综述：肿瘤基因治疗的研究进展 - 文献综述

综述：肿瘤基因治疗的研究进展 - 文献综述 文献综述 肿瘤基因治疗的研究进展 李志新 邱晓彦 马大龙 在过去的十年里，随着细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，基因治疗，特别是肿瘤的基因治疗已成为备受瞩目的研究领域并已初步取得令人振奋成果，如针对肿瘤细胞、肿瘤的血管改变、肿瘤患者的免疫系统和骨髓变化的基因治疗等。尽管目前还没有哪一种肿瘤基因治疗方法的作用是比较理想的，但都显示出了良好的应用前景。 现已，肿瘤的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和凋亡失调的结果。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。 目前，肿瘤基因治疗的主要途径包括:抑癌基因治疗，癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因(自杀基因)治疗，多药耐药基因治疗，肿瘤血管基因治疗等。 一、 针对抑癌基因的基因治疗 抑癌基因(Tumor suppressor gene)，又称抗癌基因(Antioncogene)，根据其功能，该基因又可分为控制细胞增生的看门基因(Gatekeeper gene)和维持基因完整 ,, 1的看管基因(Caretaker gene)。1中列出了目前已发现的主要抑癌基因和抑癌候选基因。 研究表明，几乎一半的人类肿瘤均存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因的失活与肿瘤的生长有着密切的关系。因此，将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中， 以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的抑癌 ,,2。 基因治疗策略，必将成为肿瘤基因治疗中的一种重要的治疗模式 p53基因是1979年Lane和Grawford在SV40大T抗原基因转染的细胞中 [3]发现的，是目前研究最广泛和深入的抑癌基因。其正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变。迄今已发现的10000种人类肿瘤的2500种基因突变中，p53 ,,4-7蛋白的393个氨基酸就有280个以上发生了突变。由于这种点突变，直接的 后果是导致氨基酸的改变，最终产生没有活性的p53蛋白，失去抑癌作用。 鉴于人类恶性肿瘤p53基因突变率较高，以正常p53基因治疗肿瘤就自然成了研究的热点。大量的体内外试验已证实，引入p53基因确实可以抑制肿瘤细 ,,[9]10。如2002年Kunihisa等利用电穿孔的方法，把胞的生长，诱导其出现凋亡 野生型p53基因导入人类前列腺癌细胞PC-3中，发现肿瘤细胞形态改变，细胞生长速度降低，裸鼠致瘤性消失，进一步研究发现肿瘤抑制是因为其凋亡增加所 ,,15致。Lesson等从裸鼠尾静脉每隔10-12天注射脂质体与p53的复合物，用于治疗接种于裸鼠皮下的人恶性乳腺癌(含p53突变)，结果大多数p53治疗组的肿瘤消失(8/15)，而对照组只有1只消失(1/22);停止治疗后，8只已消失的肿瘤1 ,,16月后无一复发。此外，Ramesh等用脂质体作载体将p53导入肺的原位癌和 ,,8转移癌中，Hagivara等将载有野生型p53的腺病毒载体直接进行瘤体内注射均可使动物的生存期明显延长。此后，研究者又相继将p53基因导入肝癌、口腔 [11-15]癌、肺癌、头颈部肿瘤以及乳腺癌等肿瘤细胞，同样发现类似的结果。但对于不同的细胞类型，p53基因的抑制作用各不相同。 除了直接的抑瘤作用外，正常p53基因的导入还可以诱导癌细胞对化疗药 ,,,,17,1815物及放疗的敏感性，加快肿瘤细胞的凋亡。如Spitz等研究了腺病毒介导的p53基因与放射线对小鼠皮下异体移植SW260结直肠癌的作用，发现小鼠 3再生的肿瘤受到5Gy的放射治疗后需要15天才能长至1000mm(一般小鼠仅需2天)，如果再施以p53基因治疗，则需要37天，说明p53基因确可提高小鼠对 [19][20]放射线的敏感性。Roth等对于H1299(p53缺陷)肺癌、Nielsen等对于头颈部肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤的研究也得出了同样的结论。 在众多抑癌基因中，p16基因是另一个研究较多的抑癌基因。因其对细胞周期G1期有特异性调节作用，又称多肿瘤抑制基因1(Multiple tumor supperssor 1, MTS-1), INK4a(Inhibitor of cyclin dependent kinase (CDK)4)。