组织工程骺软骨用于骨骺早闭治疗的实验研究

组织骺软骨用于骨骺早闭治疗的实验研究 创伤骨?科? 组织工程骺软骨用于骨骺早闭 治疗的实验研究 周勇刚 卢世璧 王继芳 张永刚 黄靖香 ( ) 【摘要】 目的 探讨组织工程骺软骨 EGP在治疗骨骺早闭中的作用 。 方法 体外利用聚乳 ( ) 酸 PLA作载体培养出 EGP ,将其植入兔骨骺缺损模型中 ,通过 X 线测量观察下肢短缩和成角畸形的 改变 ,通过原位杂交方法观察再生骺板中 ?型前胶原 mRNA 的达 。 结果 EGP 组在术后 8 周无 ( ) 明显成角和短缩畸形 ,在 16 周时产生轻度畸形 ,但比对照组低 P = 010001; 在 8 周时 ,经过 bFGF 和 ( β) TGF2刺激的 EGP 组的轻度成角畸形要比未经过细胞因子刺激的 EGP 组轻 P < 0105;再生的骺板在 组织学上呈现柱状排列 ,原位杂交显示细胞呈 ?型前胶原阳性反应 。 结论 EGP 可以预防骨骺损 伤后的畸形产生 ; 经 过 细 胞 因 子 刺 激 的 EGP 在 抑 制 畸 形 产 生 方 面 要 优 于 未 经 过 细 胞 因 子 刺 激 的 EGP ; EGP 植入体内后可以产生柱状排列的结构 ,并且细胞可表达 ?型胶原表型 。 【关键词】 组织培养 ; 生物医学工程 ; 生长面 ; 软骨 ,关节 The treatment of premature arrest of gro wth plate with a novel engineered gro wth plate : experimental ZHOU Yonggang , LU S hibi , WANG Jif ang , et al . General Hospital , Chinese People’s Liberation Army , studies Beijing 100853 , China . ( ) 【Abstract】 Objectives To observe the role of the engineered growth plate EGPin the treatment of pre2mature arrest of growth plate and to establish a novel treatment method for the premature arrest of the growth plate . ( ) Methods The engineered growth plates were cultured for the first time by using polylactic acid PLAas cell scaffold seeded with growth plate chondrocytes and they were implanted into the medial proximal defects of growth plates of New Zealand rabbit tibia . The degree of deformity of the tibia was evaluated by X2ray and the expression of collagen ?mRNA of regenerating growth plate was detected by in situ hybridization technique . Results Little deformity appeared in the EGP group 8 weeks after operation. Some deformity was seen in the EGP group 16 weeks ( ) after operation , whereas it′s degree was much less than that of the control groupP = 010001. The degree of the β ( angular deformity of the EGP precultured with bFGF and TGF2group was less than that of the EGP group P < ) 0105. The cells in the regenerating growth plate arranged in column and were stained blue by in situ hybridization technique. Conclusion The EGP can prevent the formation of bony bridge and restore the growth of the dam2 aged growth plate . 