植物抗寒性鉴定

植物抗寒性鉴定 实验 16 植物抗寒性鉴定 我国植物种类繁多,分布区域广,在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害, 常常给越冬作物和果木造成严重伤害. 冻害由 0?以下低温造成, 冷害由 0?以上低温引起, 冷害对植物的伤害程度,除取决于低温外,还取决于低温维持时间的长短.植物抗寒性的强 弱决定其生长季节,因此蔬菜作物利用抗寒品种,可以将露地栽培提前,提早供应市场;而 选育抗寒性强的果树品种, 不仅是寒带果树育种者的主攻方向, 而且也是温带甚至热带果树 育种者重要育种目标之一. 本实验重点学习实验室间接鉴定果树抗寒性的方法和步骤. 一,试材及用具 1.试材及处理:植物枝条或花朵,将采回的枝条剪成 40cm 左右的长度,用自来水冲 洗数遍(洗掉泥土,灰尘,虫卵) ,再用蒸馏水冲洗三次,然后用吸水纸吸干水分,最后将 枝条末端进行蜡封.将每个品种蜡封后的枝条分成相等的 6 份,其中一份作为对照,其余每 份作为一个低温处理,放于冰箱中(0?,4?)保存备用.每次处理时,各取参试品种的一 份枝条放于超低温冰箱或程控冰箱内进行低温处理,处理温度梯度为:CK(0?) ,-20?, -25?,-30?,-35?,-40?.降温速度为 4?/h,达到目的处理温度后维持 12h,然后逐步 升温,升温速度亦为 4?/h.花朵的处理温度梯度为:CK(0?) ,-1?,-3?,-5?,-6?, -7?,-8?. 2.仪器 烘箱,发芽箱,培养皿,标牌,电导仪,具塞刻度试管(20ml) ,恒温水浴锅, 温度计,玻璃棒,天平,研钵,石英砂,高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光 灯(4000lx) ,容量瓶(250ml,25ml) ,聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳槽,刻度吸管(10ml, 5ml) ,离心管等. 二,内容说明 植物的抗寒性鉴定可分为田间鉴定和实验室间接鉴定两种方法. 1.田间鉴定 田间自然鉴定就是在冻害发生期(早春及晚秋)对受冻的田间植株一定 器官,组织以一定的进行评价,比较,然后根据冻害情况评价抗寒性. 陈学森等(2001)对山东省春季"倒春寒"发生后,受害的核果类果树的花器官的抗寒 性进行了调查,选出了当地花期抗寒性较强的红荷包,红丰等杏品种,证明种间的抗寒力大 小顺序是:桃,杏,李,大樱桃. 赵玉田(1993)对不同生态型玉米的抗寒性进行了田间鉴定,测定的项目包括3个抗冷 指标: 相对出苗率(%) (RER) : RER= 出苗指数(EI) : EI= 第一期出苗率 × 100% 第二期出苗率 ? [(某日出苗数)× (播后天数)] 出苗总数(30d) 幼苗干物重(SDW) ,取地上部三叶期 10 株幼苗,烘至恒重. 三个抗冷特性以总指数值(TIV)示,即占各自等级顺序之和.其值反应了低温下种 子出苗生长和干物质积累能力. 田间鉴定能最直接的反映不同品种在同一条件下的抗寒性差异.该法直接,简单,可进 行大范围,大群体的评价,但受地域,品种数量的限制,只能比较少数几个同一地段的品种 之间的抗寒力差异,不能对他们的抗寒能力进行量化. 2.实验室间接鉴定 实验室间接鉴定,就是根据作物某些生理生化指标及物理指标间 接推断供试材料的抗寒性. 物理指标 Lyons 和 Raison(1970)证明植物低温发生时,生物膜首先发生膜脂的物相变 化,膜的外形和厚度发生变化,膜上产生龟裂,因而膜的透性增大,电解质大量外渗.抗寒 性强的品种细胞膜透性增大程度轻,抗寒性差的品种与之相反.因此,测量电解质外渗量变 化可以比较植物的抗寒性.