速，并尽可能将冲卵液全部收回。为此，冲卵时最好用手在直肠内将子宫角提高并略加按压，以利于冲卵液流出。胚胎的回收率与冲卵液回收的完全程度呈正相关。 应用非手术法收集胚胎时，只有当胚胎都进入子宫角后方可进行。显然，这种方法无法收集停留在输卵管内的胚胎，因此，用非手术法收集牛、马的胚胎时，一般在配种后的6～8天进行。     收集胚胎的冲洗液有多种，主要有杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），布林斯特氏液，合成输卵管液（SOF），惠屯氏液，Ham’s F－110以及TCM－199，尤以D-PBS最常用。它们除含有多种盐外，还含有多种有机成分，不但可用于胚胎收集，还可用于胚胎体外培养，冷冻保存及解冻等。     收集胚胎的冲洗液可不含牛血清白蛋白，培养和保存时则需加入，或以胎犊血清代替。血清白蛋白的含量一般为0.3～1％，犊牛血清需在56℃时持续灭活30分钟，冲卵液、培养液中血清的含量一半分别为5％、10～20％。 4.5 胚胎保存 4.5.1 、异种活体保存 4.5.2、常温保存 4.5.3、低温保存 4.5.4、冷冻保存： 1、常规的慢速冷冻  尽管低温生物学有了许多发展，但新的胚胎冷冻方法却很少用于生产实践。目前，大多数的哺乳动物胚胎采用传统的慢速冷冻方法冷冻保存，使用渗透较快的低温保护剂，缓慢的冷却速度和比较快的解冻速度。传统的慢速冷冻方法分为以下几步：1）室温下胚胎置于小分子量可渗低温保护溶液中（如乙二醇、甘油、二甲基亚枫或丙二醇），且在胚胎和冷冻保护液之间达到平衡；2）一般在-5℃～-7℃植冰；3）可控的、缓慢降温（0.33～1.0℃／分）；4）降温到-30℃或-70℃时，投入液氮中保存；5）快速解冻；6）在培养或移植前，在室温下除去低温保护剂，为保持细胞的正常生理功能。每一步冷冻方法都是至关重要的。 2、玻璃化冷冻 玻璃化冷冻定义为在冷冻液处于完全玻璃化状态下冷冻保存细胞，组织或器官（Rall，1985）。为在一定冷冻速度下形成玻璃化（直接投入液氮，-2500℃/分）。需要使用高浓度的可渗低温保护剂，然而，浓度过高会对细胞有毒害作用。从理论上讲，如果要以-1500℃/分的速率进行降温，那么，1.5M的任何低温保护剂都可以形成玻璃化，但这需要昂贵而复杂的仪器。近几年，人们通过减少冷冻液的体积和冷冻液与冷冻和解冻直接接触的方法来提高冷冻和解冻速度，从而最大限度的减少冷冻液对胚胎的损害，其中OPS法（Vajta，1998a；1998b）和cryoloop（Arav，1997；Martino，1996；Papis，2000）法获得较好的效果。 4.6胚胎的移植：   4.6.1  手术法移植   在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，然后用注射器或移植管将含有胚胎的培养液或冲冼液注入到子宫角内或输卵管内。 4.6.2    牛非手术法胚胎移植操作步骤 1 、受体牛在发情后6—8天之间均可进行移植（发情之时定为0小时）。移植前对受体牛进行直肠触摸，检查黄体是否合格。合格者用于移植。 2、 在移植之前必须先进行尾椎硬膜外麻醉 ，擦拭外阴部。 3、 对照供体牛采胚记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配受体和胚胎。 4、 解冻胚胎。 5、 重新将胚胎装入0.25ml塑料细管（直接解冻移植法不需要重新装管）。 6、 细管装入移植枪。 