正常情况下，P16与细胞周期素D(Cyclin D)竞争CDK4、CDK6，抑制它们的活性，使其一系列底物(如Rb)保持持续去磷酸化高活性，而不能解除pRb对转录因子E2F等的抑制，从而阻止细胞G1期进入S期，直接抑制细胞增殖。相反，当p16基因发生 异常改变时，细胞增殖失控导致其向癌变发展。 p16基因异常的主要表现是以基因缺失为主，在肿瘤中可达80,以上，基因异常的总发生率高于其它已知的抑癌基因，而且p16基因异常分布的瘤谱范围 [21]检测了28种肿瘤中p16的表达(包括食管癌、很广。如1994年Okamoto等 肝癌、结肠癌、胰腺癌等)，发现多种癌细胞缺失p16基因，表现为纯合性丢失或突变，用构建含有p16INK4 cDNA表达载体转染p16INK4基因缺失的肺癌细胞系Calu-6和卵巢癌细胞系SKOV-3，可有效地抑制癌细胞克隆的形成。1998 ,,22年Lee等用腺病毒介导p16基因导入肺癌细胞，也可抑制癌细胞的生长和克隆形成，造成细胞周期G1期阻滞。此外还有很多这方面类似结论的研究, 如 ,,,,2324Wu等对乳腺癌细胞(MCF-7)、Lee等对膀胱癌等等。 ,,25为了探讨p16与p21、p53之间的协同作用，有人将Ad-p16和Ad-p21分别和同时导入肺腺癌细胞系Anip973(高转移潜能)和AGZY83-a 中(低转移潜能)，发现虽然p16也能抑制癌细胞的生长，但统计学上无明显作用，然而当与 ,,26p21共同转染后的癌细胞抑制效果非常显著，克隆形成很少。Ghaneh等将Ad-p53与Ad-p16转染到5种前列腺癌细胞中，发现无论体内、体外，或在体、离体均发现，与单独治疗相比，两者联合可诱发大量的肿瘤细胞凋亡，肿瘤细胞生长严重受到抑制。除了与其他抑癌基因共同转染外，还有很多p16与其它基因 ,,27疗法合用的研究报道，如Wang等就设计了将p16与GM-CSF共同导入肿瘤细胞，效果也非常理想。 因此，p16作为一种新型的抑癌基因，有很多优点，如可特异地阻抑CDK4或CDK6，与恶性肿瘤的联系更加广泛，抑癌机理比较明确，较之间接作用的p53，p16基因对细胞周期有肯定的直接作用。而且p16基因相对分子量较小(只有444bp)，仅为p53的1/4, 易于基因治疗的操作。所以，其在肿瘤的研究领域以及基因治疗方面的作用倍受瞩目。 从表1中可以看出，除了p53, p16外，还有很多抑癌基因如p21, p27, Rb, BRCA等都具有抑制肿瘤细胞生长的作用，但这些基因或多或少均有一定局限 ,,28性，要么其抑制能力远弱于p53，要么抑瘤谱有限，如BRCA1仅仅是家族性 ,,29。因此，多种抑癌基因的临床应用尚处于研乳腺癌和卵巢癌的遗传易感基因 究阶段。 二、 针对癌基因的治疗 癌基因是指细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的一类基因。因此，这种基因在人的正常细胞中就已存在。在绝大部分情况下，这类潜在的癌基因处于不表达状态，或其表达水平不足以引起细胞的恶性转化，或野生型蛋白的表达不具有恶性转化作用。但是当这些基因改变时，就会导致基因异常活化而启动细胞生长，从而发生恶性转化。如Ras、Myc、Src等基因，由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传导途径，促使细胞异常生长。因此将癌基因反义序列导入癌细胞使之封闭，或引入rev等方法阻止癌细胞的生长是抑制肿瘤的另一种方式。(表2为目前常见的癌基 ,,30因)如Wei等用反义Myc(片段构建)重组腺病毒载体Ad-As-Myc，发现能显著抑制肺腺癌GLC-82和SPC-A-1细胞生长和克隆形成，并诱导其凋亡。RT-PCR和Western印迹显示MYC基因表达下降，凋亡相关基因Bcl-2和Bax分别出现下调和上调。瘤内注射Ad-As-Myc可抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长(抑瘤率为52,)。对肝癌细胞BEL-7402、HCC-9204、QSG-7701和SMMC-7721、胃癌细胞MGC-803、SGC-823均有抑制作用，表明反义Myc具有广谱的抗肿瘤作用。 ,,31Jae等以逆转录病毒为载体将反义的K-Ras导入胃癌细胞YCC-1(高表达野生型K-Ras)和YCC-2(K-Ras 12位突变)中，发现K-Ras基因的表达显著降低，其癌细胞生长明显受抑，其抑制率近50,。体内实验也证明，未转染反义K-Ras的裸鼠在20天后肿瘤迅速增大，而转染反义K-Ras的肿瘤未见长大。