聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及原理a

聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及原理a 笫八部分 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、电泳的原理 电泳(electrophoresis)是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。在生物化学及分子生物学中，主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。电泳现象早在1809年就被发现，但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初，1907年，有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳;1937年，瑞典的Tiselius建立了“移界电泳法”(moving boundary EP),成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即清蛋白、α-、α-、β-和γ-球蛋白。其后的几十年，电泳技12 术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生。以所采用的固体支持物区分，有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳 表1 电泳技术的种类 类 别 名 称 型 式 1( 1( Tiselleas式微量电泳 不用支持体的 2( 2( 显微电泳 电泳技术 3( 3( 等电点聚焦电泳 属自由电泳 4( 4( 等速电泳 5( 5( 密度梯度电泳 1( 1( 纸上电泳 包括常压、高压电泳 2( 2( 醋酸纤维薄膜电泳 (水平式或垂直式) 3( 3( 薄层电泳 4( 4( 非凝胶性支持体区带电泳支持体有:淀水平式或垂直式 用支持体的 粉、纤维素粉、玻璃粉硅胶、合成树脂粉末 (平板法、柱形法及线丝法) 电泳技术 5( 5( 凝胶支持体区带电泳 (1)淀粉胶 (2)聚丙烯酰胺 ?圆盘电泳法 ?平板法 垂直式(柱形法) ?SDS-凝胶电泳法 垂直式或水平式 (3)琼脂糖凝胶电泳 垂直式(测分子量) (4)琼脂凝胶电泳 平板法或柱形法 (如免疫电泳) 1( 1( 双向电泳 2( 2( 电泳—层析相结合 其他用法 3( 3( 交叉电泳纸 4( 4( 连续低电泳 等;以电泳形式区分，有在液体介质中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，有板形或柱形的等(表1)。电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合，又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等，80年代末发展起来的毛细管电泳(capillary electrophoresis) 是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离„„ 这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。 电泳按其分离的原理大致可分为四类:区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)和等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)。现将各种电泳分离原理简单介绍如下: 1(区带电泳 如图1(a)所示，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。 2(移界电泳 如图1(b)所示，它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。各界面可用光学方法显示，这就是Tiselius最早建立的电泳方法。 3(等速电泳 如图1(c)所示，在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。 4. 等电聚焦 如图1(d)所示，由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。 a b c d 图1 不同电泳法的分离原理示意图 a(区带电泳;b(移动界面电泳;c(等速电泳;d(等电聚焦 电泳技术由于具有快速、简便及高分辨率等优点，其应用十分广泛。从分离与无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位;在生化实验室和生化工业方面应用更为普通;医药部门还用作临床诊断。在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。本文主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与技术。 (一)迁移率(泳动度) 1(电泳速度 设溶液中有一带有正电荷Q的颗粒，在强度为E的电场影响下移动，带电颗粒所受的力 1为F,QE。同时此颗粒的移动受到方向相反的摩擦力F,f v的阻碍，f代表摩擦系数，v代表速度。当这两种力相等时，颗粒以速度v向前迁移(图2)。即 QE,f v„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(1) _ v,QE/f„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(2) v H + Q F′=fv F =QE 图2 带电颗粒在电场中迁移的受力情况 摩擦系数f和扩散系数D的关系为 f,KT/D„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(3) 其中K为布氏常数，T为绝对温度，因此可以从颗粒的扩散系数求出。 根据Stoke定律，一球形分子在溶液中泳动所受的阻力 1F,6πrηV„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(4) r为颗粒半径，η为介质粘度，v为泳动速度。 1 (4)式同F, f V式比较可得: f,6πrη„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(5) (5)式代入(2)式得: V,QE/6πrη„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ (6) 由(6)式可知，带电颗粒在电场中的电泳速度v与其所带电荷Q，电场强度E成正比，与颗粒半径r大小，液体粘度系数η成反比。即在同一电场同一介质中的颗粒，如带电荷数不同或颗粒大小不同, 则各自电泳速度不同，因而电泳能使各颗粒分开。 2(迁移率 颗粒在电场中移动的快慢一般不用电泳速度来表示。因为同一颗粒在不同电场中其电泳速度是不同的，由(2)式或(4)式可见速度是电场强度的函数，V , f(E),用v不能反映颗粒本身的特性。因此，颗粒移动快慢通常用迁移率μ或m来表示。泳动度为带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度。即: 2-1-1μ,v/E,(d/t)/(V/l) ,dl/Vt(cm?v?s) „„„„„„„„„„„(7) d为颗粒泳动距离(cm),l为支持物的有效长度(cm),V为加在支持物两端的实际电压(v), t为通电时间(s) (6)式代入(7): μ,Q/6πrη„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(8) 由(8)式可见，迁移率与带电颗的带电荷数，半径、介质粘度有关，而与电场强度无关。所以说，在确定条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。 3(有效迁移率 由迁移率的定义式μ,v/E 可得 v ,μ E„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(9) 即电泳速度与迁移率和电场强度成正比。 由于电解质在溶液中不同程度的电离对离子迁移速度影响较大，因此，在实际电泳过程中，离子在电场力作用下电流速度是由下式的。 v ,αμE„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(10) 式中α是电离度，μ是离子迁移率，αμ称为有效迁移率。显然，带电颗粒的有效迁移率大，其电泳速度也就大。 离子有效迁移率在讨论聚丙烯酰胺凝胶电泳时是一个很有用的物理量。因为在粗孔胶中为了 --保证蛋白质p夹在先行离子Cl和随后离子甘氨酸根G之间使蛋白质样品浓缩、压成薄片就必须对粗孔胶一个缓冲体系，以使得它维持的PH值所造成的离子解离度，刚好满足如下关系，即 α- m - ,α- m - ,α- m - C1C1PPGG 这就是电场强度相同时离子在粗孔胶中实际迁移的顺序。式中的m就是离子迁移率u， -52-1-1之所以变更符号，其原因是它所用的单位常以10cm?V?s为一个m 单位。 当分离成分电泳到细孔胶后，由于要使蛋白质在这一分离胶中分开成区带，而不使甘氨酸根影响蛋白质的分离，因此需要设计另一个PH缓冲体系，使之满足 α- m -,αm, α- m - C1C1G GPP 这时随后离子一跃而起超过各种蛋白质。 (二)影响电泳的外界因素 电泳速度除受颗粒本身的性质如带电性，直径大小等影响外，还受其他外界因素的影响。 1. 1. 电场 (1) (1) 电场强度(电势梯度) 电场强度是指单位长度上的电压降(v/cm)。由(2)式见，电场强度E对泳动速度起着十分重要的作用，电场强度越大，电泳速度越快，单位时间内颗粒迁移的距离就越大，电泳时间就可缩短。根据电场强度的大小可将电泳分为二类:常压电泳(100,500v)与高压电泳(500,1000v),前者电场强度一般为2,10v/cm，后者为20,200v/cm，常压电泳分离时间长，需数小时到数天，多用于分离大分子物质，高压电泳分离时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物质。 在实际工作中有时需要进行快速电泳，如果没有高压电泳设备，人们往往利用上述原理，把常压电泳槽小型化，缩短支持介质的两端距离。例如将原来两端相距20cm 改为5cm，此时外加电压虽仍是200v，但电场强度则从10v/cm变为40v/cm，这就加快了电泳速度。有时为了使样品迁移率放慢，也可调小电压，降低电势梯度。 (2)电极及电极反应 电泳的电极材料大都选用铂金丝，铂金丝的安放位置影响电场强度。如两极间铂金丝位置放得不好，电场强度不均匀，常会使电泳谱带弯曲或同一样品的迁移速率不一样。 通电过程中电极二端会发生电解反应: +-正极(氧化极)HO?2H+1/2O?+2e 22--负极(还原极)2HO+2e?2OH+H? 22 因此在电泳过程中，正负极均可看到气体产生(负极有密集的氢气泡，正极有较大的氧气泡)，电泳过后，两个电泳槽的PH可相差很大(2,4个 PH)。另外电泳过程中会产生热量，尤其是高压电泳，因此高压电泳槽要附有冷却设备，常压电泳可放在冰箱中降温。 2.缓冲液 缓冲液的成分及浓度决定并稳定着支持介质的PH和溶液的离子强度，并影响着带电颗粒的迁移率。 (1) (1) 成分 通常电泳用的缓冲液有:巴比妥(钠);硼酸(钠);磷酸盐;Tris等。要根据电泳类型和对象选用缓冲液成分，例如用纸电泳分离血清蛋白可选用巴比妥-巴比妥钠缓冲液，而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶常可用Tris- 甘氨酸缓冲液„„。缓冲液成分总的要求:不使样品变性，不改变支持物的理化性质，不影响电泳后染色，有利于电泳的进行及样品的分离。 (2)浓度 主要影响溶液的离子强度(μ)。离子强度是离子浓度(C)和离子价数(z )的ii函数μ,f(c、z)稀溶液的离子强度可用下式计算 iiS2μ,1/2ΣCZ 1ii 式中s表示共有s种离子;C为离子的摩尔浓度;z为离子价数。例如0.01mol/L NaSOii24加0.02mol/L NaCl溶液的离子强度应为: 2222 μ,1/2(0.01?1+0.01?2+0.02?1+0.02?1) ,0.045 离子强度越高，颗粒的迁移速度就越慢。在电解质溶液中，带电荷的颗粒能把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围，形成一个离子扩散层。一方面影响颗粒所带的电荷，降低其在电场中的电场力F，从而影响迁移速度(式2);另一方面，当加以电场时，颗粒向与其电 荷相反的电极移动，即带正电荷颗粒移向负极，带负电荷颗粒移向正极，离子扩散层由于携带过剩的与颗粒符号相反的电荷，则向相反方向移动，结果因颗粒与离子扩散层之间的静电引力，使颗粒迁移速度减慢。上述(8)式是由理想的绝缘体系推导的，如果考虑离子强度的影响: 1/2μ,(Q/6πrη)/(1+kμr) 3k为常数，25?,k,0.33?10,μ为离子强度。 缓冲溶液浓度低时，离子强度减少，会影响溶液的导电性，样品分子扩散加重，分辨率下降。因此缓冲液的离子强度应有个适宜的范围，一般控制在0.02,0.2之间。 (3)PH 溶液的PH值决定了带电颗粒解离的程度，决定了物质所带电荷的性质和数量，也决定了样品的迁移方向。以蛋白质为例，当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷成为阳离子;当溶液PH大于等电点时，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子，PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，迁移速度越快，反之越慢。图3表示了不同PH条件下，蛋白质分子带电荷情况及其在电场中运动状态。 PH PH,PI PH,PI PH,PI ++-H -H ++--蛋白分子的电荷 HN-R-COOH HN -R-COO HN-R-COO 332 +++H +H 离子形式 阳离子 两性离子 阴离子 在电场中的迁移方向 向阴极 不迁移 向阳极 图3 蛋白质分子在不同PH条件下所带电荷及其在电场中迁移方向的示意图 因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的PH缓冲液。电泳时，正负电极接线也要随PH变化而变化，例如在碱性条件下，蛋白质带负电荷，正极应接在远离加样品的一方，以使蛋白质在支持物上定向迁移。 3(支持物 多数电泳都有支持物，如纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，然而支持物的结构与性质对带电颗粒的迁移率有很大影响，主要表现为对样品的吸附，产生电渗与分子筛效应。 支持物对样品的吸附，使带电颗粒泳动过程中，摩擦力增加，一方面降低了迁移速度，另一方面导致样品拖尾，故使分辨率下降。 在电场中液体对于团体支持物的相对移动称为电渗。例如在纸电泳中，由于组成纸的纤 +维素带负电荷，因感应相吸而使与纸相接触的水层带正电荷(HO)，使溶液在电场作用下向3 负极移动，并带动物质向负极移动。如果样品原来带正电荷应向负极移动，结果由于电渗使样品移动得更快，反之就会变慢，甚至倒退。用PH 8.6的巴比妥缓冲液进行血清纸电泳，在这PH下蛋白质带负电荷应向正极移动，可是r-球蛋白却移向负极，这就是电渗造成的，因为这时溶液向负极流动，对蛋白质颗粒泳动起阻碍作用，又加上r-球蛋白分子颗粒较大，移动慢，电渗作用大于颗粒的泳动力，结果使颗粒后退。