巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响

巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响 巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓 单个核细胞凋亡的影响 ? 26? 文章编号:1007—6611(2008)01—0026—03 山西医科大学(JShanxiMedUniv)2008年1月,39(1 巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响 聂芳娜,张伟华,张秀莲,范星火,陈玮,侯素敏,刘晨(山西医科大学第一临床医学院血液 科,太原030001;通讯作者,E—mail:zwhuaa@yahoo.com) 摘要:目的研究巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞(BI~MNC)凋亡的影响.方法RT-PCR方法 检测巨噬细胞株RCAS1基因表达,10例正常小鼠骨髓基质细胞RCAS1基因表达作为正常对照组.流式细胞术检测8例经 巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡,8例经正常小鼠骨髓基质细胞培养上清作用后正常小鼠BMMNC的 凋亡作为正常对照组.对8例巨噬细胞株RCAS1的表达强度与8例经巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋 亡率进行相关分析.结果?巨噬细胞株RCAS1mRNA的表达强度为(1.98?0.24),明显高于正常对照组(0.84?0.21) (P<0.01).?巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡率为(16.66?1.97)%,明显高于正常对照组(2.10? 0.25)%(P<0.01).?巨噬细胞株RCAS1mRNA的表达强度与巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡率呈 正相关(r=0.95,P<0.01).结论巨噬细胞株高表达RCAS1,RCAS1对正常小鼠BMMNC有促凋亡作用. 关键词:凋亡;基因表达;巨噬细胞株,RCAS1 中图分类号:Q255文献标识码:A EffectofRCAS1sec~tedbymacrophagecelllinesontheapoptosisofnormalbonemarrowmononuclearcells NIEFang-na,ZHANGWei—hua,ZHG?u—lian,FANXing—huo,C旺NWei,H[)lSu— min,LIUChen(DeptofHematology, FirstClinicalMedicalCollege,Sha~rriMedicalUniversity,TaiyuanDjo0Oj,China;Correspondingauthor,E-mail:z~huaa @y~hoo.corn) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofRCAS1secretedbyrnacrophagecelllinesontheapoptosisofbonemari~w mononuclearcells(BMMNC)innormalmice.MethodsExpressionofRCAS1mRNAinmacmphagecelllineswasmeasuredby reversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR),and10casesofbonemalTowstromalcellsinnormalmicewerenormal controls.TheapoptosisofnormalBMMNCstimulatedbysupematantofmacrophagecelllineswasmeasuredbyflowc~ometw,and 8easesofnormalBMMNCstimulatedbysupernatantofbonein&rI~wstromalcellsinnormalmicewerenormalcontrols.Thecorrda— tionofexpressionintensityofRCAS1mRNAinmacrophagecelllinesandapoptosisofnormalBMMNCstimulatedbysupernatantof macrophagecelllineswasanalyzed.Results? ExpressionintensityofRCAS1mRNAsecretedbymacrophagecelllines(1.98? 0.24)washigherthanthatofnormalcontrols(0.84?0.21)(P<0.01).? TheapoptosisofnormalBMMNCstimulatedbysuper— natantofmacrophagecelllines(16.66? 