Takeuchi,,32等将含有具有抑制K-Ras功能的突变体N116Y基因腺病毒(AdCEA-N1116Y)导入胰腺癌细胞(PCI-35，PCI-43)，然后再感染裸鼠，发现无论是N116Y的表达，还是肿瘤受抑，抑或凋亡等变化，与对照组(人胚胎胰细胞1C3D3)相比均有显著 ,,33,34性差异。Watanabe等对膀胱癌的研究也发现了类似的结果。此外，针对癌基因的核酶(Ribozyme, RZ)技术研究也甚多，主要因为RZ能够序列特异性地抑 ,,35设制靶mRNA，区别正常的癌基因和突变型癌基因。如2000年Tokunaga等计了针对突变型K-Ras癌基因锤头状RZ，观察了其对结肠癌细胞SW480的治疗作用，发现K-RasRZ可特异且有效地切割突变 的K-Ras mRNA，但对野生型的mRNA无作用;体内外均能显著抑制肿瘤的生 ,,,,3637长。Tsuchida及Kijima等对人类胰腺癌的研究也得出了相同的结论，并证 ,,38明这种抑制是凋亡所致。而Funato等证明K-RasRZ除了抑制肿瘤的生长外，还能增强肿瘤对化疗药物如cisplatin, adriamycin, 5-fluorouracil, vincristine和 etoposide的敏感性。 用反义寡聚脱氧核苷酸(Antisense oligodeoxyribonucleotide, ASODN)阻断肿 ,,,,,,39,4044,4541瘤细胞癌基因表达的研究报道也很多。如Chen等把重组的反义c-myc腺病毒导入胃癌细胞(SGC7901)，发现无论在体内和体外均可显著抑制癌细胞的生长，抑制率高达44.1,和68.9,, 进一步研究证明这种抑制是通过诱 ,,42导癌细胞凋亡来实现的。Shen等将反义c-erbB-2通过脂质体导入卵巢癌细胞中，发现除了抑制癌细胞的增殖外(30,)，还可特异地降低c-erbB2蛋白的表达。 ,,43则把反义c-myc和反义c-erbB-2同时及分别导入卵巢癌细胞(COC1)，Fei等 也发现有类似的结果，反义c-myc组抑制率为64.5%,反义c-erbB-2组为61.9%，两者结合组则高达82.6%。 三、肿瘤免疫基因治疗 1,针对免疫应答细胞:常用的免疫细胞有两种:免疫效应细胞和树突状细胞。 (1)免疫效应细胞介导的基因治疗 将细胞因子导入抗肿瘤效应细胞中以增强抗肿瘤作用，并以免疫效应细胞为载体细胞将细胞因子基因携带至体内靶细胞，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能。常用的免疫效应细胞有TIL、CTL、LAK、Mφ、NK等，可供选择的目的基因有白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子等。在这些目的基因中，早期尤以IL-2的研究 ,,46最多。如Tam等根据NK细胞的杀伤活性及扩增能力等依赖于IL-2的特点，将IL-2基因转染至一株对多种肿瘤细胞具有杀伤作用的人NK细胞株NK-92(依赖外源IL-2)，构建了不再依赖外源的新型NK细胞株NK-92MI(高表达IL-2)及 NK-92CI(低表达IL-2)，发现NK-92MI及NK-92CI对肿瘤细胞株(K562、Raji等)的杀伤活性与NK-92相比无显著差异，也不影响正常的造血前体细胞的功能。 ,,47Basse等的研究证明IL-2激活的NK细胞可以选择性地聚集在某些实体瘤组织细胞中起到杀伤作用。 ,,48此外，还有Nishihara等用反转录病毒载体将IFN-,、IL-4、IL-6或TNF-,等基因分别转染至小鼠细胞株J774A.1，发现该细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显 ,,49增强。Mizuno等则将IFN-,基因转染至LAK细胞增强其杀肿瘤活性。Paul,,50等了CTL、NK、M,以及树突状细胞等免疫细胞基因治疗的临床研究。但由于多方面的不确定性，如细胞因子的双重作用(除具有治疗和抗御疾病的作用外，在某些情况下还可导致和加重某些疾病的发生发展)，其临床应用受到了一定的限制。 (2)树突状细胞介导的基因治疗 除了免疫效应细胞介导的细胞因子的基因治疗外, 现在研究最多的是通过 转基因疗法来增强机体免疫系统对肿瘤的识别，以消灭肿瘤。主要是对以树突状细胞(Dendritic cell, DC)为代表的抗原呈递细胞(APC)的研究。 DC细胞是人体最有效的APC，能致敏和激活静止T细胞和B细胞。T细胞直接或通过分泌细胞因子，B细胞通过分泌抗体，作用于靶细胞或病原体上，最终消灭靶细胞或病原体。最近几年，DC细胞作为肿瘤生物治疗和基因治疗的方案已获FDA批准并进入III期临床。该疗法比传统的LAK细胞疗法和CIK细胞疗法具有更特异及更强大的杀瘤活性，被誉为当前肿瘤生物治疗和基因治疗最有效的手段。