纸和淀粉等支持物电渗作用明显，醋酸纤维和聚丙烯酰胺凝胶电渗较小。 分子筛是凝胶电泳的一个特性，用来作电泳的凝胶通常具有网状结构且具有弹性的半固体物质，具有分子筛作用，使小颗粒易透过，而大颗粒不易通过，凝胶的分子筛效应对分离样品是有利的。 二、聚丙烯酰胺凝胶的合成、结构与性质 1.合成 11聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构的凝胶(图4)。参与反应的催化剂有二种成分。一是引发剂，它提供原始自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应;二是加速剂，它加快引发剂释放自由基速度。表2是常用引发剂与加速剂的搭配。过硫酸铵和核黄素分别引发二种不同类型的反应。 表2 聚合反应催化剂的搭配 引发剂 加速剂 引发反应 (NH)SOTEMED 化学聚合 4223 (NH)SODMAPN 化学聚合 4223 核 黄 素 TEMED 光聚合 1111TEMED，N，N，N，N-tetramethy1ethylenediamine N,N,NN-四甲基乙二胺; DMAPN，3-dimethylaminpropionitrile,3-二甲基氨丙腈 化学聚合:过硫酸铵在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，进而使单体形成自由基，引发聚合反应。聚丙烯酰胺凝胺的分离胶(小孔胶)，就是通过这种化学聚合而合成的。 光聚合:核黄素在光下形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。但过量的氧会阻止链长的增加。此法比上法制得凝胶的胶孔大，因此常作电泳中的浓缩胶。 以上的聚合反应，受许多因素的影响。 (1)大气氧能淬灭自由基，终止聚合反应，所以反应液应当与空气隔绝。 (2)有些材料，如有机玻璃能抑制聚合反应，在有机玻璃容器中，反应液和容器表面接触的一层，不能形成凝胶。 (3)某些化学物质可以减慢反应速度，如铁氰化钾。 (4)温度影响聚合反应，温度高，反应快;温度低，反应慢。 因此在设计电泳器和制备凝胶时，要注意这些因素的影响。 图4 丙烯酰胺，N’,N’-甲叉双丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的化学结构式 2(凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 为了使样品分离得快，操作方便，便于记录结果和保存样本，要求凝胶有一定的物理性质，合适的筛孔，一定的机械强度，良好的透明度。这些性质很大程度上是由凝胶浓度和交联度所决定的。 100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数称为凝胶浓度，记号为T。 T(%),,Acr(g)+Bis(g),/V(ml)?100% 凝胶溶液中，交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度，记号为C。 C(%),Bis/(Acr+Bis)?100% 凝胶浓度能够在3%,30%中变化，浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎;浓度太小，凝胶稀软，不易操作。凝胶浓度主要影响筛孔的大小。实验表明，筛孔的平均直径和凝胶浓度的平方根成反比。 1/2P,kd/T P.网孔的平均直径;T.多聚体浓度;d.多聚体分子直径(5A);K.常数，假如多聚体链结构近似直角交联的，则K为1.5 例如: 1/2 T,5%时 P,1.5?5A/5%?33.5A 1/2 T,7%时 P,1.5?5A/7%?28.3A 交联度C反映凝胶结构中甲撑桥的密度。交联过高，凝胶是不透明的，并且缺乏弹性;交联过低，呈糜糊状。交联度可以决定筛孔的最大直径。 在实验中观察到，要获得透明而有合适机械强度的凝胶，单体用量高时，交联量应减少，单体用量低时，交联剂量应增大。下式是一个要求良好的电泳用凝胶的经验公式。 在100ml溶液中: Acr(g)?Bis(g)?常数(约1.3) 凝胶浓度与被分离物的分子量大小关系。大致可用表3表示。 表3 分子量范围与凝胶浓度的关系 分 子 量 范 围 适用的凝胶浓度(%) 4蛋白质:<10 20–30 4 1,4?10,20 15 45 4?10,1?10 10,15 51,5?10 5,15 575?10 2,5 4核 酸:<10 ,20 15 4510,10 5,10 5610,2?10 2,2.6 最常用的凝胶，T,7%,7.5%，C,2%,3%，Davis标准凝胶的组成是，T,7.2%，C,2.6%。用此浓度的凝胶分离生物体内的蛋白质能得到较好的结果。当分析一个未知样品时，常常可先用7.2%的标准凝胶或用4%,10%的凝胶梯度来试测，而后选用适宜的胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。在3%凝胶中加入20%蔗糖，也可增加机械强度而又不影响孔径大小。 3.聚丙烯酰胺凝胶的性能 制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如下优点: (1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制和调节。并且制备重复性好。 (2)聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构，没有或很少带有极性基因，因而吸附少，电荷作用小，不易和样品相互作用，化学性质比较稳定。 (3)凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果。且需要样量较少。 (4)用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。 由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定。 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的机理 聚丙烯酰胺胶电泳体系有二种:连续体系与不连续体系。前者指整个电泳体系中所用的缓冲液成分、PH、凝胶网都相同;后者指在电泳体系中采用两种以上的缓冲液、PH值和孔径。按电泳装置不同又可分为垂直管状(圆盘)电泳和垂直平板电泳。这两种电泳操作方式基本相同，不同的只是用于凝胶的支架或为玻璃管，或为玻璃板。这里以最常用的不连续体系的管型盘状电泳为例，说明凝胶分离蛋白质的机理。 图5 盘状电泳3种胶的组成(Davis标准状态) (一) (一) 盘状电泳凝胶组成 胶组成 缓冲液 T(%) C(%) 阳离子 阴离子 PH +-电极缓冲液 Tris Cly 8.3 + -样品胶 3.1 20 TrisCl 6.7 + -浓缩胶 3.1 20 TrisCl 6.7 +-分离胶 7.2 2.6 Tris Cl 8.9 电极缓冲液 图5为聚丙烯酰胺电泳组成示意图。电泳槽与凝胶中缓冲液的成分、PH值和离子强度均不相同。使得盘状电泳过程中有三种物理效应:?样品的浓缩效应;?凝胶的分子筛效应;?一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。 (二)样品分离的机理 1.样品的浓缩效应: 由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。 (1)凝胶层的不连续性:三层不同的凝胶其作用如下: a.样品胶(sample gel):为大孔胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中，起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中，(目前电泳一般不制作此胶)。 b.浓缩胶(stacking gel):为大孔胶，用光聚合法制备，有防止对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。 c.分离胶(seperatoing gel):为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离，也有防对流作用，蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到阻力大，速度就减慢了，由于凝胶的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。 (2)缓冲离子成分的不连续性 在电场中如有二种电荷符号相同的离子向同一方向泳动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子，又称前导离子(leading ion)，走在后面的离子称慢离子，又称尾随离子(trailing ion)。为了使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系 统中加入有效迁移率大小不同的两种离子，并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相，即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。 为了保持溶液的电中性及一定的PH值，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称为缓冲配对离子(buffer counter ion)，使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中(即三 -层凝胶及电极缓冲液中)。例如，分离蛋白质样品时，通常用氯根(Cl)为快离子，甘氨酸根 -+负离子(NHCHCOO)为慢离子，三羟甲基氨基甲烷(Tris)作为缓冲配对离子。 22 图6 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理示意图 (a)电泳开始时;(b)样品进入浓缩胶被浓缩成一薄层;(c)样品进入分离胶被分离。 电泳开始前(图6A) 慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。 电泳进行中(图 6B) 快离子与慢离子的界面向下移动。 由于选择适当的PH值缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率介于快、慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率，按下列次序排列，mα, m α, m α。clclppGG样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处堆积浓缩成极窄的区带。 样品分离(图6C) 当样品达到浓凝胶与分离界面处，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带。 (3)电位梯度的不连续性 电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积，迁移率低的离子，在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度。 v,mαE 要v一样 mα低的，E要高 iii 在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。 电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。电导与电位梯度是成反比的。 V,IR,I ?L,1/R ?E,V/l,I/Ll V.电压;I.电流;R.电阻;L.电导;E.电位梯度V/l 因在串联电路中，电流处处相等，因此，I,ELl， 在低电导区就有较高的电位梯度。 电极缓冲液样快离子 品胶 高电位梯度 慢离子 浓缩胶 低电位梯度 分离胶 蛋白质 图7 不连续系统浓缩效应示意图 这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质有效迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时，(mαE),(mαE),(mαE),v，则三种离子快p慢移动速度相同，在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳板移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面(图7)，由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。 (4)PH的不连续性 在浓缩胶与分离胶之间有PH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。 (1)浓缩胶应有的PH值 在PH8.0以上时，血清中的蛋白质迁移率在-0.6,-7.5迁移率单位之间，要求甘氨酸的有效迁移率小于-0.6单位。设为-0.5单位，即m α,-0.5，已知 m ,-15 GGG α , -0.5/-15 , 1/30 G 又 PH,PK+1ga/(1-a) a 已知，甘氨酸PK,9.8 与α值一起代入上式，计算出PH为8.3， a (2)分离胶应有的PH值 在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率(m α)超过所有蛋白质的有效迁移率，这样甘氨酸GG 的泳动速度即超过所有的蛋白质，使分离胶保持均一的PH及电位梯度，以使蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离。 血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中迁移率小于-5.0单位，则m α至少应为-5.0，即αGG ,1/3 (?m,-15 α,-5/-15 , 1/3 )，按 PH,PK+1g a/(1-a) 计算, PH应为9.5。 Ga 实际上Davis所用的配方中，分离胶的PH值为8.9，但在电泳分离时，根据实际测定证明与理论计算相符，实际上比原制备时的PH约高出半个PH单位，所以与要求的数值是符合的。 2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应，即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。 此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面与凝胶层析的分子筛效应相反。 3.电荷效应 蛋白质混合物在胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动得快，反之则慢，因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶时，此种电荷效应仍起主要作用。 综上所述，样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的，电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中进行的。在蛋白质样品进入分离胶时，由于在浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面去，高电势梯度消失，使蛋白质进入到均一电势梯度和PH的分离胶中。