1.97)%wasalhigherthanthatofnormalcontrols(2.10?0.25)%(P<0.01).?Ex— pressionintensityofRCAS1mRNAsecretedbymacrophagecelllin~swaspositivelycorrelatedwiththeapoptosisofnorm~BMMNC stimulatedbysupematantofmacrophagecelllines(r=0.95,P<0.01).ConclusionTheresultsindicatethatRCAS1playsa pro-apoptoticroleonBMMNCofnormalmice. Keywords:apoptosis;geneexpression;macrophagecelllines,RCAS1 [].ExpMed,2006,209(3):277—283. [2]AmandaC,SeemD.Advancesinthebiology.diagnosisandhost— pathogeninteractionsofparvovirusB19[J].MedMicrobiol,2004, 53:459—475. 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[收稿日期:2007—10—15] 山西医科大学(JShanxiMedUniv)2008年1月,39(1 Sonada等[1]在1995年建立了一种新的人类子 宫颈鳞癌细胞系SiSO,随后Sonada等_2j的研究又 发现了一类表达于SiSO细胞上的新的肿瘤相关抗 原(receptor—bindingcancerantigenexpressed012 SiSOcells,RCAS1).许多学者发现RCAS1在肿瘤 逃避免疫监视[3j中起重要作用.近年来,国外有 学者发现骨髓巨噬细胞表达R01,且R01对 红系形成集落有促凋亡作用.本实验测定了小鼠 骨髓巨噬细胞株RCAS1基因表达及其对正常小鼠 骨髓单个核细胞凋亡的影响,进一步探讨RCAS1 在骨髓造血中的作用. 1材料和方法 1.1小鼠及小鼠骨髓巨噬细胞株来源近交系 BALB/c小鼠(H一2d,MLSb)40只,8周龄,雌雄不 限,购于山西医科大学寄生虫学教研室.小鼠骨髓 巨噬细胞株Aria一1购于中科院上海细胞研究所. 1.2主要试剂及仪器SK一1250,M—MuLV逆转录 酶均购自立陶宛Fermentas公司.G—actin由上海生 物工程技术服务有限公司合成.AnnexinV—FITC 凋亡检测试剂盒购于Sigma公司,批号:42191.小 鼠淋巴细胞分离液购于天津灏洋生物有限公司. 流式细胞仪(美国B—D公司,Calibur型). 1.3小鼠骨髓巨噬细胞株培养,传代及正常小鼠 骨髓基质细胞培养巨噬细胞株以l×10个细胞/ 每瓶(4m1)置于37?,5%co2饱和湿度下培养. 约1d巨噬细胞全部贴壁生长汇合成单层后,用 0.25%胰蛋白酶消化细胞进行传代,共l0瓶.收 集上清备用,贴壁细胞待测. 取10只正常小鼠骨髓细胞,采用全骨髓培养 法以1×10.个/ml置于37?,5%co2饱和湿度下 培养.培养至14d时细胞贴壁(贴壁细胞即骨髓基 质细胞)并汇合成单层,计数贴壁细胞为l×10个/ 每瓶(4m1),共l0瓶.收集上清备用,贴壁细胞待 测.重复三次. 1.4RT-PCR方法检测RCAS1表达用SK.1250 试剂提取l×10个骨髓基质细胞及巨噬细胞总 RNA,应用紫外分光光度计测定其浓度和纯度. R01上游引物为5,(T(;A1vrA1vrCGTC一 ,I,GTCCCTA一3,下游引物为5一ACA1vrCC— CATTCCCTCCT一3,G—actin上游引物5一CTA— CAATGA0r,TGCGTG,r(GC一3,下游引物为5一 CAGG_1?CAGACGCA(A1;GC一3.PCR体系 50l,含10×PCRBuffer5tA,25mmol/LMgCl24 ? 27? l,10mmol/LdNTP1tA,cDNA模板10l, primerl(25t~mol/L)0.5tA,primer2(25t~mol/L) 0.5tA,Taq酶2l,ddH2027tA.PCR反应条件 为:94?30S,54?30S,72?30S,共35个循环. 取10l扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳,电压 10V/cm,应用紫外照相机记录结果.R01的扩 增长度为104bp,G—actin的扩增长度为270bp. 1.5流式细胞术检测BMMNC的凋亡取20只 正常小鼠骨髓细胞,用淋巴细胞分离液分离出 BMMNC后,加入24孔培养板(每孔含细胞约1× 10个),1rnl/孑L,每孔设3个复孔.分两组:一组加 入巨噬细胞株培养上清(体积比为2:5)作为实验 组,另一组加入正常小鼠骨髓基质细胞培养上清 (体积比为2:5)作为正常对照组,然后置于37?, 5%co2饱和湿度下培养3d.重复三次.