比较成熟的制备DC细胞的方法是采用抗原基因、抗原和细胞因子来转染和修饰DC细胞。常用的有:?抗原肽刺激和各种抗原基因，如大肠癌-APC、CL3;宫颈癌-E7、E6; 前列腺癌-FTI-1、PSA等;?肿瘤提取物;?细胞因子。多项动物实验结果表明，转导肿瘤特异性抗原基因的DC细胞可使肿瘤组织减 ,,51小。如Wang等用小鼠肝癌总RNA转染的树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的研究发现，转染的DC其组织相容性分子(MHC-I、II)及共刺激分子(B7-1、B7-2)表达明显增高，刺激同基因型小鼠T细胞可使增殖能力增强，且还 ,,52能诱导Hepa1-6肝癌细胞特异性的CTL产生。Fan等构建的AFP-DC(AFP，Alpha fetoprorein, 甲胎蛋白，在原发性肝癌中呈高表达)瘤苗不仅能产生和分泌AFP，而且还能上调自身的B7分子和MHC分子，明显刺激T细胞增殖及提高CTL的杀伤作用。 DC细胞增强抗肿瘤免疫反应的另一机制是编码CD40配体的基因转录。CD40配体的表达可通过DC 已表达的CD40之间的相互作用自动激活，这可直 ，，84接刺激抗原特异性的CDT细胞而无需CDT细胞的介导。事实上，在小鼠黑 ,,,,5354色素瘤中，这种机制可引起肿瘤退化，生存期限延长。Kikuchi等研究发现，同时向肿瘤内注射表达有CD40的腺病毒载体和改造过的DC，可引发肿瘤特异性的免疫反应，抑制肿瘤生长，并增加肿瘤CD40配体的表达。因此，肿瘤细胞转基因CD40配体的表达可明显增强DC表达CD40，从而增强其抗肿瘤活性。 2,针对肿瘤细胞的免疫基因治疗 肿瘤之所以能逃脱机体的免疫系统，就是因为其本身的弱免疫原性，而且在抗原呈递过程中还存在多个环节的缺陷。据此，人们将细胞因子和免疫相关基因导入肿瘤细胞，制备各种瘤苗以增强机体的抗肿瘤免疫功能。 (1)增加肿瘤细胞表达细胞因子 ,,55用含IFN-γ的逆转录病毒进行膀胱癌切除后的免疫基2001年，Shiau等 因治疗，即增加肿瘤细胞在局部产生IFN-γ，以诱导淋巴细胞的反应而达到治 ,,56疗目的。Hull等比较了伴有IL-12和共刺激分子B7-1(AdmIL12/B7)两个载体表达的腺病毒和单纯伴有IL-12/B7(AdmIL-12)表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的RM-9鼠前列腺癌模型，发现在感染的RM-9鼠肿瘤细胞中AdmIL12/B7能介导IL-12分泌和增加B7-1在细胞表面的表达，明显减少肿瘤体 ,,57积和增加鼠的存活率。Lv等用腺病毒介导的IL-2基因及B7-1基因联合转染G422胶质母细胞瘤，结果发现肿瘤生长明显减慢，脑内接种的动物存活期明显延长，NK、LAK和CTL的杀伤活性增强，说明IL-2基因转移确实能使肿瘤细胞的致瘤原性下降。 ,,58除了IL-2外，还有很多对其它细胞因子的研究，如Yanashita等用电穿孔的方法介导IL-12基因对肝细胞癌的基因治疗，发现肿瘤受到抑制不仅局限于电穿孔处，对远端的肿瘤也有抑制作用;而且经过电穿孔处理的肿瘤，肺转移的 ,,59发生率很低，肿瘤内发现有大量的免疫功能细胞浸润。Saleh等用逆转录病 ,,60毒介导IFN-γ基因和Chen等用牛痘病毒载体联合导入IL-1和IL-12基因治疗胶质瘤，发现均可抑制肿瘤的发生。 (2)免疫相关基因导入肿瘤细胞 +肿瘤抗原需与MHC-I类分子结合，被CD8CTL识别，被APC摄取加工后 +与MHC-II类分子结合，再被CD4Th识别，方可激活肿瘤免疫。而MHC-I和MHC-II途径都需B7共刺激。肿瘤细胞低表达或不表达MHC-I或MHC-II及共 ,,61刺激分子，是其抗原呈递发生障碍，最终逃脱机体免疫的重要原因。如Chen,,62等将人类乳头状瘤病毒(HPV-16)的E7基因转染黑色素瘤细胞株K1735，以期通过E7基因的表达来增强肿瘤细胞的免疫原性，再将B7基因转染该细胞株 以增强肿瘤细胞所缺乏的共刺激信号，发现单纯转染了E7基因的肿瘤细胞在体内100,成瘤，而同时转染了E7和B7基因的肿瘤细胞在体内完全丧失了致瘤能力。进一步研究证明，通过B7-1基因转染的结肠癌在小鼠体内诱导产生了特异 ,,,,6364。Kikuchi等将共刺激分子CD40基因的重组腺病毒直接性杀伤细胞CTL 注入小鼠黑色素瘤、结肠癌及Lewis肺癌等实体瘤内，发现60,以上的小鼠黑色素瘤及结肠癌得以治愈，而免疫原性极弱的Lewis肺癌也有部分治愈。对MHC ,,65基因转染后肿瘤细胞致瘤性的研究也有类似的报道。 单独MHC或B7基因治疗对无免疫原性的肿瘤细胞作用极弱，若两者联合共同刺激或与其它基因联合治疗，则可激活CTL的肿瘤杀伤效应，且B7基因还 ,,,,6667能增强NK细胞的肿瘤杀伤活性。