【 Key words】 Tissue culture ; Biomedical engineering ; Growth plate ; Cartilage articular (μμ) 254 ?23 m , 平 均 孔 径 为 140166 m , 孔 隙 率 为 骨骺早闭是影响儿童肢体生长发育的一种严 6,其主要治疗方法目前仍然是骨桥切除再开 45126 % , 放入 96 孔板中 ,按 312 ×10/ ml 的浓度将 重疾患 放术 ,但是目前使用的骨桥切除后的填充物多数只 取自 3 周龄幼兔胫骨上端骺板的骺软骨细胞接种到 1 24() 起到阻挡骨桥再形成的作用,即使填充骺软骨和 载体上 双面接种,培养 2 d 后移入 24 孔培养板中 继续培养至 2 周 。在需要细胞因子刺激的培养孔 5 27 软骨细胞效果也不理想。我们就组织工程骺软中 ,第 6 天 和 第 13 天 加 入 终 浓 度 为 30 ng/ ml 的 ( ) 骨 EGP在骨骺早闭的治疗中的作用进行了实验研 βbFGF 和 1 ng/ ml 的 TGF2。 究 ,旨在探索治疗骨骺早闭的新方法 。 2 . 扫描电镜标本及组织切片的制备 : 培养 2 周 的标本用 4 %多聚甲醛固定后 ,进行冰冻切片 , Giem2 材料与方法 sa 染色后光镜观察 。标本用 2 %戊二醛固定 、脱水 、 1 . 组织工程骺软骨的培养 :取直径 415 cm 的聚 真空干燥及喷金后电镜观察 。 ( ) 乳酸 PLA载 体 膜 片 [ 中 科 院 化 学 所 合 成 , 厚 度 为 3 . 分组及实验方法 : 6 周龄新西兰雄性白兔 36 (自制工具制成骺板缺损 [ 缺损占总骺板面积的 3212 1 ; 双侧胫 同时间双侧胫骨长度之差的数值见表 ) ?319% ; 左侧胫骨作为自身对照 ,只剥离软骨膜 角之差的数值见表 2 。 和骨膜 。随机分成 4 组 ,每组 9 只动物 ,分别植入不 两侧胫骨长度之差的两两比较结果显示 ,第 4 () 8 和 16 周时模型组与植入 PLA 组 、植入 EGP 组与 同的材料 : 1骨骺缺损组 :即骨骺缺损模型组 ,不植 () ( ) 入任何材料 ; 2植入 PLA 组 : 单纯植入 PLA ; 3组 入细胞因子刺激的 EGP 组之间无显著差别 ,而植 () 织工程组 :植入组织工程骺软骨 ; 4细胞因子组 :植 EGP 组与植入细胞因子刺激的 EGP 组在每个时入经过细胞因子刺激的组织工程骨骺软骨 。每组动 点均 明 显 地 比 模 型 组 与 植 入 PLA 组 的 差 值 要 小 物在手术后 4 周 、8 周和 16 周分别处死 3 只 ,拍摄 X 单 植 入 PLA 载 体 不 能 减 轻 短 缩 畸 形 , 而 植 线片 ,局部标本固定 。EGP 和植入细胞因子刺激的 EGP 均能抑制短缩 4 . X 线观察测量 : 在不同时间段的 X 线片上测 形的产生 ,尤其是在第 4 、8 周时两侧胫骨长度之 量 ,将同一个动物的左侧胫骨与右侧胫骨长度之差 非常微小 , 到第 16 周时也出现了较明显的短缩 (作为短缩畸形的观察指标 ,将测量右侧胫骨角 胫骨 形 ,但是比模型组还是轻 。 ) 上下关节面垂线的夹角与左侧胫骨角之差作为成 两侧胫骨角之差的两两比较结果与长度之差 角畸形的观察指标 。 结果基本相同 ,第 4 周和第 8 周植入 EGP 组与植 5 . 组织学观察及原位杂交检测 ?型前胶原 mR2细胞因子刺激的 EGP 的成角畸形很不明显 ,但是 NA 的表 达 : 普 通 组 织 切 片 用 蕃 红 花“O”- 亮 绿 染 第 16 周却出现了较明显的成角畸形 ,在第 16 周 色 。原位杂交的切片用地高辛标记标记的 ?型前胶 两组之间无显著的差别 ,但是要比模型组和 PLA 原 cDNA 探针杂交 ,NBT2BCIP 显色 ,光镜下观察 。体组的成角畸形要轻得多 。另外 ,在第 8 周时植 6 . 统计学处理 : X 线测量数据使用 SAS 6104 软 细胞因 子 刺 激 的 EGP 组 的 成 角 畸 形 要 比 植 入 ( 件 ,按照多元方差方法统计分析 。 EGP 组的 成 角 畸 形 轻 统 计 学 上 有 非 常 显 著 的 ) 异,说明经过细胞因子刺激的 EGP 比未经过细 结果 因子刺激的 EGP 更能抑制骺板损伤后的成角畸形 1 . 扫描电镜观察结果 :骨骺软骨细胞表面有很 3 . 组织学观察及 ?型前胶原原位杂交结果 : 多突起 ,状如桑葚 , PLA 表面粗糙不平 ,有很多沟隙 型组和单植入 PLA 载体组在 4 周时 ,骺板缺损处 () 图 1。从冰冻切片中可以看到细胞已经将 PLA 载 骺板有中断 , 并出现了骨化区 , 以后骨化区不断 体包裹起来 ,细胞有较多层数 ,也存在基质 ,细胞与 大 ,形成骨桥 。而植入 EGP 组和植入细胞因子刺 的 EGP 组 ,在第 4 周可以见到再生的骺板 , 再生 载体形成了一体 。 ( ) 图 2。 