此时，又由于分离胶的孔径小，各蛋白质因分子大小和形状不一样而被这孔径阻滞的程度也不相同，使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛效应不同而得到分离。 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法 (一)管型盘状电泳 1.仪器和设备 图8 管型盘状电泳槽结构 A为正面 B为剖面 (1)分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7 (3)电极缓冲液PH8.3 图9 在玻璃管中装有3层不同的凝胶示意图 电泳槽:盘状电泳槽国内有很多 单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。 电泳仪:国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-?型，电压在0,600v内任意调节，电流输出0,100mA，这类电泳仪比较恰当。 玻璃管:选择粗细均一的圆玻璃管，内径5,7mm左右，管长70,100mm。管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。 聚胶架:普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。 微量注射器或微量进样器:加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样，也可用50或100μl加液器代用。 普通注射器:主要用于灌胶和剥胶，20,30ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。 其他:日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。 2.试剂 甲叉双丙烯酰胺(Bis);丙烯酰胺(Acr);四甲基乙二胺(TEMED);过硫酸铵;核黄素(V);三羟甲基氨基甲烷(Tris);蔗糖;甘氨酸;盐酸等。 B2 丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。 (1)丙烯酰胺纯化法:70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50?)，热滤，滤液凉后置-20?冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。 (2)甲叉双丙烯酰胺纯化法:12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 40,50?丙酮，加热过滤，滤液置-20?冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。 3.试剂配制 (1)凝胶及缓冲液配制系统 有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。列表4供参考。最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。用时需测PH值，以检查是否失效。TEMED要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。 表4 几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统 系统? 系统? 系统? 系统? (PH值8.9)(7.2%) (PH值7.5)(7.5%) (PH值4.3)(15%) (PH值2.9)(7.5%) 溶P溶溶P溶组份组份P组份组份P液H 液液H液/100 ml /100ml H值 /100ml /100ml H值 号 值 号 号 值 号 1mol/l 1mo;/L 1mol/L 1mol/l HCl HCl KOH KOH 48.0ml 48.0ml 48.0ml 12.0ml Tris 81Tris 6.8571422醋酸17.2 醋1 .9 5 .5 7 mlTEMED .3 0 .9 36.3克 克 酸.25ml TEMETEMED 4.0ml TEME D 0.46ml D 0.46ml 1.15ml 丙烯酰丙烯酰胺 丙烯酰胺 胺 30.0克 60.0克 过硫228 2 6 8 28.0克 双丙烯酰双丙烯酰酸铵 a 1 双丙烯胺0.8克 胺0.4克 2.8克 酰胺0.735克 1N 1N 过硫酸过硫酸铵 HPO KOH 铵 0.28克 34 139.0ml 51250.14克 48.0升 3 6 Tris 4.95.5 8 2 .9 醋酸 2.95ml 克TEMED 0.46ml 1N 1N HCl KOH 448ml 6148.0ml 6 a Tris .7 9 .7 醋酸 2.87ml 5.98克 TEMETEMED D 0.46ml 0.46ml 丙烯酰 胺 65 10.0克 .7 双丙烯 酰胺2.5克 核黄素 6 4.0mg 蔗糖 7 40.0克 电极缓冲液: 电极缓冲液: 电极缓冲液: 电极缓冲液: Tris 6.0克 二乙基巴比妥 β-丙氨酸 32.2甘氨酸 28.1 甘氨酸 28.85.82克 克 克 8744克 Tris 1.0克 醋酸 8.0克 醋酸 3.06ml .3 .0 .5 .0 加水至 1升 加水至 1升 加水至1升 加水至1升 使用:10%稀使用:10%稀释液 使用:10%稀释液 释液 电极:上槽接负极Θ 电极:上槽接负极Θ 电极:上槽接正极? 电极:上槽接正极? 下槽接正极? 下槽接正极? 下槽接负极Θ 下槽接负极Θ 各溶液混合比 各溶液混合比 各溶液混合比 各溶液混合比 浓缩分离浓缩胶 分离胶 浓缩胶 分离胶 浓缩胶 分胶 胶 离胶 1份4a1份11份161份15号 1份191份17号 1份22号 4份20号 号 号2份5号 2份2号 号 2份82份5号 号 2份52份2a号 1份6号 1份水 2份5号 号 1份6号 2份号 1份水 4份7号 4份3号 1份6号 1份水 4份7号 2号 1份64份34份7号 4份18号 2份号 号 21号 4份7 号 (2)指示剂配制 蛋白质样品通常是无色的，为了观察和估计样品在凝胶上迁移情况，常加指示剂作为电泳迁移的可见标志。对碱性缓冲系统，一般用溴酚蓝或酚红，对于酸性缓冲系统，一般用甲基绿或次甲基兰。指示剂可直接加在样品中，也可加在电泳槽的缓冲液中，也可加在玻管中。 溴酚蓝通常配制成0.1%的母液备用。 (3)染色剂配制 蛋白质的染色方法很多，常用的染色剂有氨基黑10B，考马斯亮蓝R250，考马斯亮蓝G250等，有关配制浓度，染色方法以及同工酶的显色方法见操作过程中的染色部分。 操作技术 4. (1)凝胶制备 配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很多:在凝胶架的孔洞内，加少许40% 蔗糖溶液，然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、乳胶管与孔底相平;玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口;底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上;也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用1%琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝胶封住。 配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至室温下预温。 聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因为?有些样品会抑制胶聚合;?光照可引起某些蛋白质变性;?多了一道手续，延长制胶时间。 分离胶的制备:按表4比例混合贮存液，(先不与过硫酸铵混合)，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好标记，注胶到相同的高度。务必勿使气泡出现。为了使凝胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约3,5mm高度，消除凝胶的弯月面。加水要小心，切勿冲乱界面。加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。 水层放好后，静置30分钟，使凝胶进行化学聚合反应。聚合最适温度为25?。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置20,30分钟，聚合便完全。 分离胶的预电泳(此步骤应根据实验的需要决定取舍):凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品(如酶)会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳更为重要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。步骤:去除玻管封口，倒出玻管中凝胶上的水分，并用分离胶缓冲液洗涤一下。把玻管插入电泳装置中。上下电极槽中均加入分离胶缓冲液，预电泳的电流为3mA/管，时间需30分钟,2小时。预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。 浓缩胶的制备:分离胶聚合好后，或已经过预电泳的分离胶，用注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余的水。按表4中比例混合浓缩胶液(也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，使用时再混匀)，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液1cm左右，各管加的高度应一致，并在上面加水层压平胶面。放在两只20W以上功率的日光灯下，约离灯管10,15cm处，光下聚合60分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。浓缩胶应临用前制备。 (2)样品的准备 聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。 盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管按体积，需要5,100μl的样品(约0.1,2mm高);按含量需要5,100μg。实际上就是用0.1%浓度的样品5,100μl。由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品，通常用10,20μg，对于含有多种组分的样品，可用到200μg。即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于?5%。 近来，样品胶一般已改用样品液中加入5%,20%的蔗糖或10%甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。 如果样品离子强度太高，会引起分界面模糊不清，严重时完全不能进行电泳。因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位，同时电导过高，在样品部分几乎没有电势梯度，以至样品的泳动速度近于零，不能泳动。硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分，必须透析除盐，务必使其电导低于分离胶的电导，以便形成足够的电势梯度，使区带在分离之前进行浓缩变窄。 如果样品过稀，加样体积太大时，相应地加厚浓缩胶层。玻璃管也要适当加长。通常稀样液与浓缩胶的比不大于1?1.2。 一个生物样品(粗抽提物)，常需要事先经过处理(高速离心，微孔滤膜过滤，柱分离等)去除沉淀，消除混浊。或只取可溶性部分进行电泳。不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上，阻塞凝胶，干扰分离。当样品装载量与样品溶解度不相应时，也会在浓缩胶上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀，并造成拖尾现象(随着电泳过程，沉淀逐渐溶解，逐渐进入)。 加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。然后加样。 加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样;有的指示剂单独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然后在样液上加电极槽缓冲液;有的先在上槽中加满电极缓冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓冲液互不干扰。 (3)电泳 在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。缓冲系统为酸性时则相反。Davis标准状态的凝胶电泳，负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度在0,4?。打开电源开关，调节电流，开始时用1,2mA/管，电泳3,5分钟后，再逐渐升高到4mA/管。不要一开始就电流很高。电流最好不要超过5mA/管。太高的电流强度会造成产热量大，使分离失败。如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程中，一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的3/4距离时，就可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。 上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下PH，如PH值发生改变就不能再使用。每次电泳后，下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电泳。重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。 (4)剥胶 为了防止电泳后凝胶中蛋白(酶)盘状区带扩散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染色，一般用20,30ml的注射器配上10cm长的针头，左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一边压水，一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，针头抽出，胶就自动滑出。如果不出，就从另一端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓度较高，取出困难，可用10%甘油水溶液代替水注入。一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。剥胶时应注意不要损伤胶柱表面。 (5)固定与染色 为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的效果。