精子染色质扩散实验检测精子dna 碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系

精子染色质扩散实验检测精子dna 碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系 精子染色质扩散实验检测精子DNA 碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系 精子染色质扩散实验检测精子DNA 碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系_论文_临床医学论文_医药学论文 作者:曹晓敏苏园园何茜冬郑轶群林仲秋【摘要】目的:探讨精液DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系。方法:收集分析70例不育不孕患者共88个IUI治疗周期，精子染色质扩散(SD)实验分析精子DNA碎片，… 作者:曹晓敏 苏园园 何茜冬 郑轶群 林仲秋 【摘要】 目的:探讨精液DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系。方法:收集分析70例不育不孕患者共88个IUI治疗周期，精子染色质扩散(SD) 实验分析精子DNA 碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，并按妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组，各组间精子DNA碎片比值、精子核成熟度和IUI妊娠率的关系。结果:非妊娠组SD小光晕和无光晕精子(精子DNA碎片) 比值平均为(28.3?10.6) % , 非妊娠组高于对照组(12. 0 ?5. 9)%( P 0. 05);而大光晕和中光晕精子比值非妊娠组低于对照组(P 0. 05) ; 非妊娠组组苯胺蓝染色阳性率高于对照组。结论:非妊娠组患者核成熟度异常的精子、精子DNA碎片比例增高。 【关键词】 复发性流产; 精子; DNA损伤 宫腔内人工授精(intrauterine inseinatin, IUI)是将洗涤过的精子悬液导管直接注入子宫腔内，使精卵自然妊娠生育目的的辅助生育技术，其适用人群。IUI的因素诸多，尚无定论。大主要在女方年龄、不孕的年限、授精时机及次数、用药、局部盆腔结构、子宫内膜厚度、输卵管壶腹部的直径、输卵管伞端距宫角的距离、精子质量与IUI妊娠率的关系[1,3]。关于精子质量与IUI妊娠率的通常是在常规精液分析上。其的信息评估精子的质量。在预测妊娠结局的价值有限。本课题拟对精子DNA完整性、精子核成熟度的检测来分析精子质量与IUI妊娠率的关系[4]，本对2008年8月,2011年12月来我院生殖中心行IUI治疗的70例男方精液分析，精子染色质扩散(SD) 实验分析精子DNA 碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，探讨上述指标与IUI妊娠率的关系。 1 资料与方法 1.1 资料 2008年8月,2011年12月来我院生殖中心行IUI治疗患者70例共88个周期，治疗前需证实女方有一条输卵管通畅及无排卵功能障碍，并排除盆腔炎症和女性生殖内分泌异常等潜在的不孕因素的。将88个IUI周期妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组。 1.2 主要试剂与仪器 ISAS精子分析系统(西班牙);NIKN E 1000 荧光显微镜(日本);NIKN E 200 普通光学显微镜(日本)。主要试剂:低熔点琼脂、琼脂、二硫苏糖醇(DTT)、联咪二苯吲哚(DAPI)，均购自美国 Siga 公司。 1.3 标本采集 受检者应禁欲3,7d，用手淫或体外排精法收集精子，标明采集的，置37?平板上液化后检测。 1.4 SD 实验 文献[5，6]，精液标本:精液标本用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)调至10×106/l 1000 rp10in， 弃精浆， 精子沉渣用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)调至1×106,10×106/l，取0.3l 好的精液与0.7 l 1%低熔点琼脂凝胶混匀，37? 孵育;吸取50ul 上述精子混合液滴在0.65 % 熔点琼脂预过的载玻片上，盖上22×22 盖玻片4?放置5in。精子变性及裂解:小心去除盖玻片，室温(22?左右)将标本载玻片浸入0.08 l/l 的盐酸(HL)内变性7in;然后浸入精子裂解液内(pH 7.3)20in;再移入缓冲液中3in，脱水。将标本载玻片依次放入70%、90%和100%的乙醇中脱水。所有操 作过程均要求载玻片(标本)状态。空气自然干燥后加入4′，6 二脒基吲哚(DAPI)染色，荧光显微镜下观察结果。 1.5 精子核蛋白组型检测 精液液化并记数，洗涤精子密度至40×106/l，取精液1l，1000g离心3in，去上清液，重复3次，去除精浆加入1l粘合液，取5ul涂片，空气干燥，加固定液固定90s，冲洗玻片，脱色、封片。