7、 把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软外套。 8、 将胚胎移植到受体黄体侧的子宫角大弯处。 9、 做好受体移植记录。 4.6.3、妊娠的受体牛的饲养管理 1、 在移植后70—90天对受体牛进行妊娠检查，对已妊娠的受体要加强饲养管理，避免应激反应。 2、 妊娠受体在产前3个月要补充足量的维生素、微量元素，适当限制能量摄入，既要保证胎儿的正常发育，又要避免难产 5  胚胎移植的影响因素 5.1.1 胚胎的来源 胚胎的获得有两种途径，一是卵子和精子的结合是在体外环境中完成的，即体外胚；另一种则是体内胚。体外胚的生产是解决胚胎成本高、来源匮乏的有效办法。但经卵母细胞的体外成熟、体外受精以及早期胚胎的体外培养所获得的体外胚胎与通过超数排卵技术在体内完成受精所获得的体内胚胎相比发育潜力明显低，移植后的受胎率也低。目前，体外胚的受胎率一般在10%～30%之间。经胚胎超微结构的研究表明，牛体外受精胚胎的细胞间连接数量明显少于体内胚胎，内细胞团的细胞之间的紧密程度低于体内胚胎，卵裂球的胞质中出现高度的囊泡化，这被人们普遍认为是体外胚妊娠率低的主要原因。但是随着体外受精技术和其他配套技术的不断完善，尤其是牛活体采卵技术的应用，体外胚移植效率将得到很大的提高。 5.1.2 胚龄 牛非手术采卵大都在发情后的第7 d(6～8 d)，胚胎移动到子宫角时进行子宫胚胎采集。获得的胚胎胚龄为7(6～8)日龄，这时的胚胎处于桑椹或囊胚期。由于囊胚期胚胎的内细胞团细胞数量多，细胞对不良环境因素的耐受力强，进一步发育的潜力要比桑椹期胚胎大，因此在早期胚胎的体外培养体系中大都以囊胚发育率作为衡量胚胎培养效率的指标。总之，在供、受体牛发情相应同期的情况下，囊胚移植妊娠率要比桑椹胚高。 5.1.3胚胎的冷冻保存 胚胎超低温保存以及解冻的技术已相对成熟，但冷冻和解冻的过程对胚胎的细胞仍有伤害。在操作合理的情况下，冷冻和解冻后的胚胎存活力下降20%左右。如牛鲜胚移植的受胎率在50% 左右，而冻胚的移植受胎率则为40%左右。尽管如此，胚胎的冷冻保存仍是胚胎移植不可缺少的技术环节之一，它可以使胚胎移植不受时间和空间的限制，从而使胚胎移植技术的应用更具广泛性。 5.1.4 胚胎的数量 一般情况下，1 头受体牛1 次只植入1 枚合格胚胎，但如果有2 枚负C级胚胎，也就是说，这2 枚胚胎发育潜力不大，但又有进一步发育的可能，如果将它们单独移入，则发育成胎儿的可能性很小，但将它们同时植入1 头受体牛子宫内，其发育成 1 个甚至2 个胎儿的机会就大大增加了。理论上的依据是2 枚胚胎与1 枚胚胎相比，2 枚胚胎向受体母牛传递信息的生物信号更强，胚胎与母体之间易建立妊娠联系，所以受孕机会大。 5.1.5胚胎的发育潜力 胚胎的发育能力一般可由形态学鉴定来确定。但除了形态正常之外，胚胎发育的潜力也是胚胎能否存活并继续发育的重要因素。经研究发现，胚胎的发育潜力与供体母牛的生殖能力有密切关系。即生殖力正常的供体牛不仅其超排效果好，且其胚胎发育潜力要比低生殖力(不宜受胎的)母牛的大。 5.1.6 受体牛 受体牛是接受胚胎的母体，被植入其体内的胚胎存活所需的免疫环境、继续发育所需的营养环境都是由它来提供的。所以，受体牛的质量好坏直接影响胚胎移植成功率高低。 5.1.7 受体牛与供体牛发情同期化程度 受体牛与供体牛发情是否同期，也就是受体牛的发情后天数与胚胎日龄是否同步，是胚胎移植成功的关键因素。