也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶，为了让酶带上进行某种显色反应，往往是先显色后固定。 三氯醋酸固定蛋白质的机制可能是这样:其分子不仅与蛋白质带正电荷侧链结合，而且通过氢键与蛋白质的肽链结合，其结果使蛋白质分子失去水分子，同时在肽链表面包上一层疏水的CCl基团，使蛋白质水溶性破坏，从水相沉淀在凝胶相上。乙酸固定蛋白质的机3 制可能同三氯乙酸一样。 电泳后蛋白质区带的检测，对于不同的目的，应采用不同的检测方法，最常用的方法是用染料和生物大分子结合形成有色的复合物，选用染料通常应考虑以下要求:A)必须与大分子结合以形成一个不溶性的，有色的，紧密的复合物，但不结合到凝胶中和支持膜上，以便从凝胶中除去，否则背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描;B)染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中，以利于背景的脱色;C)选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度;D)选用能与大分子有专一性结合的染料，并在结合后能产生不同的颜色，可以提高检测的选择性。 用于蛋白质区带染色的试剂常用的有氨基黑10B、考马斯亮蓝，1-苯胺基-8-萘磺酸等，其性能及染色原理如下: ?氨基黑10B (amino black 10B) CHONSNa MW,715 λ,620,630nm 氨221312633max基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。另外氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等，色调不一(有蓝、黑、棕等)，作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量(吸收值)的标准曲线。 ?考马斯亮兰R250(Coomassie brilliant blne R250) 即三苯基甲烷(triphenylmethane) CHOHSNa MW,824 λ,560,590nm 染色的灵敏度比氨基黑4644732max 高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分析时要注意这点。 ?考马斯亮兰G250(Coomassie brilliant blne G250)，即二甲花青亮蓝(Xylene Cyanine brilliant Blue)，MW,854，λ,590,610nm，染色灵敏度不如R250，但比氨基max 黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。 氨基黑与考马斯亮兰两种染料的共同点是:都带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。但是，氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。而考马斯亮兰却相反，含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑。因此，用考马斯亮兰染色的漂洗要容易得多。另外，考马斯亮兰的灵敏度要比氨基黑高。 4.1-苯胺基-8-萘磺酸(1-animo-naphthal sulfonic acid简称ANS)，MW,241，本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，凝胶在此染料溶液浸1,3分钟，用长波紫外灯照射时产生黄色荧光，可显示蛋白质100mg，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol/L盐酸中几秒至2分钟，使表面蛋白质稍变性,然后再用 表5 蛋白质的常染色法 方 法 固 定 液 染 料 染色时间 脱 色 氨基黑 甲 醇 0.1N氢氧化钠中1%氨基黑 5分钟(室温) 5%乙醇 10B 7%乙酸 7%乙酸中0.5%,1%氨基黑 2小时(室温) 7%乙酸 10分钟(96?) 考马斯亮兰 20%磺基水杨酸 0.25%R250水溶液 5分钟(室温) 7%乙酸 R250 10%三氯乙酸 10%三氯乙酸-1%R250 0.5小时(室温) 10%三氯乙酸 样品中含尿素的在5%19?1(V/V) 1小时(室温) 90%甲酸 三氯乙酸中固定 5%磺基水杨酸和1%R250 19?1 考马斯亮兰 6%乙酸 6%乙酸中1% G250 10分钟(室温) 甲醇-水-浓氨 G250 12.5%三氯乙酸 12.5%三氯乙酸中0.1% G250 30分钟(室温) 64?36?1 1-苯胺基-8-2mol/L盐酸浸几秒种 PH6.8，0.1mol/L磷酸盐缓冲液3分钟 萘磺酸 中0.003%染料 Ponceau 3R 12.5%三氯乙酸 0.1mol/L NaOH中1%3R 2分钟(室温) 5%乙醇 固绿 7%乙酸 7%乙酸中1%固绿 2小时(5?) 7%乙酸 ANS染色，这样可显示蛋白质20μg。这种染色优点是可保留凝胶内中的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定，也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。 常用染色方法见表5。 (6)脱色 凝胶柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后放在脱色液中浸洗，常用的脱色液有7%乙酸，甲醇-水-乙酸溶液等。经常更换新溶液，直到染料洗出，背景几乎无色为止。用氨基黑染色的，脱色时间较长，而考马斯亮蓝染料易于脱色。为了短时间得出结果，可采用电泳脱色。即在一玻璃或有机玻璃槽中盛7%的乙酸溶液，已染色的胶放置在槽中间，两边加铂金电极，并通直流电，电压30,40V，电流0.5A左右，1,2小时即可脱色完毕。 (7)结果的记录 记录电泳结果常用的方法有 ?绘制示意图，将各个样品的酶带如实地描绘下来，根据酶带宽窄，颜色深浅，拟分七级表示之(图10)。 一级宽带 酶带色深而宽 二级宽带 酶带色浅而宽 三级宽带 酶带色极浅而宽 一级窄带 酶带色深而窄 二级窄带 酶带色浅而窄 三级窄带 酶带色极浅而窄 扩散带 酶带扩散 图10 酶带的分级标准 ?测量相对迁移率(Rf):分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示剂移动的位置(前沿)作一标记(通常是插一根短铜丝)，染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。 Rf, 酶带迁移距离/前沿指示剂迁移距离 测量迁移率时，应以酶带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好，这些因 子都应尽可能保持恒定。 ?照相:采用透射照相方法，用照相机把酶带真实地拍摄下来，盘状电泳的凝胶柱一般放在试管中(注满脱色液或保存液)拍摄。对于绿色、蓝色和暗蓝色的染色区带，照相时可加黄滤色镜，能增加清晰度。 ?光密度计扫描定量:把酶带放在光密度扫描仪上，描绘酶谱——光密度曲线。配合计算机，可作定量分析。 (二)垂直平板电泳 垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳和管型盘状凝胶电泳相比，具有以下优点:?一系列样品可以在相同的制板、电泳、显色条件下进行比较，减少试验误差;?在一块平板上点样数目可根据需要任意变动，可多可少;?凝胶可制成干板，作为科研资料长期保存;?电泳后取胶、显色、摄影等都较方便，并能得到较好的效果。 由于具有上述优点，故近年来垂直平板凝胶电泳技术发展较快，现将方法介绍如下: 垂直平板凝胶电泳所用的电泳仪，配制分离胶、浓缩胶的试剂，以及固定染色、脱色用的药品可与盘状凝胶电泳通用，所不同的主要在电泳槽结构上，以及随之带来的操作方法上。 1.器材 夹心式垂直板电泳槽，凝胶模(135?100?1.5mm)(北京六一仪器厂)，直流稳压电源(电压300,600V，电流50,100mA)，吸量管(1，5，10mL)，烧杯(25，50，100mL),细长头的滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器(10μL或50μL)，水泵或油泵，真空干燥器，培养皿(直径120mm)，玻璃板(13?13cm)，玻璃纸2张(18?18cm)，日光灯一台。 2.操作方法 图11 夹心垂直平板电泳槽示意图 图12 凝胶模示意图 3.操作技术 (1)安装夹心式垂直板电泳槽 夹心式垂直板电泳槽(图11)两侧为有机玻璃制成的电极槽，两电极槽中间有一凝胶模(图12)，该模由ㄩ形硅胶框，长、短玻璃板，梳组成， 电泳槽由上贮槽(白金电极面对短玻璃板)，下贮槽(白金电极面对长玻璃板)和回纹冷凝管组成，两电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定，其组装顺序为: ?装贮槽和固定螺丝销钉; ?将洗净的长、短玻璃板分别插到ㄩ形硅橡胶框的凹形槽中，注意不要用手接触灌胶面的玻璃; ?将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中，短玻璃板应面对上贮槽，长玻璃板应面对下贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽; ?竖直电泳槽，用滴管吸取少量的1%琼脂糖溶液，灌入凝胶模板底部(长玻璃板外侧，下沿凹形小槽内)，液面高度约0.5,1.0cm,待琼脂糖凝固后,即堵住凝胶模下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。 (2)制备凝胶板 ?分离胶制备:配制分离胶溶液(见表4)，将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)，用注射器在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，并使胶面平整。为防止渗漏，在上下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30,60分钟凝胶完全聚合后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。 ?浓缩胶制备:配制浓缩胶溶液(见表4)，用滴管将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，用日光灯照射进行光聚合，约30分钟后，凝胶由淡黄透明变成乳白色，聚合完全后，轻轻取出样品模板梳，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm。 (3)加样 用微量注射器取样品溶液5,10μl，小心地加入到凝胶凹形样品槽底部，因样品比重大于电极缓冲液，因此样品液自动沉降在胶面上平铺成一层。 (4)电泳 加样毕，在上槽加入0.1%溴酚蓝数滴，不要移动电泳槽(防引起样品漂流)，接通电源，先低压电泳一般时间，待指示剂在胶板上成一条直线时，即可将电泳槽移入冰箱，按所需电流电压进行电泳。温度控制在0,4?。由于电流和电压同电极缓冲液的离子强度有关，因此根据电极缓冲液分高离子强度和低离子强度两种。高离子强度电极缓冲液配方:141.1g甘氨酸加30g Tris加水1000ml，用时稀释20倍调PH值至8.3;低离子强度电极缓冲液配方:2g甘氨酸加5.2g Tris加水至1000ml，用时衡释10倍，调PH值至8.7。 当电极缓冲液离子强度确定后，又有稳定电流和稳定电压两种电泳方式。用高离子强度电泳液，稳定电流2.0,2.5mA/cm，电泳16小时左右;用低离子强度电泳液，稳定电流0.2,0.3mA/cm，电泳16小时左右，此为稳定电流的方法。稳定电压电泳方式通常是这样:用高离子强度时，稳定电压10V/cm，电泳14,15小时;用低离子强度时，稳定电压20V/cm，约4,5小时。若指示剂移动到离下层电泳液水平面1cm处，即可关闭电源，停止电泳。 (5)卸板 电泳完毕，从冰箱中取出电泳槽，吸出电极缓冲液，将胶板从电泳槽上卸下，平放在实验台上，用压舌板在两块玻璃板的一角轻轻一撬，揭去上面长型玻璃板。用刀片在胶板一端切除一角作为标记，而后用磨平针尖的兽医用针头吸取无离子水把凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，即可染色与固定。 (6)固定、染色和脱色 与垂直管型盘状电泳所用的方法相同。 (7)结果和记录 除按管型盘状电泳法记录实验结果外，还可以制成干板保存。在水中用两张比胶板稍大的玻璃纸，将胶板夹在中间，平放在玻璃板上，排除气泡，四周用玻璃条压住并用夹子固定在玻璃板上，30?烘干或自然风干。包前如将胶板放在10%的甘油中浸泡片刻，则效果会更好。 五、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术 等电聚焦(isoelectric focusing)，缩写为IEF或EF，也称等电分离、等电点划分，等电点分析、聚焦电泳等，是六十年代后期才发展起来的新技术，它不仅用来分离、鉴定和测定蛋白质等电点，分离复合蛋白，同时还可以结合SDS电泳，密度梯度和一般凝胶电泳进行双向电泳来分析蛋白质的亚基，分子大小和各种蛋白质成分的图谱，因此，它已成为电泳中不可缺少的技术。 (一)原理 等电点聚焦就是在电泳槽中放入两性电解质载体，通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的PH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同蛋白质即移动到或聚焦于与其相当的等电点PH位置上。其原理可用图13表示。 图13 等电聚焦原理 电泳槽中放入两性电解质载体和蛋白质样品1、2、3其等电点分别为PI、PI、PI。两性电解质在阳极的两性介质中会得到质子而带123 正电，在阴极碱性介质中则失去质子而带负电，这样就会受电场力的作用各自向相反方向移动。如果有很多的两性电解质，它们就会按照等电点由低到高的顺序在电泳槽中依次排列。于是形成一个由阴极到阳极连续增加的PH梯度。蛋白质也是一种两性分子，在电场中按其表面所带电荷进行移动。A开始带正电，它就向负极高PH区域移动，分子的负电荷逐步增加，即通过羧基和氨基的去极化，最后达到净电荷为零。反之，C种蛋白质分子表面电荷是带负电荷，它就向PH低的区域移动，当分子净电荷达到零时也停止运动。这样根据蛋白质所带电荷不同就可以进行分离。净电荷为零的区域就是该蛋白质的等电点(PI)。因此，根据PH梯度和泳动的距离就可以测出蛋白质的等电点。 目前常用的载体两性电解质商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmacia)、Serralyte(Serva)以及国产的Ampholine(上海生化所东风厂生产)。Ampholine(图14)是具有多等电点的多氨基多羧基酸类化合物，其主要理化性质为:?缓冲性能强 Ampholine溶液在一定PH范围内有充分的缓冲能力，当蛋白质进入与其等电点相应的PH区域时，PH值并无变化;?导电性能好 Ampholine溶液有均衡的电场强度，但是在PH等于中性的区域导电性能较差。因此在应用时，不管选择什么PH范围，一般都要加入其总量1/10的PH6,8的Ampholine溶液，以保持电场强度的均匀性;?分子量小 Ampholine一般分子量都在300,1000之间。一便用分子筛或透析等方法将它与被分离的高分子物质分开;?