但也有相反的报道，如Martin等发现共同转染CD86(B7-2)和MHC II的反式作用子(CIITA，可激活MHC类分子)注入肺癌细胞中，与单独CIITA或CD86相比，无显著的抑制肿瘤生长作用。因此， ,,68鉴于这种现象，人们更热衷于B7或MHC基因联合其他基因治疗肿瘤。如 ,,69Zhang等用p53与B7重组痘苗病毒抗肿瘤的实验研究发现，rVV-B7与rvv-p53FL接种可部分加强rvv-p53FL的抗肿瘤治疗作用。 四、自杀基因治疗或酶药物前提疗法 所谓自杀基因(Suicide gene)，顾名思义就是可引起细胞死亡的基因;亦即将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有毒性的产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的，也称药物敏感基因(Drug sensitive gene)。 常用的自杀基因包括:单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Herpes simplex virus-thymidine kinase, HSV-tk)、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因(Varicella-zoster virus-thymidine, VZV-tk)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(E. coli-cytosine deaminase, CD)、细胞色素P-450基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Glunaine phosphoribosyl transfeRase, GPT)等。 ,,70HSK-tk基因是最有特点的自杀基因，它编码胸苷激酶，该酶可将核苷类 似物(NA)代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物而发挥抗肿瘤作用。病毒源性的tk基因与哺乳动物细胞内的TK基因在生化性质上有着很大的差异，细胞TK所催化的反应特异性较强，只能催化脱氧胸苷酸，而HSV-tk除有此功能外，还能催化抗病毒核苷类似物acyclovir(ACV), ganciclovir(GCV), bromovinydeoxyuridine(BDVdU), 这些前药不能在细胞TK的作用下磷酸化，因而其本身对细胞无毒或毒性很低。但HSV-tk基因导入细胞并表达后，生成特定的酶，这些酶将这些前药三磷酸化，转换成毒性产物，阻断核 ,,71等的实验研究发现，把腺病毒介导的酸代谢途径，导致细胞死亡。Hall HSV-TK/GCV注射到有前列腺癌的小鼠体内，可明显抑制前列腺癌的生长，并 ,,72能使癌的肺转移率降低约40,。Shalev等对治疗失败或发生转移的前列腺癌患者用此方法进行治疗，也取得了较好的临床效果。 对另一自杀基因即CD基因的研究也很广泛。CD基因编码胞嘧啶脱氨酶，可将胞嘧啶代谢为尿嘧啶，使无毒的5-FC转化为有毒的5-FU。该基因只在真菌、细菌中存在，而哺乳动物中不含此种酶。在用于tk、CD基因疗法的前药中，GCV(tk基因疗法常用的前药)对转基因瘤细胞杀伤作用是较强的。 自杀基因疗法出现，克服了病毒介导的基因疗法的最大缺陷:即其转导的基因不能进入所有的肿瘤细胞。通过自杀基因的旁观者效应(Bystand effect)，自杀 ,,73基因转导细胞可对邻近非转导细胞产生细胞毒作用。现已证明:几乎所有的 ,,74自杀基因系统都具有旁观者效应，但其作用机制尚不十分清楚。Mesnil等总结了细胞间通讯(缝隙连接，gap junction)在旁观者效应中的作用，发现无论是in vivo还是in vitro，缝隙连接的表达高低与潜在的旁杀伤作用之间具有直接的相关性，特别是在使用HSV-tk/GCV作为为自杀基因系统的情况下更是如此。因此，增加gap junction的表达量，或转导gap junction基因，或使用可增加gap junction功能的代谢化合物(如视黄醛或cAMP)均可提高自杀基因疗法的旁杀伤作用。 但研究中发现，in vivo使用自杀基因治疗肿瘤并无太大的优势。这是因为自杀基因并非都能精确地进入肿瘤细胞，正常细胞也可能感染自杀基因，或屈服于 ,,75。为此，人们又进行了多方研究并取旁观者效应，导致其死亡或产生副反应 得了较好的结果:(1)用病毒载体导入的方法解决了导入基因只局限于肿瘤细胞的问题。即利用肿瘤特异性调控元件去调节自杀基因的表达，这些特定的转录调控元件在正常细胞中不存在。