同期化程度或同步程度越高，胚胎移植成功率越高(一般差异不超过24 h)。因为子宫只允许同步胚胎发育而对非同步胚胎有毒害因素；另外，不同步胚胎被移植前后所处的生理环境不同，不能存活也不能向子宫发出它们存活的信息。那么两者之间不能建立妊娠联系，不能着床。 5.1.8 受体牛的黄体状况 黄体是卵泡成熟、破裂、排出卵母细胞后，在原处由颗粒细胞增生形成的暂时性分泌组织。它是卵巢排卵的标记，也是分泌孕酮——维持妊娠所必需的激素之一的组织。所以，胚胎移植时受体牛黄体的发育状况直接影响移植妊娠率。黄体质量的判断，不同的人有不同的感觉和经验，一般根据黄体的大小、形状和弹性来判断。另外，胚胎植入与黄体处于同侧的子宫角比植入对侧子宫角，受胎率要高。 5.1.9 受体牛的子宫、卵巢的生理状况 受体牛的子宫是胎儿整个发育过程的场所，所以子宫的健康环境和机能状况直接影响胚胎的着床和胎儿的正常发育。而卵巢的生理状况决定着维持正常妊娠所需要的多种激素水平的平衡。在实践中，主要以子宫和卵巢的大小、形状和弹性来判断。 5.1.10受体牛的孕酮水平 受体牛体内孕酮水平和变化指标可以直接反映母牛妊娠环境的好坏。上面所述的黄体质量等的检查都是通过直肠检查，凭感觉来判定的。一方面需要实践经验的积累，另外，其准确性也受到限制。通过放免(或酶免)的方法监测受体牛乳(或血)中的孕酮的水平变化，来判断牛的发情和黄体的状况更科学。在实践中，如果将两者结合起来就会更理想。 5.1.11受体的营养和健康状况 健康和营养状况良好是母牛拥有正常繁殖的前提和基础。家畜的所有繁殖活动、生殖器官或组织的变化、各种激素的合成、分泌和调节以及神经传导都要依赖物质和能量的积累和正常机能的具备。而体况(膘情、被毛的光泽等)是牛的营养和健康状况最直观的反映，所以体况良好的母牛才能被选作受体牛。 5.1.12 泌乳 泌乳活动不仅与母牛下一轮繁殖的发情、排卵、受胎、妊娠争夺营养和能量，维持泌乳所必需的促乳素也抑制卵泡发育、妊娠所必需的雌激素、孕激素的合成和分泌。处于哺乳期的母牛如果被选作受体牛，应尽快断奶，以提高其发情、排卵和移植后妊娠的比率。 5.2 其他因素 5.2.1 技术人员的操作 技术人员的正确操作是胚胎移植成功的前提和保证。室内人员必须最大程度地控制环境条件，比如周围空气的温度、湿度、清洁度；处理胚胎的液体的温度、渗透压以及暴露在外界的时间长短等等，这些因素都直接作用于胚胎，对其细胞产生不同程度的伤害。 所以避免或减少外界有害因素对胚胎的伤害是室内人员操作的基本原则。室外人员的移植操作是胚胎移植的最后一个环节。操作者的熟练程度、移植位置、内膜破坏程度、移植器械和生殖道的相对无菌程度等等这些都对胚胎移植的结果产生影响。 5.2.2 季节 现在的肉牛、奶牛品种基本都是全年发情。但是温暖、湿润、饲草充足的季节无疑更适宜母牛繁殖，这时进行胚胎移植，受胎率相对也会提高。季节对家畜繁殖的影响，实际上是由于季节变化而带来的饲料、光照、舒适度等对家畜产生生理影响(包括营养储备、生殖内分泌的调节等)，从而影响它的发情、排卵、以及受孕。 胚胎移植涉及的技术环节非常多，任何一个环节的疏忽都会导致移植的失败。只有认真、规范地完成好每一个细节，以排除对胚胎有不利影响和阻碍妊娠建立的一切内、外因素的影响，才能保证较高的移植成功率。 6  如何提高胚胎移植成功率 6.1 制定科学的品种改良实施 俗话说“兵不在多，在于精”、“畜不在多，在于良”，牲畜的良种化高低是衡量一个地区、一个地方畜牧业发展水平的高低，尤其是在市场经济条件下，政府参与，政策引导、扶持，制定切实可行的品种改良政策，实现农牧民增收意义重大，只有政府出台相应的品种改良、方案，业务部门认真实施，这样才能做到任务明确、技术有保障，平时注重检查、督促，逐渐形成一个良性循环，为牲畜品种改良工作创造一个良好的环境氛围。