紫外吸收值低 Ampholine对于在280nm处测定蛋白质吸收值的干扰小，但是如果蛋白质浓度低，Ampholine用量又高，则往往干扰较明显，严重时应进行矫正;?一般与样品不起化学反应。 图14 瑞典LKB公司Ampholine的结构式PH范围 等电聚焦的优点是:?有很高的分辨率，可将等电点相差0.01,0.02PH单位的蛋白质分开;?一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄;?由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离;?可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01PH单位。等电聚焦电泳也有缺点，一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。 电聚焦技术要求有稳定的PH梯度，要求有防止对流和防止已分离区带再混合的措施，其办法有三:密度梯度等电聚焦，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦和区带对流等电聚焦，本文仅介绍以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的等电聚焦的技术。聚丙烯胺凝胶等电聚焦电泳其原理已与普通聚丙烯酰胺凝胶电泳不同，它不利用凝胶的分子筛作用。 (二)操作方法 1.仪器与设备 同一般盘状电泳和平板电泳。 2.试剂 丙烯酰胺;甲叉双丙烯酰胺;四甲基乙二胺，过硫酸铵、蔗糖、两性电解质载体Ampholine PH4,10，20%(上海生化所东风厂生产，瑞典LKB产品有40%的)等。 表6 等电聚焦板状凝胶液的组成(ml) 胶的PH值 试 剂 5.5,9.5 2.5,6 5,8.5 7.5, 10.5 丙烯酰胺30%甲叉双 10 10 10 10 丙烯酰胺1.2%(W/V) 核黄素4mg/100ml水 0.4 0.4 0.4 过硫酸铵2% 0.4 四甲基乙二胺1% 3 3 3 3 蔗糖25%(W/V) 30 30 30 山梨醇25%(W/V) 30 两性电解质40% PH值 3.5,10 2.3 2.5,10 1.2 4,6 0.2 1.2 5,7 0.2 0.6 1.5 7,9 1.5 0.2 9,10 0.4 3.6 水和样品总体积 13 13.6 13.6 12.8 3.胶的制备 圆柱状胶:总体积30ml中内含丙烯酰胺5.7ml，蔗糖15ml，四甲基乙二胺0.45ml，水5ml，20%两性载体电解质3ml，过硫酸铵1.25ml。此凝胶浓度(T) ,7.2%，交联度(C) ,2.1%，蔗糖浓度为12.5%，两性载体电解质含2%。如果蛋白质样品比较稀，可以放在胶的混合液中一起聚合，这时应扣除蛋白样品体积，即蛋白质样品溶液可看作为水体积。 板状胶:若采用平板电泳，则需制备板状胶，其组成参考表6。其中T,5%，C,4%。制胶的方法与一般凝胶电泳相同;用核黄素作催化剂的是光聚合，用过硫酸铵作催化剂的是化学聚合。 4.加样 根据等电聚集原理，每个蛋白质都浓缩在它的PI位置，所以聚焦时样品不需要加成窄带，而且可以加在凝胶表面的任何一个位置，如图15样品被加在胶的中间或被加在整个胶都可得到相同的结果。 处次实验时，可用不同浓度的样品且放在不同位置来摸索，以确定合适的浓度和位置。如果样品较浓，且易失活，通常把样品加在凝胶的顶部。为了不使样品接触电极溶液，在加内含10%蔗糖的10,50μg样品后，再将胶管顶部另加1%两性电解质。样品也可以在凝胶经预电泳后加入，但要注意PH值对蛋白质样品的影响程度。如果样品对高PH值敏感的话，一般在电泳前加入。因为在电泳前，负极端的PH值接近介质PH值，电泳进行后，在很短时间内S型的PH值梯度就形成，这时负极端的PH值较高。 图15 加样方式 5.电泳 常用的负电极槽溶液有乙醇胺，三乙醇胺或氢氧化钠;正极槽溶液用磷酸、硫酸。一般负极槽溶液用2%的三乙醇胺，正极槽溶液用1.7%磷酸。上槽为负极，下槽为正极。起始电流每胶管1mA，半小时后，电压逐步升高，电流下降，待电压上升到370V左右不再上升，电流下降到小于2mA左右时，再继续电泳1小时。从开始到泳动完毕约为6小时。起始电流大，PH值梯度形成快，聚胶时间短，但易局部发热，聚焦后蛋白带不齐，胶发生断裂等现象。一般在10?以下进行，起始电流控制在每胶管0.1,1mA。板状胶等电聚焦的电极槽溶液列于表7。对于25?10?2cm的胶板，平均功率10W，即50V/cm，聚焦4,6小时。 表7 板状胶等电聚焦的电极槽溶液 PH值范围 负 极 正 极 3.5,9.5 1mol/L NaOH 1mol/L HPO34 2.5,6 0.5%两性解质PH5,7 1mol/L HPO 34 5,3.5 0(1,1mol/L NaOH或 0.1,0mol/l HP0或 34 1%两性电解质PH5,9 1%两性电解质PH值5,10 7.5,10.5 1mol/L NaOH 0.1%两性电解质PH7,9 6.染色 蛋白质染色:电泳完毕后，将胶柱或胶板取出放入12.5%三氯乙酸(TCA)溶液里过夜。并更换两次，然后进行蛋白染色。 表8 常 用 的 染 色 方 法 12.5%三氯去色时甲醇?水?冰醋酸 染料浓灵敏度染 料 乙酸浸泡间(小度%(W/V) (μg) 染色液 去色液 次数 时) 氨基黑 3 0.2 50?50?10 66?33?10 10,20 5,10 10B 考马斯 亮蓝 3 0.2 50?50?10 33?66?10 3,5 0.5,1 G250 考马斯 亮蓝 3 0.2 50?50?10 33?66?10 3,5 0.5,1 R250 考马斯 亮蓝 0或1 0.2 50?50?10 33?66?10 2,3 2 R150 亮 绿 0或1 0.2 1 33?66?10 33?66?10 3 常用染色方法见表8。对于一般蛋白质来说用考马斯亮蓝G-250过氯酸溶液染色较好，显色较快，不需要脱色就可以看出清晰的蛋白带。 7.PH梯度的测定 用1mm宽的广谱PH试纸条，贴到一条没加蛋白质样品的胶上，用水湿润PH试纸，定性观察PH梯度。将另外两个没有加蛋白质的胶条，切成5mm长的小段，加入去离子水3ml浸1,2小时，用精密PH计测定其PH值。以距阳极端的距离为横座标，以其对应的PH为纵 座标作PH梯度曲线。 8.等电点测定 将欲测样品同时做4根胶柱。其中两根胶柱作为蛋白或酶谱显色，以决定蛋白带和酶带的位置。另两根胶柱切成5mm切段，将相对应的切段按顺序浸入4ml去离子水中(用前煮沸，除去CO，以免影响PH值)，加盖，置冰箱中过夜，第二天用PH计测各切段溶液的PH。2 将PH值与胶的长度作PH梯度图。相应蛋白带或酶带位置的PH值就是等电点。 9.扫描 脱色后的胶柱可用光密度计扫描。 六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶分为原性凝胶和变性凝胶两种。所谓原性凝胶，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。分子量不同，而带静电荷相同，可有相同的迁移率。因此在原性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的。所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇苏二硫、糖醇等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。本节介绍SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与方法。 (一)原理 SDS(sodium dodecyl sulfate)，HCNaSO M,288.38g/mol，是一种很强的阴离子表25124 面活性剂。SDS能破坏蛋白质分子间的结构(尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下，使蛋白质分子内的二硫键还原打开)，并以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。所引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电荷的10倍，使得其所带电荷远超过蛋白质原有的净电荷，从而清除或大大降低了不同蛋白质之间所带的净电荷不同对电泳迁移率的影响。 SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，由蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒(图16)，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为10A，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。 这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，迁移率只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数，可用下式表示。 -bmM,K(-10) 1gM,1gK-bm,K-bm 1 M为蛋白质的分子量;K、K为常数，b为斜率，m为迁移率。上式也称Ferguson方程。 1 测定时，通常选用已知分子量的标准蛋白质作为“标记物”(maker)，与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳，将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率，在半对数坐标纸上与分子量的对数作图，可得到一条lgMW-m的标准曲线(图R16)，从标准曲线上找出待测蛋白质样品的m所对应的lgMW，即可求得分子量。 R 现在经SDS-凝胶电泳研究过的蛋白质已有一百多种。由于用这一方法测定蛋白质分子量具有分辨率高，重复性好，设备简单，操作简便、快速等优点，已发展成为蛋白质研究的有力工具。在分子量为15000,20000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在?10%以内。 但用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题: 1.如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4g SDS/1g, 蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素，主要有以下3个:(1)二硫键是否完全被还原;只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。(2)溶液中SDS的浓度:溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般高达10倍以上。(3)溶液的离子强度:溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。 图16 蛋白质样品在100?用SDS和还原试剂处理3,5分钟后解聚成亚基 图17 37种蛋白质的分子量对数对电泳迁移率作图 分子量范围为11000,70000,10%凝胶,PH7.2 SDS-磷酸盐缓冲系统 2.不同的凝胶浓度适用于不同的分子范围， Weber的实验指出，在5%的凝胶中，分子量 25000,200000的蛋白质，其分子量的对数与迁 移率呈直线关系;在10%的凝胶中，10000,70000分子量的蛋白质呈直线关系;在15%的凝胶中，10000,50000分子量的蛋白质呈直线关系;3.33%的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%。 可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2,0.8之间均匀分布。 在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线。 3.有许多蛋白质，是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其他方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果相互参照。 4.不是所有蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有:电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)，以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有电荷的影响。例如组蛋白F，分子量为21000，但由于它本身1 带有大量正电荷，SDS-凝胶电泳测定的结果却是35000，偏差较大。对于这些蛋白，至少要用两种方法来测定分子量，互相验证。 (二)操作方法 1.溶液配制 ?制备凝胶所需的溶液 溶 液 每100ml 溶液中的组分 备 注 号 丙烯酰胺 30g 过滤后，贮棕色瓶 1 甲叉双丙烯酰胺 4?保存 0.15g Tris 2 42.39% 加HCl调至pH8.8 SDS 3 40?时溶解，在15?以下难溶 10g EDTA?2Na 4 搅拌微热溶解 8.16g 过硫酸铵 5 现用现配 7.5g 丙烯酰胺 30g 6 去沉淀，贮棕色瓶4?保存 甲叉双丙烯酰胺 1.5g Tris 7 15.1g 加HCl调至PH6.8 市售化学纯SDS需重结晶后使用。方法:20g SDS，放入500ml烧瓶中，加约半牛角匙活性炭与300ml无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个冷凝管。在水浴中加热至乙醇微沸，洄流约10分钟，热过滤，滤液冷至室温后，移至-20?冰箱过夜。次日，收集结晶，真空干燥或40?以下烘干。 ?蛋白质样品处理液:0.5mol/l PH6.8 Tris-HCl缓冲液6ml;SDS(纯化的)1g;巯基乙醇 0.5ml;蔗糖 20g;溴酚蓝 0.005g， 加蒸馏水稀释至50ml。 ?电极缓冲液:1mol/l Tris 25ml;1.9mol/L 甘氨酸 100ml;10%SDS 5ml; 0.2mol/L EDTA?2Na 5ml，加蒸馏水稀释至500ml。 ?染色液:考马斯亮蓝 R-250 0.25g;甲醇 45ml;冰乙酸 9ml，加蒸馏水至100ml。 ?退色液:甲醇 50ml;冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。 ?样品提取液:0.1mol/L PH 7.2磷酸缓冲液中含有0.4mol/L NaCl和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP);NaHPO?HO 4g;NaHPO?7HO 19.3g;NaCl 2.3g;PVP 1g，加水量100ml并242242 调节PH为7.2。 2.样品提取 将所测样品称量后放入冰浴的研钵中，加入相当于样品量0.5,1倍的样品提取液，研磨后20000转/分，0?离心15分钟，上清液冰浴备用。 3.制板 根据所测样品蛋白质分子量的大小按下表比例配制分离胶与浓缩胶。类同于垂直平板聚丙烯酰凝胶的制作方法制板。 