镜检:涂片经苯胺蓝染色后，显微镜下高含赖氨酸的精子核呈蓝色，颜色分布均匀，在精子核后半着色较深，顶体蓝色较浅，大精子不显色，显蓝色的为阳性，不显色的为阴性，每个标本计数200个精子。 2 统计学 数据输入计算机SPSS(12.0 版)软件，经t 检验统计。P 0.05 有统计学差异。 3 结果 3.1 DNA完整性检测结果 SD实验普通光学显微镜图片见图1。计数500个精子，观察精子光晕大小。光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕4 个等级，大和中光晕示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片。小光晕以精子头直径?1/4为判断标准;中光晕精子头直径 1/4，而精子头直径?2/3;大光晕精子头直径 2/3。精子SD实验显示大、中、小光晕和无光晕精子的比例，见表1。非妊娠组患者SD小光晕和无光晕精子比值平均为28.3 ?10.6%，对照组(12. 0 ?5.9) %，两组差异有统计学意义(P 0. 05)。大光晕和中光晕精子比值在IUI妊娠组和对照组分别为(72. 6 ?5. 3)%和(60.7?12.5)%，两组差异有统计学意义(P 0. 05)。A为妊娠组:1,2为大光晕的精子，A3,5为中光晕的精子B为非妊娠组:1,2为小光晕的精子，B3,5为无光晕的精子图1 SD实验检测两组精子DNA碎片结果表1 两组SD大、中、小光晕和无光晕精子的比例 3.2 精子核蛋白组型检测 对两组70例标本苯胺蓝染色，非妊娠组苯胺蓝染色阳性率高于对照组，两组差异统计学意义(P 0. 05)，见表2。表2 两组苯胺兰染色阳性率平均值 4 关于女方因素对IUI妊娠率的并共识。而精子质量与IUI妊娠率的通常是在常规精液分析上。常规精液分析为精液质量了信息,然而信息完全评估男性的生育能力，临床上约有15%的男性不育患者精液常规检查是的，常规的精液分析对评价精子的质量缺陷和不之处，对预测妊娠结局的价值有限。需要寻找新的、敏感的评估精液质量的指标，分析IUI失败的原因，以便帮助临床医生诊断和制定治疗方案，是当前急需解决的问题。本课题对两实验组患者精子DNA碎片和精子核成熟度的检测，非妊娠组患者精子DNA碎片比例增高。精子DNA损伤常常是多个因素作用的结果,但其确切机制现在还不清楚,有如下3种:?凋亡;?异常氧化应激;?精子染色质组装缺陷。在精子过程中,情况下,赖氨酸型组蛋白被鱼精蛋白替代,这是随后去凝缩作用精原细胞的必要条件。精子核成熟度直接精子的受精能力和受精后原核的及胚胎的发育[7]。精核蛋白分子中不含赖氨酸,而组蛋白和过渡蛋白中则有众多赖氨酸。本苯胺蓝可与富含赖氨酸的蛋白,呈蓝色,检测精子精子核的成熟度。非妊娠组苯胺蓝染色阳性率高于对照组，说明非妊娠组是精子核成熟度异常，精子核蛋白转换障，DNA不稳定及受损，妊娠失败。据此可以对就诊的不孕夫妇的筛查，使那些质量不佳IUI受孕机会较小的病例，直接求助疗效更为的辅助生殖技术，就可以不必要的IUI治疗对患者身体、精神和经济上的损害。对精子质量好于IUI治疗的患者，建议应 3,4 次 IUI 治疗周期，使用体外受精-胚胎移植(IVF ET)和单精子显微注射(ISI)等技术难度更大、费用更高、侵袭性强的辅助生殖技术。本对IVF前的常规精液分析结果但反复IVF失败的患者治疗方向和理论。关于精子核成熟异常与DNA受损与妊娠失败的机制、响因素及其治疗，还需详细的。 【参考文献】 1 卢伟英，刘西茹，等.718周期夫精宫腔人工授精临床因素分析.海南医学院 学报，2015,12(4):310,313. 2 茅琳，洪燕，等.夫精宫腔内人工授精临床妊娠率因素的分析. 泌尿外科学杂志,2008,22(8):20,24. 3 Esail Lzadeh S,Faraarzi .Endetrial thikenss and pregnany ut e after intrauterine inseinaten.Fertil Steril.2015,88:432,437. 4 Virr R,Larsn k KL,et al.Sper hratin struture assay paraeters arerelatedt fertilizatin, blastyst develpent,and nging pregnany in vitr fertilizatin and intraytplasi sper unjetin yles.Fertil Steril,2004,81(5):1289,1259. Fernández JL,uriel L,Gyanes V,et al.Siple deterinatin f huan sper DNA fragentatin ith an iprved sper hratin dispersin (SD) test.Fertil Steril,2015,84(4):833,842. 6 邱毅，张丽红，王苏梅，等.精子染色质 扩散实验检测男性不育患者精子DNA碎片.国际生殖健康/生育杂志,2008,11(6):387, 389. 7 赵向东，黄宇峰.精核蛋白的进展.男科学报，1998,4(1):38,40.