骺板有典型的骺软骨细胞柱状结构和形态 2 . X 线测量结果 : X 线片上各个实验组术后不 () ()表 1 术后不同时间各实验组 X 线测量双侧胫骨长度之差 cmMEAN ?SD 项 目 4 周 8 周 16 周 F 值 P 值 骨骺缺损组 0 . 33 ?0 . 10 ?0 . 08 ?0 . 10 1 . 08 1. 62 189 . 92 0 . 0001 43 . 87 0 . 0003 PLA 组 工程0 . 35 ?0 . 131 . 13 ?0 . 251. 60 ?0 . 03 组织组 细胞145 . 24 0 . 0001 0 . 03 ?0 . 060 . 17 ?0 . 030. 90 ?0 . 10 因子组 28 . 69 0 . 0008 0 . 00 ?0 . 000 . 13 ?0 . 060. 70 ?0 . 20 15 . 86 52 . 82 43. 66 - - F 值 0 . 0001 0 . 0001 0 . 0001 - - P 值 () ()表 2 术后不同时间各实验组 X 线测量双侧胫骨角之差 ?MEAN ?SD 项 目 4 周 8 周 16 周 F 值 P 值 骨骺缺损组 32. 33 ?2 . 08 ?1 . 80 ?5 . 03 50 . 50 54 . 33 81. 97 0 . 0001 PLA 组 工程32. 50 ?2 . 7850 . 83 ?0 . 7653 . 00 ?1 . 00122. 31 0 . 0001 组织组 103. 43 0 . 0001 0. 33 ?0 . 5811 . 17 ?1 . 2634 . 33 ?4 . 93 77. 51 0 . 0001 细胞因子组0. 67 ?1 . 055 . 17 ?2 . 7528 . 67 ?4 . 16 335. 08 561 . 32 29. 90 - - F 值 P 值0 . 0001 0 . 0001 0 . 0001 - - () 胶 、肌肉等有优越性 。3移植的细胞或组织在被周 8 周时再生的骺板形态变化不太明显 ,略有变 到第 窄 。而到第 16 周时 , 可以见到 再 生 的 骺 板 或 者 变 围组织长入前要经历一个 7,10 d 的无血管区 , 在 窄 、增殖能力降低 ,或者是中间出现了部分骨桥 ,影 这个时期中 ,植入细胞或组织只能单靠组织液渗透 ( ) 响了骺板的生长 图 3。在正常骺板中 , 肥大前期来获得营养 。所以植入细胞早期的死亡可能与组织 液渗入不足和在受植床上失去与周围组织密接有的骺软骨细胞中有 ?型前胶原 mRNA 的表达 ,在再 13 ,在这 种 情 况 下 会 很 快 被 受 体 骨 组 织 侵 入 替 生的骺板上软骨细胞也有 ?型前胶原 mRNA 的表 关 () 达 ,但是比正常细胞稍弱 图 4。 代 ,形成骨桥 。因此从组织渗透角度来考虑 ,植入工 程化骺软骨组织的效果要比骨骺组织移植要好 ,因讨论 为培养的组织基质相对松散 , 易于组织液的渗透 。 () 4经过细胞因子刺激的工程化骺软骨要优于未经 1 . 组织工程骺软骨治疗骨骺早闭的可行性 :90 年代新兴的组织工程学技术 ,在许多领域都取得了 过细胞因子刺激的工程化骺软骨 ,可以在载体上结 8 210 可喜的成绩,但组织工程在骨骺软骨方面的研 合上所需的细胞因子 ,通过缓释不断刺激植入的工 6 5 究未见报道 。本研究参照 Lee 等和 Park 等的方 程组织中的细胞增殖和生长 。 ()本文图 1,4 见插页图第 42 页法 ,制作骨骺缺损的模型 ,通过图像分析系统将骨骺 缺 损 面 积 占 骺 板 面 积 的 比 例 进 行 了 定 量 , 为 参 考 文 献 3212 % ,超过了骨桥切除骺板再开放术可以获得较 1 Williamson RV , Staheli LT. Partial physeal growth arrest treatment by 6 ,11 好效果的 30 %的极限。通过三维立体培养 ,采 bridge resection and fat interposition. J Pediatr Orthop , 1990 , 10 : 7692 776 . 用 PLA 作载体 , 在体外培养出了组织工程骺软骨 。 2 Olin A ,Creasman C , Shapiro F. Free physeal transplantation in the rab2 使用培养出的组织工程骺软骨植入兔胫骨边缘性缺 ( ) bit :an experimental approach to focal lesions. J Bone Joint Surg Am, 1984 ,66 :7220 . 损模型后 ,可以形成典型的骺板细胞柱状结构 ,可以 3 Makela EA. The effect of a penetration biodegradable implant on the epi2 不断增殖 , 表达 ?型前胶原 mRNA 。