分离胶的配制比例(总量30ml) 分 离 胶 的 浓 度 溶液号码 10% 12% 16% 18% 20% 1 10 12 16 18 20 2 3 3 3 3 3 HO 16 14 10 8 6 2 3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 TEMED 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 5 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 浓缩胶的配制比例(25ml) 所需溶液 溶液号码 所需溶液ml数 溶液号码 ml数 6 2.5 4 0.25 7 2.5 TEMED 0.06 HO 19.2 25 0.2 8 0.25 4.样品处理 标准蛋白样品的制备 称取已知分子量标准蛋白样品，如细胞色素C(MW:12500);胰凝乳蛋白酶原A(25000);胃蛋白酶(35000);卵清蛋白(43000);牛血清蛋白(67000);各0.5mg左右，分别放入小试管，按0.5mg蛋白质加1ml溶液的比例加入蛋白质样品处理液。充分溶解，将小试管放入沸水浴中加热2分钟，取出冷至室温。 待测蛋白质样品的制备 按1?1比例，把待测样品提取液与蛋白质样品处理液混合， 如果提取液蛋白含量低时，先浓缩后再与蛋白样品处理液混合，或提高蛋白样品处理液的浓度。以下操作与标准蛋白样品的制备相同。 5.点样 用微量进液器或定量加液器把处理后的待测样品与不同分子量的蛋白标准样品放入凝胶板的样品孔中，并作好标记。为了防止样品扩散，点样时，就可通电，上槽接负极，下槽接正极，使电流2,3mA。 6.电泳 全部样品点完后，把电泳槽移入冰箱，将电流调至10mA，30分钟后加到25mA左右，待溴酚蓝前沿跑到底部约1cm，电泳完毕，取胶，并在前沿处作记号。 7.染色与脱色 将凝胶放入染色液中，室温下染色1小时，然后放入退色液中浸泡，数小时换一次退色液，直至背景清晰，约需1昼夜。 8.分子量计算 用直尺分别量出样品区带中心，前沿与分离胶顶端的距离，分别计算待测样品与标准样品的相对迁移率，然后以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到的标准曲线如图17，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。 七、聚丙烯酰胺浓度梯度凝胶电泳技术 用连续SDS-PAGE测定蛋白质分子量，由于SDS及巯基乙醇的作用，天然蛋白质解离为亚基或肽链，因此测得的分子量不是天然蛋白质的分子量，为弥补这一缺陷，1968年以来Nargolis和Slater等人先后采用了凝胶的浓度梯度电泳(孔径梯度电泳)作为分离和鉴定蛋白质的方法，并首次将此方法用于分子量的测定取得了令人满意的结果。Slater等人运用凝胶的浓度梯度电泳发现所试验的13种已知分子量的蛋白质中有12种蛋白质的迁移率与其分子量对数成线性关系。且分辨力比均一浓度胶中的好。目前，这一实验技术已用于蛋白质的分离和分子量的测定。 (一)原理 聚丙烯酰胺凝胶的浓度可在一定范围内(如4,30%)连续地改变，凝胶浓度不同和交联度不同可改变凝胶中的网状孔径。在线性浓度梯度凝胶电泳中，蛋白质在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐减小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力越来越大。最初，蛋白质在凝胶中的迁移速度主要受两个因素的影响，一是蛋白质本身的电荷量，电荷越多，受到的电场力越大，迁移速度越快;二是蛋白质本身的大小，分子量越大，迁移速度越慢。当蛋白质迁移所受到的阻力大到足以完全停止它前进时，低电荷密度的蛋白质将“赶上”与它大小相似，但具有较高电荷密度的蛋白质。因此，在梯度凝胶电泳中，蛋白质的最终迁移位置仅决定于它本身分子的大小，而与蛋白质本身的电荷量无关，梯度凝胶电泳的情况可用图18来表示。 图18 梯度凝胶电泳示意图 A.电泳开始前 B.电泳结束时 图中的方格代表凝胶的孔径，图中的圆球分别代表大、中、小三种不同的蛋白质分子。A代表电泳开始前的分子状况，B代表经过长时间电泳后，所有大小不同的分子进入凝胶孔径梯度中，分别滞留于与分子大小相当的凝胶孔径中。从以上讨论看出，在梯度凝胶电泳中，分子筛效应体现得更为突出，因此，有人也称之为分子筛电泳。由于蛋白质的相对迁移率与其分子量的对数在一定范围内成线性关系，因此通过制作标准曲线，在相同条件下进行未知样品电泳，便可测定出其分子量。 梯度凝胶电泳与均一凝胶电泳相比有以下优点: 1.具有使样品中各组分浓缩的作用，在样品大而稀的情况下，可在电泳过程中分二、三次加样，因为大小不同的分子量最终都滞留于与其相应的凝胶孔径中。 2.可提供更清晰的蛋白质谱带，因此能用于鉴定蛋白质的纯度。 3.可在一个凝胶片上同时测定分子量范围相当大的蛋白质。例如，胶浓度为4%,30%梯度胶可以分辨的分子量范围为50000,2000000。 4.可以直接测定天然状态蛋白质的分子量，不需解离为亚基。这一方法可与SDS凝胶电泳测定分子量的方法相互补充。 梯度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白的分子量，而对纤维蛋白将会产生较大的误差。再则，由于分子量的测定仅仅是在未知蛋白质和标准蛋白质到达了被限定的凝胶孔径时，即完全被阻止迁移时方成立，在电泳时要求要足够高的电压(一般不低于2000V)，否则将得不到预期的效果。因此，采用这一方法测定蛋白质的分子量也有一定局限性。 (二)操作方法 1.仪器的准备 (1)电泳槽:垂直平板电泳槽，使用前装好、试漏; (2)梯度凝胶制备装置(图19)。B混合室中放低浓度胶液，而A贮液室中放高浓度胶液。 图19 梯度凝胶电泳灌胶装置示意图 A 贮液室，B 混合室; 图15 简易梯度混合器示意图 图14装置中，假如B混合室与A贮液室截面积相 等。配制的凝胶梯度为直线型的，其浓度计算可按下式 计算: 图19装置中，假如B混合室与A贮液室截面积相等。配制的凝胶梯度为直线型的，其浓度计算可按下式计算: C,(CC)v/V+C tA-BtB C:某一时刻混合室流出的胶液浓度; C:贮液室原初浓度; C:混合室原初浓度; V: tAB 贮液室与混合室溶液的总体积;v:溶液流出速度; t:时间 2(4%,30%梯度胶的制备 (1)4%与30%的凝胶配方 ?10.75g Tris，5.04g硼酸，0.93g EDTA?2Na，定容于1000ml水，PH8.3 ?57.6g丙烯酰胺，2.4g甲叉双丙烯酰胺，定容于100ml贮液?中 2份 ?7.68g丙烯酰胺，0.32g甲叉双丙烯酰胺，定容于100ml贮液?中 2份 ?0.3ml四甲乙二胺，定容于100ml贮液?中 1份 1份 ?0.3g过硫酸铵定容于100ml贮液?中 1份 1份 贮液?需单独抽气，临混合时才与其他贮液混合，以免胶液过早聚合。 (2)4%,30%的梯度胶的灌注 用水先量取胶模的体积，按体积的二分之一分别配制4%与30%的胶液，4%的胶液适当多配一些。将4%胶液倒入贮液室A，30%的胶液加入混合室B。打开电磁搅拌及梯度混合器的开关，接着起动蠕动泵，将梯度混合器中的溶液缓缓输入凝胶模中，事先将输液管出口由凝胶模上口中央伸向底部，随着凝胶模内液面的升高逐渐提高输液管口，使管口始终接近液 分，约10分钟灌胶完毕。 面而不伸进液体内部。控制流速2ml/ (3)于梯度胶液面上小心加入25%乙醇约3mm高，静置30分钟后即可聚合。 (4)待胶液聚合后，取出上面含有乙醇的水层，取2ml 4%胶液洗梯度胶面，吸出后，再加4%胶液于梯度胶上。向此胶液中插入样品格模板，使其下沿刚好接触梯度胶面而不要伸进胶内，待聚合后，于室温放置半小时后方可使用。 3.预电泳 小心取出样品格模板，用滤纸吸去孔内水分。于两个电极槽内加入电极缓冲液，把电泳槽放入冰箱，然后接通电源，上槽接负极，下槽接正极，维持电压70伏，预电泳30分钟。 电极缓冲液配制:10.98g Tris，4.95g硼酸，0.93g EDTA?2Na，加水溶解，定量至1000ml。 4(加样 将数种标准蛋白样品，如血清蛋白(67000)，乳酸脱氢酶(140000)，过氧化氢酶(232000)，铁蛋白(440000)，甲状腺球蛋白(669000)等，按1mg/ml的浓度溶于含20%蔗糖的电极缓冲液中，并加5μl 0.1%溴酚蓝溶液，混合后加入样品孔。待测样品的制备类同标准蛋白样品。 在测定分子量时，待测样品和标准样品必须在同一凝胶片上进行电泳。 5(电泳 接通电源，将电压调至70伏，电泳15分钟后，见样品缓慢进入胶内，然后将电压升高至150伏，维持恒定电压，电泳15,16小时，电泳至少要2000伏特每小时，若冷却条件好，可升高电压，缩短电泳时间。 6(固定、染色、脱色 ?固定:电泳结束后，取出凝胶片，置培养皿内，用10%磺酸水杨酸浸泡30分钟左右。 ?染色:将固定过的胶片用0.1%考马斯亮蓝R250-25%甲醇-10%乙酸溶液(称取1g考马斯亮蓝R250，溶于250ml甲醇，再加100ml冰乙酸，用水定容至1000ml)，浸泡过夜。 ?脱色:将染过的胶片浸于2.5%甲醇-10%乙酸的脱色液中浸泡，每隔数小时更换一次脱色液，直至胶片无色透明，显出清晰的谱带，也可电泳脱色。 7(分子量测定 以凝胶片前沿或迁移距离最大的标准蛋白质为参考点，计算每种标准蛋白的相对迁移率(m)。 R m, 蛋白质从原点迁移的距离/从原点到参考点的距离 R 以m值为横坐标，标准蛋白分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。测量未知蛋白质的R 相对迁移率，利用标准曲线便可求出其分子量。 八、用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物的同工酶 同功酶(lsozymes或Isoenzyme)，分析技术首先由Markert和Moller于1957创建。同功酶原指作用底物相似或完全相同的酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一类酶。以后有人把具有催化活性的单一电泳组分称之为同功酶。随后考虑这定义不够严格，因为有的单一电泳组分可能是由于物理、化学方法处理样品不当而造成的。因此，按照化学命名法国际委员会的建议，同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。近来有人根据生物高分子结构与功能的一致性提出，既然酶的分子形式不同，功能也就会有若干差异。但从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源、生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具;此外，同工酶还与植物病害有一定联系，可用来鉴定抗病的强弱。 分离同工酶的方法有:电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率为最好。 植物样品的同工酶鉴定通常有以下过程: 1.从植物样品中提出粗酶液。 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开。 3.用专一作用的底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶酶谱。 4.记录分析结果。 下面把操作过程与某些同工酶的显色方法介绍如下: (一)样品的提取 将材料加入预先冷却的研钵，视材料量按1?5左右的比例加入提取介质(蔗糖11.98g,Tris 0.606g，抗坏血酸钠0.088g，半胱氨酸0.030g和氯化镁0.020g，PH7.4，定容于100ml)在冰浴中研磨成匀浆，高速(10000,20000转/分)冰冻(0?)离心。取上清液作为酶的粗提液，0?冰箱中保存。 (二)点样与电泳 按本讲义三聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法制作标准凝胺(C,7.2%,T,26%)然后点样与电泳。 (三)染色(根据所需鉴定的同工酶进行保温染色) 1.过氧化物酶[Peroxidase(E.C.11.1.7.),PER或POD] 过氧化物酶同工酶的染色方法根据供氢体分为联苯胺、联大茴香胺(o-dianisidine)、愈创木酚、联苯三酚儿茶酚、咖啡酸、丁子香酚、吲哚乙酸、醋酸联苯胺等。最常用的为联苯胺(该物质有毒，使用时注意)。 方法1 抗坏血酸-联苯胺染色法 显色液:抗坏血酸70.4mg，联苯胺贮存液(2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加入蒸馏水72ml)20ml，0.6% HO20ml和蒸馏水60ml，用前混合。 22 显带和固定:凝胶板(柱)用蒸馏水漂洗后，浸入显色液中，室温下1,15分钟内，酶活性区逐渐出现蓝色。显带后用水洗去显色液，即可以在透射光源下照相。凝胶可固定在蒸馏水5份，甲醇5份和冰醋酸1份的混合液中，酶带逐渐变成棕色。 方法2 联大茴香胺染色法 显色液:联大茴香胺250mg溶于140ml 95%乙醇中，加蒸馏水20ml，使用前加4,5ml 3%HO。 22 显带与固定:凝胶先浸入PH4.7的乙酸缓冲液中20分钟，然后换取联大茴香胺显色液浸泡20分钟左右，过氧化物酶同工酶即显现出红褐色的酶带。置7%乙酸中保存或照相或制成干板长期保存。 PH4.7 0.2mol/L乙酸缓冲液的配法:4.5g无水乙酸钠与2.65ml冰乙酸溶于1000ml蒸馏水中。 方法3 联苯胺染色法 显色液:0.1g联苯胺加5ml无水乙醇，再加10ml 1.5mol/L 乙酸钠及10ml 1.5mol/L乙酸，加蒸馏水75ml，染色前加5,6滴HO原液。 22 显带与固定:取出凝胶漂洗后，放入显色液中，稍加振动，片刻即显示出蓝色酶带，待酶带完全出现后，随即用水冲洗，照相或保存在7%乙酸中，或制作干板保存。 2(淀粉酶[Amylase (E.C.3.2.1.1.),EST] 显色液(I-KI溶液):12gKI加入1.2gI溶于0.5%乙酸溶液中，定容1000ml。 22 1%的淀粉液:5g可溶性淀粉加200ml蒸馏水，沸水浴至呈透明状，然后加水至500ml。淀粉液也可用0.2mol/L PH5.0乙酸缓冲液配制。 显带与保存:取出凝胶，放在1%淀粉液中1小时，待淀粉被凝胶吸收后，用0.2mol/L PH5.0的乙酸缓冲液冲洗胶面多余淀粉，然后把凝胶浸在0.2mol/L PH5.0乙酸缓冲液中，37?保温1.5小时。然后把胶放到显色碘液中，在蓝色背景上出现白色透明，或粉红或褐色条带即为淀粉酶带。倒出碘液，用水洗后保存在乙醇10份，冰乙酸4份，甘油2份和水8份的混合液中。 2mol/L PH5.0乙酸缓冲液配制:1.7ml冰乙酸+5.78g无水醋酸钠，定容于1000ml水中。 3.酯酶[Esterase (E.C.3.2.1.1),EST] 方法1 显色液:40mg 醋酸-α-萘酯和40mg 醋酸-β-萘酯溶于5ml丙酮中，再加入60mg坚牢蓝RR，待溶后倒入45ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液中(PH7.5)。 显带和固定:凝胶板(柱)漂洗后，在显色液中，37?下浸40分钟，则酶活性区出现棕色或红棕色酶带。显带后用水清洗显色液，固定在乙醇?冰乙酸?甘油?水,10?4?2?8的混合液中。 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液的配制:NaHPO?2HO 2.58g，NaHPO?12HO30.1g定242242 容于1000ml水中。 方法2 显色液:7%醋酸-α-萘酯的丙酮溶液0.5ml，坚牢蓝RR 12.5mg，0.2mol/L Tris-HCl PH7.1缓冲液1ml，水23.4ml。 显带与固定:凝胶在0.2mol/L Tris-HCl PH7.1的缓冲液中预浸，然后放在显色液中，37?保温30,60分钟，至酶带清晰为止，水冲洗后照相或保存在7%乙酸中。 