因此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异调控序列可被激活，表达目的基 ,,76因，从而达到靶向基因治疗的目的，而正常细胞无损伤。如Nagy等通过家兔实验，用逆转录的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因作为自杀基因来治疗卵巢 ,,77癌，可引起该肿瘤的退化。Suzuki等将PSA(Prostate-specifi antigen)启动子/增强子先用ARF(Partial androgen receptor)处理激活(目的提高PSA的活性)，然后构建ARF-PP-HSV-TK/GCV系统，发现其能有效抑制前列腺癌细胞的生长。 ,,78Uchida等则将PSMA(Prostate-specific membrane antigen)启动子/增强子与CD基因构建，配给药物前体5-FC后，自杀基因系统对前列腺癌细胞的靶向性明显提高。(2)有选择地使用自杀基因系统，减低Bystand effect对正常细胞的影响。研究发现，虽然大多自杀基因系统均有旁观者效应，但是这种旁观者效应的 ,,79大小与实验中所用模型显著相关。Block等研究发现，将腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因导入机体后，其导入载体主要分布在肿瘤细胞中，对周围正常组织无明显影响。但用腺病毒介导的胸苷激酶基因转染，则对周围正常组织有一定的 ,,80损伤。还有Black等利用随机序列诱发HSV-TK产生突变(目的是显著地增 ,,81加转导细胞对acyclovir和ganciclovir的敏感性)，其中的一种突变HSV-TK30已经被应用于不同的人类肿瘤细胞。 不同的基因疗法有不同的侧重点，即使是同一自杀基因疗法，其不同的酶,前药系统也各有特点。如HSV-tk/GCV直接杀瘤效果最好，CD/5-FC的旁观者效 ,,82应则较突出，利用其互补性联合使用，可达到最佳的杀瘤效果。如Rogulski等发现，双自杀基因(CD-HSV-tk)治疗对较大的肿瘤组织杀瘤效果最佳，尤其是体 3积大于2cm的肿瘤，可使肿瘤组织减少99,，显著降低肿瘤的压迫效应，缓解 ,,83症状。Adachi等把CD和UPRT(Uracil phosphoribosyltransfeRase, 尿嘧啶转磷酸核糖基酶，哺乳动物细胞无此酶)导入脑肿瘤中，发现由腺病毒UPRT基因诱 导的9L细胞对5-FU的敏感性是亲代细胞的16倍，而CD+UPRT联合基因则可达6000倍，表明了CD，UPRT诱导物比单纯UPRT诱导物更能提高9L细胞对 ,,845-FC的敏感性。此外，还有不同的基因疗法联合应用的报道，如Drozdzik等分别观察了单独用HSV-TK或IL-2及两者联合应用来治疗肝细胞癌(HCC，结果表明单独用HSV-TK或IL-2都只有一定程度的抑瘤效果，而联合应用HSV-TK+IL-2则可显著地抑制肿瘤生长，明显提高动物生存率(接受治疗的动物中有25,的肿瘤消失且超过100天复发)，说明自杀基因与免疫因子联合应用具有较大的优越性。 五、耐药基因治疗 多药耐药(Mulitiple Drug Resistance，MDR)是指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物产生耐药的同时，也对其它结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。MDR是影响肿瘤化疗疗效的重要因素之一。因此，如何消除MDR的影响，提高化疗药的药效就成了人们研究的热点。而耐药基因治疗就是针对此产生的，其定义是将一些细胞毒药物的基因转移至造血干细胞, 以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可能用高剂量的药物杀死肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。 常用的耐药基因包括:MDR-1(Multidrug resistance 1)gene, DHFR(Dihydrofolate reductase)的变异体，MGMT(O6-methylguanine-DNA methyltransferase) gene。 人类基因组中含有两个MDR基因，即MDR1和MDR2，二者有高度的同源性，但是MDR2不参与MDR的产生过程。MDR1基因组编码1280个氨基酸多肽(P-glycoprotein, P-gp，p糖蛋白)。现已证明，P-gp与耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein , MRP)密切相关。