在 8 周之前可 physeal plate :an experimental study on growing rabbits with special re2 gard to polyglactin 910 . J Pedia Othop ,1987 ,7 :4152420 . 以预防骨桥形成 ,到 16 周也可以减少畸形的产生 , 4 Wirth T ,Byers S ,Byard RW. The implantation of cartilaginous and pe2 此时兔的正常骺板也已经闭合 。 riosteal tissue into growth plate defects. Int Orthop ,1994 ,18 :2202228 . 5 Park J S ,Ahn J I ,Oh DI. Chondrocyte allograft transplantation for damaged 2 . 第 16 周时出现畸形的原因 :本研究植入组织 growth plate reconstruction. Yonsei Med J ,1994 ,35 :3782387 . 工程化骺软骨组在第 16 周出现了较明显的畸形 。 6 Lee EH ,Chen F , Chan J . Treatment of growth arrest by transfer of cul2 tured chondrocytes into physeal defects. J Pediatr Orthop ,1998 ,18 :1552 而在 Lee 的细胞移植治疗骨骺早闭的实验中 ,在 16 160 . 6 周也出现了非常明显的畸形。其原因可能与植入 7 Jouve JL . In vitro culture of growth cartilage and in situ reimplantation. Chirurgie ,1996 ,121 :2732278 . 的细胞生长潜力有关 ,植入生长潜力更大的细胞效 8 Vacanti CA ,Langer R , Schloo B. Synthetic polymers seeded with chon2 果可能会更好一些 ; 另外可能与 PLA 载体的降解后 drocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr 12 Surg , 1991 , 88 :7532759 . 的降解产物堆积和局部 p H 降低有关,因此有必 Puelacher WC , Wisser J ,Vacanti CA. Temporomandibular joint disc re2 9 要改进局部微环境和载体的结构 ; 此外也许还有尚 placement made by tissue - engineered growth of cartilage . J Oral Max2 illofac Surg ,1994 ,52 :117221177 . 未了解的原因 ,这仍然需要我们进一步的探索 。 10 Naumann A ,Rotter N ,Bujia J . Tissue engineering of autologous cartilage 我们认为 ,使用组织工程骺软骨治疗骨骺早闭transplants for rhinology. Am J Rhinol , 1998 , 12 : 59263 . ( ) 有以下几个优点 : 1骨骺软骨细胞可以冷冻保存 , 11 Bright RW. Further canine studies with medical elastomer X722320 after osseous bridge resection for partial physeal plate closure . Trans Orthop , 解冻后不会影响其生长能力 ,所以在建立骨骺软骨 1981 , 6 :1108 . 细胞库后 ,可以克服骨骺移植或使用骨骺软骨填塞 Daniels AU , Taylor MS ,Andriano KP ,et al . Toxicity of absorbable poly2 12 mers proposed for fractrre fixation devices. Proc Orthop Res Soc , 1992 , 骨骺缺损所必须面临的供体问题 ,也不必靠破坏一 88292 . 部分健康组织进行取材来修复另一部分缺损的组 13 Kawabe N , Ehrlich MG , Mankin HJ . Growth plate reconstruction using chondrocyte allograft transplants. J Pediatr Orthop ,1987 ,7 :3812388 . () 织 。2工程骺软骨植入后 ,可以长成具有生长活力 ( ) 收稿日期 :1999209209的骺板 ,不但可以预防骨桥形成 ,还可以获得相应的 ()本文编辑 :杨子明 生长 ,这比植入无生物活性或无生长能力的脂肪 、硅