0.2mol/L Tris-HCl(PH7.1)配制:24.2g Tris加800ml水溶解，然后滴加6mol/L HCl约15ml，用酸度计测量待PH下降至7.1时，停加HCl,最后加水定容至1000ml。 4.细胞色素氧化酶[cytochrome oxidase(E.C.), COD] 显色液:1份1%二甲基对苯二胺，1份1%α-荼酚(溶于40%乙醇)，25份0.1mol/L Ph7.4,磷酸缓冲液，混合后即可使用。 显带:凝胶用蒸馏水漂洗后，浸入显色液中，室温下放置30,60分钟，酶活性区出现蓝色酶带。马上照相或置于水中短期保存。 1mol/L PH7.4磷酸缓冲液的配制:NaHPO?12HO 29.0g，NaHPO?2HO 3.0g，定容于242242 1000ml水中。 5(过氧化氢酶[catalase (E.C.1.11.1.6),Cat或CAT] 方法1:凝胶用水漂洗后，浸入0.05mol/L磷酸钾缓冲液(PH7.0)2.5份二氨基联基胺(4mg/ml)的水溶液和1份过氧化物酶(1mg/ml)水溶液的混合物中，23?下放置4,5分钟。倒掉混合液，并用水洗涤，然后倒入含有0.6%HO的0.05mol/L磷酸钾缓冲液(PH7.0),23?22 下直至棕色凝胶背景上出现白色酶带。洗去过氧化氢液，照相或固定在水?甲醇?冰醋酸,5?5?1的混合液中。 0.5mol/L PH7.0 磷酸钾缓冲液的配制:KHPO 6.8g溶于800ml水中，滴加1mol/L 24 NaOH(约29.6ml)，并用酸度计测定溶液PH，PH上升至 7.0时停止加NaOH，定容于1000ml水中。 方法2:取3%过氧化氢25ml，0.1mol/L PH7.0磷酸缓冲液5ml,0.1 mol/lNaSO?5HO 232 (1.9g/100ml)3.5ml，配成A液;又取0.09mol/L 碘化钾 (1.49g/100ml)25ml,加水25ml配成B液。 凝胶浸泡在A液中，室温下放置15分钟后倒出A液，用蒸馏水彻底冲洗干净，加入B液，酶活性表现在蓝色的背景上的白色区带，水洗后立即照相。 方法3:分离胶需含有0.5%可溶性淀粉，电泳后，凝胶在0.5%HO中浸1分钟，然后用22 蒸馏水漂洗，再放入酸化的0.5%KI溶液(0.5% KI 100ml加入冰醋酸0.5ml)染色，凝胶上有过氧化氢酶活性部分不被染色，而凝胶则变成蓝色。 6(乙醇脱氢酶[alcohol dehydrogeuase(E.C.1.1.1.1),ADH] 显色液:0.1mol/L PH8.0 Tris-HCl 100ml中，加入2ml乙醇或其他醇，0.1mol/L KCN 2 ml 40mg辅酶I(NAD)，40mg氮蓝四唑(NBT)，5mg吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)。 显带和固定:凝胶用蒸馏水漂洗后，浸入显色液中，在37?黑暗中保温约30分钟，直到显出暗蓝色的酶带。水漂洗后，固定在乙醇?冰乙酸?甘油?水,10?4?2?8的混合液中。 7(苹果酸脱氢酶[Malate dehydrogenase(E.C.1.1.1.37),MDH] 显色液:100ml 0.1mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液中加入5ml 1mol/L L-苹果酸钠(12.15g NaCO?HO溶于50ml水中置冰浴中加入13.4g dl-苹果酸，加水至100ml)，50mg NAD，30mg 232 NBT,2mg PMS。 显带和固定:凝胶用蒸馏水漂洗后，浸入显色液中，在暗处37?保温2小时左右，直至出现深蓝色酶带，固定在乙醇?冰乙酸?甘油?水,10?4?2?8的混合液中。 8.乳酸脱氢酶[lactate dehydrogenase(E.C.1.1.1.27),LDH] 方法一:按下列比例配置反应染色液 0.2%NBT:0.2%PMS:0.01mol/l NAD:70,80%乳酸钠:0.05mol/l磷酸钠缓冲液PH7.0,8:1:5:10:26。在37?黑暗条件下保温20,30分钟，酶带被染成蓝色。 方法二:用NAD 66mg，NBT 35mg，PMS 2mg，1mol/l乳酸钠溶液10ml，0.1mol/l Tris-HCl PH7.0缓冲液50ml，蒸馏水40ml。在37?黑暗条件下保温2小时，酶带被染成蓝色。 9.谷氨酸脱氢酶[glutamate dehygrogenase(E.C.1.4.1.2),GDH] 方法一:按下列比例配置反应染色液 0.2%NBT:0.2%PMS:0.01mol/l NAD:10% l-谷氨酸:0.1mol/lTris-HCl PH8.5,5:3:6:2:34。在37?黑暗条件下保温1小时，酶带被染成蓝色。 方法二:用l-谷氨酸150mg，NAD 20mg，NBT 15mg，PMS 5mg，0.01mol/lTris-HCl PH8.5 缓冲液50ml。在37?黑暗条件下保温1小时，酶带被染成蓝色。 方法三:NAD 30mg，NBT 20mg，PMS 4mg，谷氨酸钠盐800mg，10mmol/l氯化钙0.2ml， 0.1mol/lTris-HCl PH7.5缓冲液100ml。将胶板放入上述染色液中，37?黑暗条件下保温1,2小时，显示出深蓝色酶带，用水洗后，在乙醇:甘油:水,1:1:2溶液中固定1小时，并制成干板。 10.超氧化物歧化酶[superoxidae dismutase (E.C.1.15.1.1),SOD] 方法一:按下列比例配置反应染色液:0.2%NBT:0.2%PMS:0.1mol/l Tris-HCl PH8.0,8:2:40。将电泳后的胶板用水漂洗后,放在上述染色液中暴光浸泡几分钟,然后在在37?下保温,直到在暗背景下显出灰白色酶带,即酶带为负染色。 方法二:将电泳后的胶板用水漂洗后放入100ml(含MTT 200mg)的0.05mol/l 磷酸缓冲液PH7.5中,30?黑暗条件下保温20分钟,倒去保温液,加入100ml(内含TEMED 0.4ml,核黄素1mg)0.05mol/l 磷酸缓冲液PH7.5.用日光灯照射20分钟,直至显出白色酶带。 11.抗坏血酸氧化酶[ascorbate oxidase(E.C.1.10.3.3)，AOD] 用水漂洗胶板后，浸入100ml含20mg抗坏血酸的0.1mol/l TrIS-HCl PH8.0缓冲液中, 30?下保温20分钟,倒去缓冲液,倒进100ml含有25mgDCPIP染色液,染色10分钟直至在蓝色背景上出现无色的酶带,立即记录或照相。 九、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳～ 分离和鉴定叶绿素-蛋白质复合体 (一)原理 在绿色植物中，叶绿素依其功能可分为两种截然不同的类型:一种是能吸收光能的天然叶绿素;另一种是存在于光合作用反应中心起光化学反应的特殊叶绿素。这些色素尽管功能各不相同，但都是以叶绿素-蛋白质复合体的形式存在于叶绿体膜中。因此，在研究叶绿素-蛋白质复合体的性质时，首先要用去污剂，如十二烷基磺酸钠(SDS)来增溶叶绿素-蛋白质复合体。 SDS与叶绿素-蛋白质复合体相结合，不仅形成了牢固的带负电荷的SDS-叶绿素-蛋白质复合物，而且不改变叶绿素-蛋白质复合体的构型，使其具有扁平、紧密的椭圆形或棒状结构。 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳能把叶绿体的叶绿素-蛋白质复合体分开，并进行鉴定。 (二)试剂和仪器 1. 分离胶的丙烯酰胺凝胶贮液:44%丙烯酰胺溶液，内含0.4%甲叉双丙烯酰胺，过滤后，于棕色瓶中在4?下贮存。 2. 0.2%过硫酸铵溶液(用时新配) 3(0.6%四甲基乙二胺(TEMED)溶液 4. 分离胶(下层胶)缓冲液:1.7mol/L Tris-HCl缓冲液，内含0.4%SDS，PH9.18。 5. 浓缩胶(上层胶)缓冲液:0.22mol/L Tris-HSO缓冲液，内含0.4%SDS，PH6.14。 24 6(浓缩胶的丙烯酰胺(Acr)凝胶贮液:12%丙烯酰胺溶液，内含0.8%甲叉双丙烯酰胺，过滤后，于棕色瓶中在4?下贮存。 7(上槽电极缓冲液:42mmol/L Tris 溶液，内含65mmol/L 甘氨酸和0.1%SDS，PH8.64 8. 下槽电极缓冲液:42mmol/L Tris溶液，内含65mmol/l 甘氨酸，PH9.5。 9(样品增溶液:3mol/L Tris-HCl缓冲液，内含10%甘油和2% SDS PH8.8。 10(0.1mol/L Tricine缓冲液，内含0.4mol/L 山梨醇，PH7.8。 11(50mmol/L Tricine 缓冲液，PH8.0。 12(50%甘油 13. 电泳槽及其配件:直流稳压电流(600V，100mA);玻璃匀浆器;冰冻离心机;分光光度计;日立256双波长双光束分光光度计;组织捣碎机。 (三)操作步骤 1(叶绿体的制备 50g小麦(或其他植株)叶片，置于预冷的组织捣碎机的玻璃缸内，加入100ml 0.4mol/L山梨醇-0.1mol/L Triscine缓冲液，制成匀浆，匀浆经两层尼龙布过滤，滤液在0?下用1000?g离心10分钟，弃去上清液，沉淀用25ml冷的无离子水洗一次，匀浆用10000?g离心10分钟，弃去上清液，沉淀用25ml 50mol/L Tricine在玻璃匀浆器内匀浆，再用10000?g离心10分钟。然后，将沉淀悬浮于少量的50mmol/L Tricine缓冲液中，测定叶绿素含量后备用。 2(制胶 按表9的比例，分别将各组份混合后，抽气15分钟，再加入四甲基乙二胺，在1.3?8cm的玻璃管内制成胶柱备用。 表9 凝 胶 混 合 液 的 配 方 溶 液 浓缩胶混合液 分离胶混合液 浓缩胶缓冲液 2(5 - 分离胶缓冲液 - 1 浓缩胶丙烯酰胺贮液 2(5 - 分离胶丙烯酰胺贮液 - 1 四甲基乙二胺 1 1 过硫酸铵 1 1 水 4 - 3.样品的增溶 电泳前用预冷的SDS增溶液增溶，使SDS与叶绿素的比例为10?1(W/W)，增溶后的叶绿素浓度以1mg/ml为宜。增溶1,2分钟后，立即点样，进行电泳。 4.电泳 电泳在4?下进行。上槽接负极，下槽接正极，电压250V，电流强度开始时为2.5mA/管，当样品进入分离胶后，改为8,10mA/管。 5.叶绿素-蛋白质复合体的鉴定 (1)颜色:由于叶绿素-蛋白质的色素组成不同，因此，电泳后各个区带的颜色也不相同。P-叶绿素a-蛋白质复合体中，叶绿素a与叶绿素b之比大于7，呈蓝-绿色。捕光色770 素-蛋白质复合体具有等摩尔量的叶绿素a和叶绿素b，其a/b,1-1.8，呈黄绿色。光系统?反应中心的色素完全是叶绿素a，呈绿色，而游离色素带则由叶绿素a、叶黄素和SDS构 黄色。 成的复合体，呈绿- (2)电泳迁移率:不同类型的叶绿素-蛋白质复合体的分子量不同，其电泳迁移率也不同。迁移速度最快的是游离色素带;其次是捕光色素-蛋白质复合体，迁移最慢的是P-叶770绿素a-蛋白质复合体;而光系统?反应中心的迁移率则介于捕光色素-蛋白质复合体的不同多聚体之间。 (3)光谱特性: A.吸收光谱:电泳后，将胶柱取出，用刀片切下各带，使各带厚度一致。然后用日立356双波长双光束分光光度计测定各带的吸收光谱，从380,720mm进行自动扫描。其光谱特性如表10所示。 表10 不同类型的叶绿素-蛋白质复合体的吸收光谱、激发光谱和发射光谱 叶绿素-蛋白质复合体 吸收光谱(nm) 激发光谱(nm) 发射光谱(nm) P-叶绿素a-蛋白质 - - 700436 670 捕光色素-蛋白质 435 470 652 418 437 478 685 670 光系统?反应中心 435 670 418 435 475(弱) 681 B.室温荧光激发光谱和发射光谱:将凝胶柱用日立MPF-4型荧光光度计测定激发光谱和发射光谱。测定激发光谱时，发射波长为685nm，从400,500nm进行扫描。测定发射光谱时，激发波长为434nm和476nm，从650,750nm进行扫描。其光谱特性如表10所示。 C.低温(77?K)荧光激发光谱和发射光谱:将待测样品用50%甘油从凝胶中提取出来，加在石英管内，用MPF-4型荧光光度计测定。 上述光谱特性，对于不同制剂以及制剂的纯度不同，其吸收峰会有少许的位移。 十、SDS-聚丙烯酰胺浓度梯度凝胶电泳 测定线粒体蛋白的分子量 (一)原理 SDS是一种阴离子去污剂，使线粒体膜蛋白增溶并解聚成多肽，形成SDS-线粒体多肽复合物。复合物上结合的SDS负电荷大大超过了多肽本身的电荷，各多肽链之间的电荷差异减少到可忽略不计的程度。每单位的SDS-多肽复合物具有恒定的电荷、相似的构象和大体一致的形状。因此在给定的电泳条件下(PH、电压梯度、时间、胶浓度等)蛋白多肽的迁移率仅和蛋白质亚单位分子量大小直接相关。可通过比较未知蛋白的迁移率和标准蛋白的迁移率求得未知蛋白的分子量。 在梯度胶上电泳，蛋白(肽)进入胶浓度递增，胶微孔直径递降的区域。开始样品分子在孔径较大的凝胶区域泳动，各种大小不同的蛋白分子以各自不同的迁移率在电场中泳动。随着分离过程，胶孔径越来越小，蛋白质泳动越来越慢，最后孔径的大小阻止了蛋白质泳动，不同大小的样品分子之间形成稳定的区带。电场再继续作用时各区带相对位置不变，即某样品迁移到胶孔径大小所决定的位置后不再改变相对位置，因此在梯度胶上电泳比起在均匀胶上电泳有如下优点:(1)蛋白区带较窄，扫描时峰形尖锐，分辨率高。(2)可以制成各种不同胶浓度梯度的板，以适合各种不同分子量范围样品的分离，在同一块胶板上可分离广泛范围分子大小的样品。(3)操作方便。 (二)试剂和仪器 1.90mmol/L Tris-硼酸缓冲液，内含2.5mmol/L EDTA?Na，PH8.3(缓冲液A) 2 2.丙烯酰胺母液?:57.6g丙烯酰胺和2.4g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml缓冲液A中，30,40?温浴过滤 3.丙烯酰胺母液?:7.68g丙烯酰胺和0.32g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml缓冲液A中，过滤 4.10mmol/L过硫酸铵:0.3g过硫酸铵溶于100ml缓冲液A中 5.四甲基乙二胺溶液:0.3ml四甲基乙二胺溶于100ml缓冲液A中 6.电极缓冲液:含有0.2% SDS的缓冲液A，或40mmol/L Tris-乙酸钠缓冲液，内含2mmol/L EDTA?Na和0.2% SDS，PH7.4 2 7.25%异丙醇-10%乙酸溶液 8.0.05%考马斯亮蓝R-250溶液:考马斯亮蓝溶于10%冰醋酸-250%乙醇溶液中 9.脱色液:10%乙醇-10%乙酸溶液 10.样品处理液:125mol/L Tris-HCl缓冲液，内含4% SDS，20%甘油，0.01%溴酚蓝和20%β-巯基乙醇，PH8.0 仪器:电泳仪;梯度混合器;蠕动泵等. (三)操作步骤 1.线粒体蛋白(多肽)样品的制备 取一定体积(0.5ml)的经蔗糖密度离心纯化的线粒体悬液(10mg蛋白/ml)与等体积的样品处理液(含4%SDS，20%甘油，0.01%溴酚蓝，20%β-巯基乙醇，125mmlo/L Tris-HCl，PH8.0)混合于100?加热3分钟，在线粒体样品中所用SDS为4mgSDS/mg线粒体蛋白。 2.梯度胶的制备 (1)4%,30%梯度胶:分别配制4%和30%的凝胶。取丙烯酰胺母液?、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液，依2?1?1的体积比混合，即成4%的凝胶。再取丙烯酰胺母液?，过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液，依2?1?1的体积比混合，即成30%的凝胶。 (2)4%,15%梯度胺:依上述方法可制备4%的凝胶。取缓冲液A、丙烯酰胺母液?、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液，依1?1?1?1的体积比混合，即成15%凝胶。 