将1× 10个BMMNC加入碘化丙锭(PI)及AnnexinV— FITC各5l,室温(20oC)避光孵育15min,再加入 400tA缓冲液1h内应用流式细胞仪检测.采用对 数方式获取荧光信号,通过Cellquest软件获取细胞 并分析. 1.6统计学分析所有资料处理用SPSSl1.5版软 件包进行分析,检测结果以?S表示,经方差齐性 检验后,采用t检验比较两组问差异.相关分析采用 双变量pearson相关分析.P<0.05有统计学差异. 2结果 2.1巨噬细胞株R01mRNA的表达水平用 RT—PCR方法检测巨噬细胞株RlmRNA的表 达水平,l0例正常小鼠骨髓基质细胞作为正常对 照.结果显示:巨噬细胞株均有RCAs1rnRNA的 表达,表达强度为(1.98?0.24);10例正常小鼠骨 髓基质细胞均有RCAS1mRNA的表达,表达强度 为(0.84?0.21),巨噬细胞株组明显高于正常对照 组(P<0.O1).见图1. 2.2巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMM— NC的凋亡用流式细胞术检测巨噬细胞株培养上 清及正常小鼠骨髓基质细胞培养上清作用后正常 小鼠BMMNC的凋亡.结果显示:8例巨噬细胞株 培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡率为 (16.66?1.97)%明显高于8例正常小鼠骨髓基质 细胞培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡率 [(2.10?0.25)%,P<0.O1]. 2.3R1mRNA表达强度与细胞凋亡率的相 关性巨噬细胞株RCAS1mRNA的表达强度与巨 ? 28? BP 1o0 3o0一RCAS1(104bp)3-actin(270bp)山西医科大学(JShanxiMedUniv)2008年1 月,39(1 图1巨噬细胞株组及正常小鼠骨髓基质细胞组RCAS1 mRNA产物电泳结果 Fig1ElectrophoresisresultsofRCAS1mRNAproductsin 2groups 噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋 亡率呈正相关(r=0.95,P<0.01). 3讨论 巨噬细胞由于其活跃的生物学功能,尤其是其 在免疫应答和机体防御中的重要作用,而一直受到 重视,是体内功能最为活跃的细胞之一.巨噬细胞 除具有吞噬,抗原提呈作用外,还有分泌功能.巨 噬细胞可分泌多种活性物质如IL,1,IL-12,TNF—a, 溶酶体酶及补体成分.近年来,Mutsushima等l_6j学 者用免疫组化染色的方法发现RCAS1主要位于骨 髓中巨噬细胞的胞质中.当培养物中RCAS1的含 量增加时,红系形成集落将经受凋亡,包括线粒体 跨膜电位的消失及caspases8和caspases3的激活, 且RCAS1引起的促凋亡效应独立于Fas途径. Suehiro等l_7j学者研究发现,巨噬细胞经脂多糖刺激 后,RCAS1表达明显增加,RCAS1可引起表达 RCASl受体的红系祖细胞凋亡. 不论是存在于肿瘤细胞还是表达在正常组织 细胞上,RCAS1均能够使表达RCAS1受体的免疫 细胞或其他细胞凋亡,而引起病理或生理的改变. 过去多年对于RCAS1的研究主要集中在肿瘤及妊 娠l_80l等方面,对其在血液学方面的研究较少. 为了研究巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小 鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响,以探讨巨噬细胞对 正常骨髓造血的作用,我们检测了巨噬细胞株 RCAS1的含量,结果显示巨噬细胞株RCAS1的含 量明显增加,并发现巨噬细胞株培养上清作用后正 常小鼠骨髓单个核细胞的凋亡率明显增加,且巨噬细胞株RCAS1mRNA的表达强度与巨噬细胞株培 养上清作用后正常小鼠骨髓单个核细胞的凋亡率 二者呈正相关.以上结果表明巨噬细胞株分泌的 RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞有促凋亡作用, 且正常小鼠骨髓单个核细胞的凋亡与巨噬细胞分 泌的RCAS1有明显的剂量依赖关系.提示巨噬细 胞及其分泌的RCAS1对骨髓造血有抑制作用. 参考文献: [1]SonadaK,NakashimaM,SaitoT,a1.Establishmentofanew humanutteringcervicaladenocarcinomacellline,SiS0,andits reactivitytoanticancerreagents[JJ.IntJOncol,1995,6:1099— 1104. [2]SonodaK,NakashimaM,KakuT,eta1.Anoveltumor—associa- tedantigenexpre_ssedinhumanuterineandovariancarcinomas J』Cancer,1996,77:1501—1509. 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