免疫组化

免疫组化 经水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉满意后，立即用0.9% 盐水及4%多聚甲醛进行灌注，灌注完毕后取出脊髓及大脑，将其置入含4% 多聚甲醛液中后固定24 h(4 ?)，转入30%蔗糖溶液中脱水72,76 h(4 ?)，0.01 mol/L、pH7.3 PBS清洗后，将脊髓和大脑组织分别使用冰冻包埋剂包埋，冰冻切片机行横向脊髓及大脑组织切片，片厚16 μm，贴在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，-20 ?冻存备用。 1 冰冻切片的制作 新鲜组织和化学固定后的冰冻组织都可以进行免疫标记，本科室采取从人体分离30 min以内的新鲜组织立即快速冷冻，避免组织细胞中可溶性物质的分解，并能保存细胞形态的原貌。 1.1 取材及冷冻 离体30 min内的新鲜组织标本用预冷PBS冲洗干净，并用纱布或滤纸吸干面的液体。切成1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm大小，将要切取的平面朝下放到塑料包埋盒底部，在液氮表面停留约30秒把组织冻硬，注意停留太久易使组织冻裂。立即把冻硬的组织块装入自封袋中保存于-80?低温冰箱。 1.2 切 片 切片前将组织样本置于-20?冰箱内复温30 min，切片厚度最好在5,7 μm，太厚贴片不牢固，更不利于镜下观察。包埋可用OCT,也可用胶水代替。用高粘度胶水在支撑架上滴加形成一个小台，将组织放上，在组织周围用胶水包埋一下放在冷台上冷冻。包埋使组织上、下方有一定的边，有利于连续切片，而且展片时可以避免组织皱缩。待组织达适当硬度即可切片，切片时组织的冷冻程度是切片的最关键环节，冻得过硬，切片呈碎屑状;冻得不够，切片呈粥糜状或切不成片。 1.3 贴片、固定 载玻片必须预先处理，常用多聚赖氨酸包被。载玻片的清洗和包被直接影响到免疫组化过程中切片是否脱片。需要注意多聚赖氨酸不可反复使用，且不能用玻璃容器存放。将切片小心贴附于载波片上，贴片时手要稳，并且手要有一个向下伸展的动作，立即将切片放入固定液中。以往的经验用吹风机吹干再固定，但完全干后的组织容易在冲洗时脱片，并且组织细胞发生退行性变;另外，可溶性抗原不能晾干，应立即固定。固定液的选择因抗原而异，但一般抗原可用4?预冷的丙酮固定15 min，此固定剂比较温和，对抗原保存较好。此后可直接用于免疫组化染色或完全干燥后储存于-80?冰箱，最好1周之内使用。 2 免疫组化染色 染色前必须将切片中的固定液及胶水洗净，从低温冰箱中取出的冰冻切片冲洗前还要室温干燥。尽管冰冻切片不需抗原修复，但有些实验室已常规作修复，使显色效果较好。另外，温度对本试验影响较大，为使实验重复性较好，每次实验前使用空调控制室内温度。 2.1 内源性生物素消除 对于SP法这种基于亲和素生物素系统的方法，必须常规内源性生物素消除步骤，否则会出现定位精确的假阳性，而且背景清晰，难以辨别。但大多数实验室都没有消除内源性生物素的操作步骤。本实验室采用鸡蛋清稀释液室温孵育20 min，以封闭所有内源性生物素，经蒸馏水洗，再用5%脱脂奶粉溶液室温孵育15 min，以饱和剩下的生物素结合位点。 2.2 内源性过氧化物酶阻断 冰冻切片应常规此步骤，H2O2甲醇混合物室温10 min效果较好，时间太长可能引起某些抗原的丢失和标记灵敏度的降低。 2.3 抗体高电荷封闭 为防止标记的部分局部化和胶原纤维的假阳性染色，要用一种不相干的抗体预先处理，以减少非特异性结合。常用二抗非免疫动物血清室温孵育10 min或在4?过夜。 2.4 抗体稀释 一抗、二抗可用pH为7.4的PBS直接稀释，但实践证明5%小牛血清或5%牛血清白蛋白稀释效果更好。5%牛血清白蛋白冷冻室中搅拌过夜，pH调至7.4，离心后取上清液，分装，-20?储存。一抗的稀释度要经试验摸索，选择阳性结果明显且背景低的浓度。 2.5 PBS冲洗 PBS的酸碱度对结果至关重要，最佳pH 7.4。坚持单独冲洗，防止交叉反应造成污染。冲洗应温柔，防止脱片。以往PBS洗3次，每次5 min，PBS消耗量大且占用时间多。据实践经验，在一小烧杯内柔和地冲洗切片，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好后于切片上再注入PBS，持续2 min左右就足够了。一抗及复合物孵育后的冲洗特别关键，充分冲洗可减少非特异结合引起的背景染色。 除此以外，一抗孵育最好在4?冰箱过夜(约18 h)，二抗及复合物孵育时间不要太长，否则容易过染，建议室温10 min左右。 冰冻切片比一般石蜡切片制作要求高、难度大，组织冷冻程度难以掌握。而科研实验中冰冻切片、免疫组化比临床病理诊断的要求更高，要做出组织结构分明、染色清晰且背景低的切片，操作的细节就尤为重要，此外还要耐心摸索，积累经验。