裕民县胚胎移植的实施是从2002年开始，当年只有8头，2003年20头、2004年223头、2005年445头，后面几年每年保证移植100头。这几年移植数量的不断增加，无疑是行政措施到位、技术得到保障、养殖户积极配合的结果。从这些年移植情况看，移植成功率平均为46%，品种主要是美国褐牛杂交一代以及荷斯坦牛。 6. 2抓好移植季节，确保胚胎移植成功率根据这些年的移植经验，受体牛的发情移植受气候的影响较大。裕民县主要是采取自然发情、、检查、移植等措施，每年基本是从4月份开始组织牛群，5月份开始移植，到10月份结束，这6个月中，5月、7月、8月上旬移植受胎率较低，这些时间因气候较冷或气候炎热，饲养管理条件相对较差，这期间当地主要是靠天然放牧而且补饲跟不上，造成母牛发情效果不好，检查卵巢质地较软，不充实，往往出现母牛只发情不排卵，移植成功率较低，而在6月、8月中下旬、9月气候凉爽，牧草生长旺盛，放牧条件较好，对于母牛的发情极为有利，移植成功率较高，这段时间牛的卵巢检查质地较充实，黄体生长良好，胚胎移植成功率较高。 6.3饲养管理  好坏直接影响母牛发情和移植效果牛的胚胎移植对受体牛要求较高，除牛的本身条件外，饲养管理水平也至关重要，管理水平的好坏对移植工作影响很大，应在移植的头一年就加强饲养管理，保证中等膘度，过瘦、过肥都不利于母牛的发情、排卵，所以平时应饲喂优质干草和补充精料。本县一养殖户2005年饲养30头母牛，由于平时只添加农作物秸秆，没有补充精料、微量元素和维生素等，在2～5月移植的20头牛中，只有6头妊娠，且有2头在妊娠40d后因饲养管理不当而流产，而另外一饲养户在2006年移植的9头牛中有7头妊娠，且成活率100%，这说明饲养户注重饲养管理，饲喂优质干草，还补充精料、微量元素和维生素。所以饲养管理水平的好坏对于牛胚胎移植的成功率非常重要，主要是影响牛的发情排卵和妊娠。 6.4加强牛群的组织管理 牛的胚胎移植工作环节较多，任何一个环节出现差错，都会影响移植的成功率，所以开展牛的胚胎移植应根据当地实际情况来组织牛群，开展移植，本县集中放牧较为普遍，所以应固定好牧工，同时做好母牛的发情观察、登记和报告工作，牛群数量应以100头以内为宜，太大不宜管理和也不易观察母牛发情，牛群太小容易造成费用增加。牛群组织前应进行生殖系统检查，生殖机能正常者组群，有异常者进行剔除，为了保证做到母牛发情观察准确、及时，对牧工和养殖户进行必要的业务培训，同时在移植期间，发情报告者必须与移植部门的业务人员联系畅通，做到发情观察准确、报告及时、检查移植到位，不论气候恶劣与否做到检查移植雷打不动，始终保持移植工作的连贯性，从不间断，只有这样才能保证较高的移植成功率。 6.5移植操作人员应操作熟练，判断准确移植检查人员应根据母牛发情后的卵巢、黄体变化情况，来判断是否移植，这一点至关重要；另一方面就是在移植过程中从各种器械的清洗、消毒到胚胎的解冻、装枪、移植都应规范，尤其是在移植过程中，应注意黄体侧位的生理变化，即哪一侧的卵巢排卵、生长黄体；进移植器时动作应轻快，不要人为损伤子宫内膜，尽量把胚胎送到子宫角深处，特别是年轻母牛子宫颈口较细，进枪困难，所以应特别注意；同时对于胚胎质量应严格把关，应从正规渠道购进胚胎，注意保存，移植完毕后，应对受体牛佩戴标识。