P-gp是一跨膜整合糖蛋白，属于ATP(ATP-binding cassette)家族成员，也是一种能量(ATP)依赖的多种药物排出泵。P-gp与ATP结合后，利用ATP水解产生的能量进行跨膜转运，对疏水性抗肿瘤药(如actinomycin D, the anthraxcylines, epipodophyllotoxins, taxans 以及the vinca alkaloids等)有较强的外排作用。当P-gp与抗肿瘤药物结合后，通过ATP提供的 能量，将药物从细胞内泵出细胞外，导致细胞内药物浓度不断下降，其细胞毒作 ,,85。而在非P-gp介导的肿瘤耐药细胞用因而减弱甚至丧失，最终出现耐药现象 ,,,,8687中，则多因MRP基因的过度表达所导致。Wang等利用逆转录病毒载体高效介导抗MDR1核酶的基因进入有MDR1基因表达的肿瘤细胞中，发现转导的肿瘤细胞(Daudi淋巴瘤细胞，Daudi/MDR20)完全逆转了对长春新碱的敏感性，阻断了MDR1 mRNA和P-gp的表达。临床上应用MDR1基因转移主要集中在骨髓干细胞。早期的病例显示，低水平的MDR1标记细胞(0.01-0.1,)在多次应用paclitaxel或doxorubicin后并无明显扩增迹象，但通过使用纤维粘连片段CH-296 ,,88则可明显增强基因转移的功效。 DHFR是一种参与细胞内物质形成的胞浆酶，这些物质包括thymidylate, purines等等。抗叶酸化疗药(如methotrexate, MTX; trimetrexate, TMTX)可与DHFR结合，干扰DNA的合成，从而阻止细胞的生长。因DHFG的变异体表现 ,,89有对叶酸相似物低亲和力的特性，所以常被用于基因转移实验。Spencer等研究了造血干细胞被移植表达有L22R和L22Y人类DHFG突变的基因后，发现均可明显防止MTX和TMTX引起的血细胞减少。对DHFG变异体再次突变可 ,,,,9091使其抗叶酸亲和力下降10000倍(对二氢叶酸的催化活性不变)。Allay等证实变异的DHFG具有诱发小鼠干细胞增殖反应的潜能，抗叶酸治疗与核苷转移抑制因子(NBMPK-P)同时应用，可明显增加接受二次移植患者载体表达细胞的存活率。 6Oalkylguanine-DNA alkyltransfeRase protein(AGT)可以把烷基从鸟嘌呤的 6residues O部位去除，防止烷基化合物对细胞起毒性作用，它是由MGMT基因编码。脱毒化作用是一种化学计量反应，每一个AGT分子把一个烷基转移到它的半胱氨酸的活性部位，使蛋白失去活性(反应不可逆)。AGT的突变型具有抵抗 6BG(O-benzylguanine，一种合成的AGT抑制因子)灭活的作用，这样当使用BG ,,92和烷基化物联合治疗时，仍可对细胞提供保护。某些抵抗BG的MGMT突变 ,,,,9394型基因如G156A和P140K，常被用于在体干细胞的选择。受体在经过初次移植治疗后，骨髓和外周血细胞可100,恢复;但当二次移植后，干细胞的水 平则发生了改变。非骨髓切除的小鼠在接受有限数量的可使在BG和BCNU治 ,,95。因疗中受到保护的转导细胞后，转基因阳性的细胞竟产生了1000倍的扩增此，突变型MGMT对干细胞的强大选择性这一证据为临床上应用G156A MGMT基因转移提供了理论依据。 多药联合应用的化疗方法促进了能够携带对造血干细胞提供保护的多种耐药基因载体的构建。DHFR-CD的双突变以及MGMT-apurinic endonuclease的融 ,,,,9697合均可产生对抗叶酸和胞嘧啶核苷类似物(烷基化物质)的抵抗力。现已发明了多种抗药载体，如MDR-1-DHFR, MDR1-MGMT, DHFR-CD等。最近Takebe,,98等构建了一种双基因载体，包含醛脱氢酶-1和双突变DHFR两种基因，当环磷酰胺和氨甲喋呤联合用药或单独用药时，均可对小鼠的造血祖细胞和人类 +CD34细胞提供保护作用。 六、抗血管生成基因治疗 肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它所提供的氧气和营养物质，没有 ,,399血管的生成，肿瘤最大也只能长至1-2mm。因此，早在1971年，Folkman等就提出可通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长，防止肿瘤的转移。因为在肿瘤的转移过程中，肿瘤血管的生成是必需的。这就使人们对与新血管生成和肿瘤血管成熟有关的前血管生成因子进行了大量的研究。 VEGF是肿瘤诱导血管生成过程中一个主要的调节因子，它可选择性刺激内皮细胞分裂，并能增加微血管的通透性。通过阻断VEGF的翻译和转录过程可使它的产生受到抑制。