3.凝胶板的制备 将梯度混合器与蠕动泵连接，液滴出口接至电泳槽的凝胶模内。先将梯度混合器两管之间连通的乳胶管用止血钳夹死，将15%凝胶侧入混合室中，其中放一个电磁搅拌子;将4%胶倒入贮液室中，放开止血钳赶掉气泡，打开电磁搅拌器及蠕动泵开关。流速选择需保证在15分钟左右灌完胶板。通向电泳槽凝胶模两玻璃板之间的尼龙管随灌胶过程液面上升而徐徐提升，以免扰乱梯度。做好胶板后，立即放好梳子(样品格模板)。静置约半小时后胶聚合，取出梳子待电泳。灌完胶后，注意及时清洗蠕动泵、混合器及所有连接的管道。同样操作也可制备4%,30%的梯度胶。 4.电泳 在凝胶的样品槽中，加样5,10μl。加样前，凝胶在10mA电流下预电泳1小时;加样后，先在30mA下电泳10分钟，再降低电流至16mA，电泳4小时。 5(固定、染色 电泳后，凝胶板浸泡在25%异丙醇-10%乙酸溶液中固定及去SDS，半小时后用蒸馏水冲洗，再浸于0.05%考马斯亮蓝溶液中，40?下染色2小时。染色后，用10%乙醇-10%乙酸脱色。 十一、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA (一)原理 不同分子量的核酸在一般介质(如滤纸、淀粉板等)中进行电泳时常不易分开，这是因为不同大小核酸分子的质量与电荷之比通常较接近的缘故。核酸的凝胶电泳则由于凝胶具有分子筛效应而获得较好的分级分离效果。常用于电泳的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。 通常分离RNA样品多采用2.4%,5.0%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。分子量较小的RNA可用较高浓度的凝胶，如低分子量RNA或RNA水解碎片的电泳用8%或更高浓度的聚丙烯酰胺。甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺单体的比例应随凝胶浓度的改变而不同。当凝胶浓度大于5%时，交联度可为2.5%;凝胶浓度小于5%时，交联度需增至5%。在聚丙烯酰胺浓度低于3%时，由于凝胶太软，不易操作，常加入0.3%琼脂糖，以增加凝胶的机械强度。 常用的电泳缓冲系统有Loening的三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸钠盐缓冲液和Peacock与Dingman的三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸钠盐缓冲液。在中性盐溶液中，RNA的电泳迁移率不仅取决于分子大小，而且还与分子的形状有关。因此，影响RNA二级结构的因素均将显著影响其迁移速度。Reijnders等建议在变性条件下(例如8M尿素或甲酰胺)进行凝胶电泳，此时RNA的二级结构已被破坏，其电泳迁移率与分子量的对数呈严格的反比关系。 (二)试剂与器材 试剂: 1(20%丙烯酰胺贮存液(交联度5%):市售商品丙烯酰胺在使用前需经重结晶纯化。取19.0克丙烯酰胺和1.0克甲叉双丙烯酰胺溶于水，定容至100ml，装在棕色瓶内，置冰箱保存; 2(0.89mol/L Tris-0.89mol/L硼酸-0.025mol/L EDTA缓冲液(PH8.3):取108.0克Tris，55.0克硼酸和9.3克EDTA(EATA?Na?2HO)溶于水，定容至1000ml，PH值为8.3。作为电22 泳缓冲液使用时应稀释10倍; 3(四甲基乙二胺(TEMED):可经重蒸馏加以纯化，收集121,124?馏分。纯品为无色透明的液体。通常商品不需纯化即可直接使用; 4(10%过硫酸铵(W/V);5(0.2%溴酚蓝溶液(W/V);6. 2%亚甲蓝-1mol/L 乙酸溶液;7. 40%蔗糖溶液(W/V)。 器材:玻璃管(内径6毫米，长90毫米)或平板凝胶模(100?120?0.15毫米);垂直柱型或垂直板型电泳槽;直流稳压电源(0,600伏，0,100毫安);细滴管;培养皿;微量注射器(50微升);注射器(10ml);注射针头(5或6号)长度10厘米。 (三)操作方法 1(制胶:垂直管型或平板型凝胶的制胶方法基本相同。如制备15ml5%凝胶，可取3.75ml20%丙烯酰胺贮存液，1.50ml未稀释的缓冲液，10微升四甲基乙二胺和9.59ml蒸馏水，混匀，抽真空约20秒，以排除溶解在水中的空气。然后再加0.15ml10%过硫酸铵，迅速搅匀，用细滴管分加到6支预先用橡皮塞塘住底部的玻璃管内，注意不要有气泡。胶面距玻璃管顶部约1厘米，沿管壁在胶面上注入少量蒸馏水，使胶面平整。温度高时凝胶聚合快，但易使生成的凝胶不均匀;一般在25?进行比较合适。如聚合速度太快或太慢，可改变加速剂四甲基乙二胺的量，以使凝胶在10分钟内开始聚合，半小时聚合完毕为宜。聚合好后放置1,2小时即可使用。 2(预电泳:将凝胶管或平板凝胶放置电泳槽内，灌入电极缓冲液，上槽连接负极，下槽连接正极。电流约每管3毫安或平板20毫安，电泳1小时。在一般分析中，这一步可省略。 3(加样:核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳通常采用连续系统，没有浓缩阶段，因此核酸样品体积不能太大。将样品溶解在10%,15%蔗糖溶液中，加入少量0.2%溴酚蓝作电泳前沿指示剂。样品含盐分较多时必须透析除去，否则会影响电泳结果。每管加核酸样品10,60微克，体积10,30微升。 4(电泳:开始电泳时电流应小一些(1,2毫安/管)，以避免产热促使样品在溶液中扩散。待样品进入凝胶后可将电流增加至每管5毫安或平板30毫安。约电泳1,2小时，待溴酚蓝色带移至管的下端，即停止电泳。 5(染色:取出凝胶管，用带有长针头的注射器吸入适量蒸馏水，将针头插入凝胶与管壁之间，边旋转边推进注入水，使凝胶从玻璃管内滑出。取细针蘸少量墨汁插进凝胶溴酚蓝色带位置，以标示电泳前沿。然后将凝胶置于2%亚甲蓝的1mol/L乙酸溶液中染色1小时以上。如欲染色充分，可在亚甲蓝溶液中浸泡过夜。用1mol/L乙酸或水漂洗，直至背景完全清晰为止。如染料溶液中有未溶解的亚甲蓝存在，染料颗粒吸附在凝胶上不易洗脱除去，因此染料溶液应过滤后使用。平板凝胶可以按同样方法染色和漂洗。待凝胶漂洗清晰后可在630nm波长处扫描。 亚甲蓝染色的条带在浸泡过程中很易褪色。吡罗红(Pyronine)Y或G与核酸结合牢固，用它染色的条带能较长时间保存，其最低检测出的核酸量为0.01微克，略比亚甲蓝灵敏一些，吡罗红溶于乙酸-甲醇-水(1?1?8，体积比)，浓度为0.5%。将电泳后的凝胶在吡罗红溶液中浸泡16小时，然后用乙酸-甲醇-水(0.5?1?8.5，体积比)混合液脱色，直至背景清晰。 将凝胶浸泡在1微克/ml溴乙啶的0.04mol/L PH7.6 Tris-盐酸缓冲液内1小时，取出后在紫外灯下照射，RNA即与DNA一样呈现荧光。用溴乙啶染色可拍摄荧光照片;还可将荧光条切下以回收RNA样品。 6.保存:凝胶条可浸泡在1mol/L 乙酸内，置于带塞试管中保存。平板凝胶的两面分别用两张稍大的玻璃纸复盖，玻璃纸经水浸泡并滴上几滴甘油，平铺在玻璃板上，玻璃纸边缘用胶纸或胶布封住，固定在玻璃板上，待干燥后取下凝胶片，图谱可保持不变。 十二、聚丙烯酰胺凝胶水平式平板等电聚焦电泳 测定蛋白质等电点 (一)原理 有关两性电解质载体及聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳的原详见本实验教材五(一)本实验用水平式超薄型(0.5mm)电泳槽进行IEF-PAGE，具有试剂用量少，省时，易冷却，分辨率高，便于分析比较等优点，已成为生化研究中不可缺少的手段之一。 (二)主要仪器、材料和试剂 1(仪器及材料:稳流稳压电源，水冷式平板等电聚焦电泳槽，玻璃板(11.5?11.5?0.2cm)，大铁文具夹。塑料模具(厚0.5mm,中间开孔9.0?9.0cm),小剪刀,镊子,解剖刀,1ml注射器,可调式微量注射器,擦镜纸,滤纸,精密PH试纸,棕色试剂瓶,吸耳球,玻璃纸,坐标纸. 2.试剂配置: (1)单体贮液:丙稀酰胺29.1g,甲叉双丙稀酰胺0.9g,定容到100ml,过滤备用(棕色瓶中4?可保存两周); (2)电极液:阳极(1mol/l 磷酸):原磷酸试剂的浓度约为16mol/l, 故配置时用重蒸水稀释16倍即可; 阴极(1mol/l 氢氧化钠):称取4g固体溶于100ml重蒸水中; (3)10%过硫酸铵:称0.1g AP,加重蒸水1ml,当天配置; (4)已知等电点PI的蛋白质样品; (5)无盐的待测已纯化的蛋白质样品; (6)固定液(3.5%磺基水杨酸-10%三氯乙酸-35%甲醇): 称取3.5g磺基水杨酸,10ml(或10g)三氯乙酸,35ml甲醇,加重蒸水至100ml; (7)染色液(0.1%考马斯亮蓝R250-10%乙酸-35%甲醇): 称取0.1g考马斯亮蓝R250,10ml冰乙酸,35ml甲醇, 加重蒸水至100ml,过滤后置棕色瓶保存; (8)脱色液(25%乙醇溶液-10%乙酸):取无水乙醇50ml.冰乙酸20ml,加重蒸水至200ml; (9)保存液(25%乙醇溶液-10%乙酸-5%甘油): 取25ml无水乙醇,10%ml冰乙酸,5ml甘油,加重蒸水至100ml. TEMED;40%两性电解质载体(PH3.0-10.0);液体石蜡;硅油. (三)操作步骤 1.凝胶配置:单体贮液2.0ml,重蒸水5.3ml,载体两性电介质0.6ml,真空抽气15min后加TEMED(原液)8μl和10%过硫酸铵60μl,混匀立即灌胶. 2.灌胶 (1)安装凝胶模具 ?取3mm洗净凉干的玻璃板,涂上一层薄薄的防水硅油,以重蒸水冲洗,使硅油分布均匀; ?调节平板电泳槽至水平,电泳槽上放上一张滤纸; ?滤纸上放一厚2mm的玻璃板,玻璃板上面放上塑料模具(图20a); ?用文具夹将模具和玻璃板固定在平板电泳槽上; ?在模板上面,文具夹的另外一端再放上涂有硅油的玻璃板。 (2)灌胶:小心迅速的将混匀的胶灌到模具的框内。灌胶时胶液沿着上面有硅油的玻璃板的一端即文具夹的另一端，向文具夹推进，边灌胶边推上面的玻璃板，使模具框内充满胶液，框内不能有气泡，为赶走气泡可移动玻璃板，待气泡释放后再向前推，一直推到接触文具夹，使两块玻璃把胶封在框内，模具框内充满胶液，切不可有气泡，否则要重新制胶和灌胶(图20b) (3)去掉上面的玻璃板和模具，灌胶后室温静止1h，在模具和胶的边缘可观察到折光(表明胶已凝固)，再老化0.5h,然后小心将两块玻璃打开,凝胶和模具会自然地贴附在其中一块玻璃板上,去掉上面的模具及凝胶板周围的和渗出边缘的残胶,即可作加样准备。 3.加样 (1)加样前准备 ?在电泳槽上涂一层液体石蜡，在铺一张方格坐标纸(电样时作定位用)。用一塑料片刮去电泳槽与坐标纸之间的气泡，并使坐标纸浸透石蜡; ?将带胶的玻璃板放至涂有石蜡的坐标纸上面，赶走气泡; ?接通冷凝水，再调一次水平; ?铺电极条:将1cm宽、9cm长的3层滤纸条浸透电极液(阳极用磷酸1mol/l，阴极用氢氧化钠1mol/l)后，放在另一张滤纸上吸干面上的电极液，用镊子将电极条铺在凝胶两端，轻压电极，使电极条和胶贴紧，一定要平直，多余部分剪去，胶面上的残液用滤纸吸净(图20d ) 图20 聚丙烯酰胺凝胶平板电泳操作示意图 (2)加样 ?取8层擦镜纸重叠在一起，剪成约5?5mm小块，浸透样品，放在离电极1cm以外的胶面上。PI6以下样品位于正极附近，帖紧。根据玻璃板下坐标纸所显示的格子，自由选择待测样品和标准样品放置的位置; ?压好电极板，盖好盖子，接通冷凝水，再调一次水平(图 )。 4(电泳:开始恒压60V，15min后，恒流8mA，电泳时电压不断上升，直至电压升为550V时,关电源,开盖去掉加样纸,以免纸上残留的样品在染色时干扰结果的判断,调节电源,恒压580V,继续电泳,至电流降为零(2,3hr),电泳结束,关闭电源. 5.PH梯度的检测:从胶板上顺电场方向切下一条胶条,并切成0.5cm等距离的小块,顺序放入小试管内,加入0.5ml重蒸水,浸泡10min.用PH试纸或微电极测定PH值,或以表面微电极直接测定PH梯度,并绘制PH-cm图谱,也可用已知PI蛋白样品所在位置的距离与PI值绘图. 6.固定染色:将凝胶取下(取时,先用固定液淋洗一下,使胶滑润,防止破裂,用固定液冲胶入培养皿,或将胶面向下用小钢铲将胶铲下掉入培养皿),放入固定液中固定4hr;去掉固定液,用脱色液漂洗一次;将染色液倒入培养皿内,染色30min. 7.脱色、保存:倒去染色液，加脱色液浸泡至基本无底色;将胶板放在浸泡过保存液的二层玻璃纸之间，赶走气泡，下面垫块玻璃板，室温下自然干燥。 十三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的异常现象、可能原因及对策 (一)凝胶未聚合 1. 单体纯度不够，需重新结晶; 2.凝胶溶液中，有溶解氧，抑制了凝胶聚合，应使用有效的抽气泵; 3.过硫酸铵实效或量不够，应新鲜配制或改换其他批号的过硫酸铵或增加溶液。 (二)水层时凝胶已聚合 1.加催化剂之前，冷却凝胶溶液，让聚合速度减慢; 2.减少TEMED或过硫酸胺用量; 3.加快操作。 (三)沿指示剂向相反方向移动 电源连接的正、负极错置或缓冲液选择错误。 (四)“微笑”(“smiles”)现象即指示剂前沿呈现两边向上的曲线形 凝胶冷却不均匀，中间部分冷却不好，致使凝胶中的分子有不同的迁移率。 (五)“皱眉”(“frowns”)现象即指示剂前沿呈现两边向下的曲线形 常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。 (六)电泳时间比正常要长 凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的PH选择错误，及缓冲系统的PH和被分离物质的等电点差别太小或缓冲系统的离子强度太高。 (七)电泳以后未能检测出样品 1.加样量太少。增加样品量; 2.染色液性质或浓度、染色时间不够。更换染色液或增加浓度和染色时间; 3.加样时样品浮出。增加样品溶液比重，小心操作; 4.分离胶浓度太高，样品未进入凝胶。适当改变凝胶浓度; 5.分离胶浓度太低，样品已电泳出分离胶。适当改变凝胶浓度和电泳条件; 6.若样品是RNA，可能其内含有蛋白质，形成的巨大复合物将凝胶孔径阻塞。彻底去除RNA样品的蛋白质; 7.样品中含有水解该样品的酶，在电泳过程中，样品降解。彻底纯化样品。 (八)样品分离区带宽或“拖尾(tailling)”现象 1.检查电泳缓冲液组成是否合适、样品溶液的离子强度是否太高、缓冲液的PH值是否合适; 2减少加样量或降低样品浓度或进行去离子化处理。 (九)分离区带呈条纹状 可能原因是:凝胶聚合作用不完全;样品未完全溶解;样品过量或产生沉淀;加样缓冲液不新鲜;凝胶溶液聚合后，凝胶中有微小气泡存在。 解决办法是:应使用新鲜的过硫酸铵溶液，并彻底的除气;样品须彻底溶解;灌注凝胶溶液和插入加样梳时，应小心操作，避免小气泡混入;使用新鲜的缓冲液。 (十)只显一条区带 没有指示染料前沿和样品分离区带之别。其原因是:电极缓冲液变质或由于重复使用次数太多，PH发生变化。需要配制新的电极缓冲液。 参考文献 1.何忠效，张树政主编，电泳，北京:科学出版社，1990。 2.郭尧君主编，电泳，北京:科学出版社，1999。 3.赵永芳主编，生物化学技术原理及其应用，武汉:武汉大学出版社，1994。 4.李建武，萧能庚，余瑞元等编，生物化学原理和方法，北京:北京大学出版社，1997。 5.李如亮主编，生物化学实验，武汉:武汉大学出版社，1998。 6.郭勇编，现代生化技术，广州:华南理工大学出版社，1995。 7.王重广，李云兰，李德昌等编，北京:北京大学出版社，1994。 8.张丰德，樊廷玉主编，现代生物学技术，天津:南开大学出版社，1994。 9.孙志贤主编，现代生物化学理论与研究技术，北京:军事医学科学出版社，1995。