胚胎移植定胎，应在移植后2个月开始，太早易判断失误，太晚对于没移植成功的牛造成空怀期延长，增加饲养成本。在牛的移植过程中，应尽量避免防疫注射，因为移植后防疫易造成应激反应，影响受胎。业务部门还应做好移植前、中、后期的各项档案记录工作，同时做好跟踪服务，加强管护，保证妊娠过程不中断，防止流产现象出现，在牛的整个移植工作中，还应抓好种公牛的管理，严防偷配现象发生。牛的胚胎移植是发展畜牧业良种的一项重要技术措施，涉及畜牧业多个技术环节，包括牲畜的饲养管理技术、疫病防治、繁殖技术等的应用。从牛的品种改良角度来讲，应将牛的胚胎移植工作加以推广，使该项技术工作发挥应有的作用，更好为畜牧业生产服务。 7胚胎移植技术的意义 胚胎移植被认为是继家畜人工授精技术之后家畜繁殖领域的第二次革命。人工授精技术极大地提高了优秀种公畜的利用率，胚胎移植技术则极大地增加了优秀母畜的后代数，挖掘了母畜的遗传和繁殖潜力。在畜牧业生产与科研中胚胎移植技术主要用于以下几个方面： （１）增加进口纯种畜和优秀个体的后代数。用于纯繁扩群，增加种畜的数量。 （２）缩短家畜的改良周期，加速品种改良。纯种牛的胚胎移植给黄牛，可将15－20年的改良周期变为一年，大幅度地提高了家畜的遗传品质和生产性能。 （３）用于单胎动物的育种，可缩短选择种牛的年限。如牛的MOET育种方案比后裔测定育种方法遗传进展快。 （４）移植产双胎，提高生产效率。对肉用家畜尤其有价值。同时移植双胚或双半胚或在配种后第7天前后移植一枚胚胎，可获得30%以上的双犊率。 （５）代替种畜的引进。 （６）保存品种资源。保存于具有优良遗传特性的家畜胚胎库、基因库，保护濒临灭绝的家畜和动物品种。 （７）用于一些疾病的诊断和治疗。 （８）发展家畜生物技术的研究手段。这项技术是胚胎分割、嵌合、核移植、体外受精和转基因动物等家畜生物技术不可缺少的技术革新手段，也可用于生物学和医学的研究。 7.1在牛上的具体方面 7.1.1发挥优良母牛的繁殖潜力，提高繁殖效率 一般情况下，1头优良成年母牛每年只能繁殖1头犊牛，而应用（鲜、冻）胚胎移植技术后，每年可得到15~16枚可用胚胎，直接移植后可产出10~11头优良母牛的后代，若采用冷冻胚胎移植也可产出6~7头优良母牛的后代，加速了良种牛群的建立和扩大。 7.1.2加速品种改良，扩大良种牛群自然生产的母牛，其产生的成熟卵子很少，且胚胎的发育还要在自己体内进行，妊娠期会占去一生中大部分时间。应用（鲜、冻）胚胎移植技术，可使母牛排出多数卵子，同时解除孕育胚胎的职能，会使其产生大量的后代，能够使良种牛群迅速建立和扩大，有利于选种工作的进行和品种改良规划的实施 7.1.3诱发肉牛怀双胎，提高生产效率对发情的母牛配种后再移植1个胚胎到排卵对侧子宫角内。这样配种后未受孕的母牛可能因接受移植的胚胎而妊娠，而配种后受孕母牛则由于增加了1个移植的胚胎而怀双胎。另外，也可对未配种的母牛在两侧子宫角各移植1个胚胎而怀双胎，从而提高生产效率。 7.1.4代替种牛的引进 冷冻胚胎可以长期保存，这就使胚胎移植突破了时间和空间的限制。从国外进口种牛胚胎，到国内进行移植，从而产下种牛，就会大大节约购买和运输种牛的费用。此外，利用引进胚胎在国内移植产下的种牛，容易适应当地的环境条件，又可从养母那里得到免疫力，这些都是优于直接引进活牛的优点。 7.1.5保存品种资源 胚胎可以长期保存，是保存某品种牛的理想方式，比保存活牛的费用低得多。 7.1.6克服不孕 如果优良的母牛容易发生习惯性流产或难产，以及由于其他原因不宜负担妊娠过程，可采用移植技术，让其他牛将其后代繁殖产出。 