一种治疗方法就是引入一段反义VEGF的cDNA基因，通过与VEGF的mRNA结合，来抑制VEGF蛋白的翻译。有人曾作过这样的研究，对异体移植神经胶质瘤的裸鼠模型U-87MG给予腺病毒(包含有反义 ,,100VEGFcDNA基因)进行治疗，结果发现肿瘤的生长受到明显抑制。Saleh165 ,,,,101102等的实验也得出同样的结论。此外Davidoff等对患有神经母细胞瘤SCID小鼠皮下注射逆转录病毒介导的flk-1基因后的研究发现，肿瘤组织的体积与对照组相比平均减少33,，证明VEGF受体flk-1的表达具有抗血管生成的作用。 ,,103用野生型p53基因复制P53基因可参与VEGF的表达调控。Bouvet等 缺陷型载体Ad5/CMV/p53转染p53基因突变型的人结肠癌细胞株KM12L4和 ,,104SW620后，发现他们的VEGF mRNA表达明显下降。An等通过对46例结直肠癌的新鲜癌组织进行p53、K-Ras基因突变率和VEGF表达率的检测，发现p53基因突变的29例中有20例VEGF表达阳性(占68.9,)，K-Ras基因突变率的20例中有14例VEGF表达阳性(占70.0,)，p53基因突变和K-Ras基因突变与VEGF表达呈明显的正相关性，提示野生型p53可通过抑制肿瘤血管形成因 ,,105子的表达而起到抗肿瘤血管形成的作用。有人还发现，野生型p53基因治疗肿瘤具有旁观者效应，虽然只有不到5,的肿瘤细胞转染了野生型p53基因，但肿瘤组织血管数目却减少了60,。 除了VEGF外，还有两个前期临床中最常用的内皮细胞生长抑制因子: ,,106angiostatin和endostain。Sauter等研究了腺病毒介导的endostain基因对裸鼠异体移植Lewis肺癌的作用，发现Lewis肺癌减小了78,，而且用endostain载体进行治疗可防止肿瘤在肺内的微小转移。 两种抗血管生成因子同时使用或抗血管生成因子与其它疗法联合应用也是 ,,107研究热点。如Griscelli等的实验发现，向神经胶质瘤瘤体内直接注射腺病毒编码angiostatin样的分子，对异体移植的肿瘤生长并没有明显的抑制作用;但是当与放射线联合应用时，肿瘤的生长受到明显抑制，与单独使用其中任何一种方法相比，联合疗法能使小鼠的存活时间明显延长。Browder也得出了同样的结论,,,,108109。Scappaticci等把两种不同的抗血管生成因子基因angiostatin和endostain基因通过逆转录病毒转导入白血病细胞中，然后再注射给小鼠，结果发现约40,小鼠未发生肿瘤。 抗血管生成基因疗法不同于常规疗法及其它基因疗法，它具有很多优点如 ,,110高效低毒，不易产生耐药性，不受肿瘤细胞周期的影响等。因此，在肿瘤和其它血管性疾病的治疗中将有良好的应用前景。 七、问题与展望 基因治疗作为一种崭新的治疗手段，为攻克癌症带来了希望，从理论上说应该效果是很理想，但在实际应用中，还有很多问题有待解决。如(1)外源基因的表达效率问题。虽然在外源基因上游克隆了强有力的启动子和增强子，导致在细胞体外培养时，转入的外源基因得到很高的表达，但将细胞移植到体内后，外源基因的表达显著下降，有些基因表达甚至下降了1500余倍。其中具体的机理尚不清楚;(2)外源基因表达调控问题。目前试验性基因治疗都是以外源基因持续表达进行治疗的，但由于精确的基因调控机制所知甚少，因此治疗基因还不能做到按需开关;(3)在处理多系统基因紊乱过程中基因治疗的作用远未阐明;(4)基因治疗另一个潜在的风险是反转录病毒载体是随机地将外源基因插入宿主基因组，如果插入不当可能会破坏另一个基因表达或激活其它基因;另外在实验操作时有可能将辅助病毒污染重组病毒，造成病毒在宿主体内大量扩增。虽然基因治疗在临床上对部分肿瘤显示出较好的抗癌、抑癌作用，但是所使用的均是寿命较短的细胞，病人需要重复输入外源基因的细胞，致使医疗费用过高，难以普及，且其长期疗效和不良作用尚不清楚。因此，选择适宜的靶细胞以使基因治疗效果得以长期维持，一劳永逸地解决肿瘤治疗问题是基因治疗的发展方向。 在后基因组时代各种肿瘤基因治疗都有各自的策略。如日本对治疗胃癌及美国对乳腺癌均提出了各自治疗方案等。目前基因治疗重点有以下几个方面:(1)联合基因治疗(2)增强肿瘤的免疫反应(3)修复细胞周期中因肿瘤抑制基因丧失或癌基因激活而造成的细胞DNA损伤(4)自杀基因治疗，基因标记研究与在基因治疗中对正常组织的保护措施等。在这些热点研究中，联合基因治疗及自杀基因与其它疗法联合应用为重中之重，因为这不但符合肿瘤发生发展的规律，而且也弥补了单基因、单一疗法应用的不足。因此认识到肿瘤发生的复杂性及机体在此过程中千变万化的状态，选择适合的治疗方式，从多方面入手，达到几种治疗方式的相辅相成，或建立治疗的个体化方案，才能使目前的基因治疗具有突破性的发展，基因治疗才能真正用于临床，造福于肿瘤患者。