在黑穗醋栗,梨,猕猴桃(Shaoli Lu,1990)等许多种果树的不 同器官,如花,枝,叶等都有相似结论.另外,通过电导率值配以 Logistic 方程,可以求出 半致死温度,确定植物的临界致死温度. 常用差示温度分析来测量深过冷.以 DTA 法测定,一般植物在零下几度即散热结冰, 称为高温散热.经过低温锻炼的抗寒木本植物,在连续降温过程中,可见到有多次散热,第 一次在零下几度,主要是细胞外结冰,最后一次散热可达-20,-45?的低温以下,叫低温散 热.在低温散热前一霎那的温度,即深过冷温度,用 LTE 温度表示.深过冷低温散热时, 可出现细胞内结冰而使组织死亡.日本京都大学 S.K.Kang(1998)等对苹果,桃,梨,柿 子和葡萄 5 种落叶果树通过温度分析测定了两种散热 HTE 和 LTE,发现柿子与葡萄仅有 LTE,所有树种的低温散热温度与花芽的半致死温度一致. 生理生化指标主要包括超氧物歧化酶(SOD) ,过氧化氢酶(CAT) ,过氧化物酶(POD) 活性测定及同工酶分析,丙二醛(MDA)及可溶性糖含量等方法. 三,方法步骤 (一)质膜透性测定-电导法 近年来的研究表明,在低温伤害尤其冷害中,膜系统常常是最先受到伤害的部位,寒害 + 能使脂膜受损伤,透性加大,细胞内离子(主要是K 离子)外渗量增多,电导率加大.因 此可以用电导仪测定溶液的电导率,求算电解质渗出率(或称伤害率) .伤害率愈高则愈不 抗寒,反之则愈抗寒. 1.电解质渗出率的测定 取处理和对照样品各 0.5g,放入试管中,加 10ml 去离子水,置 25?下 10h.用玻璃棒 搅拌均匀,然后用电导仪测电导值分别为 T1 和 C1.再将试管放入沸水中 10min,待其冷却 至 25?时,测得处理和对照得电导值为 T2 和 C2,按下式计算电解质渗出率和伤害度: 电解质渗出率(%)= 浸泡液电导率值 × 100% 煮沸后电导率值 伤害度(%)= 处理电导率值T1-对照电导率值C1 × 100% 处理煮沸后电导率值T2-对照煮沸后电导率值C2 2.绝对电解质渗出量的测定 有时为了求得电解质的绝对渗出量,需要用分析纯的 KCl 配成不同浓度的标准液(0.01 -10mmol/L) ,在 25?下测定其电导率值,并绘制电导率(μS/cm)―浓度(mg/ml)标准 曲线.由标准曲线查知样品的外渗电导率值相当于 KCl 的浓度,再折算每克材料的绝对外 渗量(mg/g) ,即 绝对电解质渗出量(mg/g) ,即 绝对电解质渗出量(mg/g)=A×B/W 式中,A―根据样品电导率值,从标准曲线中查出的与 KCl 相当浓度(mg/ml) ; B―浸泡液的体积(ml) ; W―样品鲜重(g) . 2.注意事项 (1)在电导测定中一般应用去离子水,若制备困难可用普通蒸馏水代替,但在测定中 设一空白试管,测定样品时要同时测定其空白电导值,按下式计算相对电导度: 相对电导度(L)= S1 空白电导值 S 2-空白电导值 (2)CO2在水中的溶解度较高,在测定电导时要防止高CO2气源和口中呼出的CO2进入 试管,以免影响结果的稳定性. (3)温度对溶液电导影响很大,故S1与S2必须在相同温度下测定. (二)超氧物歧化酶(SOD)测定 超氧物歧化酶(SOD)是一种清除超氧阴离子自由基的酶,普遍存在于植物体内.本实 验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有可氧 化物质存在下, 核黄素可被光还原, 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴 离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲月 ,后者在 560nm 处有最 ? 大吸收.而 SOD 可清除超氧阴离子自由基从而抑制了甲月 的形成.于是光还原反应后,