7.1.7作为育种手段 超数排卵和胚胎移植技术相结合形成了比人工授精更为先进的育种方式，可显著地缩短世代间隔，加大选择强度，提高选择的准确性，并且可以用大量的全同胞和半同胞后裔资料，避免了耗资费力而又难于实施的后裔鉴定。 7.1.8提高经济效益和生态效益 将高产奶牛胚胎移植给低产奶牛或黄牛，获得1头纯种奶牛需要7 500元，而通过人工授精技术获得1头高产奶牛需要级进改良3个世代，按每个世代产1个母犊，则需6个世代即15年才能接近其父母代的生产水平，而每个世代直接培育费需3 000元左右，6个世代需1.8万元，因此获得1头胚胎移植牛即可节约培育费1.05万元。应用胚胎生物技术，对受体牛而言，其后代产奶量将提高3.9吨，每头奶牛可增收5 850元。通过胚胎生物技术，获得1头高产奶牛缩短6个世代，可节约大量的饲草饲料资源，节省的资源可增加饲养奶牛6头，增收1.8万元。以上3项，获得1头胚胎移植牛可节支增收3.435万元左右。 8　结束语 从理论上讲，胚胎移植可以提高繁殖力无数倍，但实际应用中，就现有的技术水平所取得的结果而言，要比理论数据低得多。不过，胚胎移植在奶牛中的应用得到了飞速地发展，随着体外受精技术、性别控制技术和早期妊娠诊断技术的日益发展，胚胎移植必将有更为广阔的前景。 参考文献: [1] 闫秀林.生物技术概论[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，1994.81－86 [2]旭日干•哺乳动物繁殖生物学技术[M]•内蒙古:内蒙古大学出版社,1986•112• [3]Sreenan J M.Embryo transfer:Its uses and recent developments[J]•The veterinary Record June,1988,25:624-629• [4]Betteridge K J•Evolutionary Mechanism in sex determination[A]•Wachtel ss (Ed)[C],1989•279-289• [5]Fahning M L,Garcia M A.Status of cryopreservation of embryos from domestic animal[J]•Cryobiology,1992,29:1-18• [5]吕选忠，于宙.现代转基因技术[Ml.北京:中国环境科学出版社，2005 [6]刘大椿.科学技术哲学导论【M].北京:中国人民大学出版社，2005 [7]贾士荣.牛体外受精技术的研究进展[A]•农业生物技术进展与展望[C]•合肥:中国科技大学出版社,1993,174-187• [8]罗鹏•农业动物的胚胎移植[A]•遗传学应用[C]•北京:高等教育出版社,1996,80-89• (责任编辑:赵　鸥) [10]  罗明久•山东农业大学.生物技术概论.课件，2010，12 [11]王友想• 奶牛胚胎移植技术的推广应用•山农大图馆网页2010/12/8 [12]李元强•胚胎移植技术的研究进展及前景展望•山农大图书馆网页2010/12/8 [13]赵培鹏•牛胚胎移植技术操作程序•山农大图书馆网页2010/12/8 [14] 蔡京人•奶牛胚胎移植的优点及技术要点•山农大图书馆网页2010/12/8  [15] 马强 •  生物技术概论 •百度网页2010/12/8 [16] 王大刚 •  胚胎移植技术 •百度网页2010/12/8