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褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的变化-

2017-10-21 9页 doc 30KB 6阅读

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褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的变化-褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的变化- 褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖 的变化* 郭 灵?,林 丹,曾庆堂,邓祥发,崔卫刚,韦 力,磨洁琳,蓝 玲 【摘要】 目的 观察褪黑素替代对去松果体成年大鼠记忆及侧脑室室管膜下区(SVZ)神 经干细胞增殖的。 将30只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、去 松果体及褪黑素替代治疗3组,每组大鼠10只。在建立动物模型2天后开始用 μg/kg体重)或5%乙醇-生理盐水进行干预,每天在固定时间...
褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的变化-
褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的变化- 褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖 的变化* 郭 灵?,林 丹,曾庆堂,邓祥发,崔卫刚,韦 力,磨洁琳,蓝 玲 【摘要】 目的 观察褪黑素替代对去松果体成年大鼠记忆及侧脑室室管膜下区(SVZ)神 经干细胞增殖的。 将30只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、去 松果体及褪黑素替代治疗3组,每组大鼠10只。在建立动物模型2天后开始用 μg/kg体重)或5%乙醇-生理盐水进行干预,每天在固定时间给予褪黑素(200 每只大鼠腹腔注射1次,连续给药21天。各组均于术后第16天开始用Morris 水迷宫连续5天测定大鼠的学习记忆能力,用免疫组织化学方法观察SVZ的增 殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞变化。结果 去松果体组大鼠在Morris水迷宫 游泳的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比明显延长或减少(P, 0.01)。去松果体大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数也明显下降(P,0.01)。褪 黑素替代治疗后可明显逆转上述指标的变化,并使其接近假手术组大鼠的水平 (P,0.01)。假手术组与褪黑素替代治疗组间的指标差异无显著性(P, 0.05)。结论 本首次观察到,去松果体使体内褪黑素减少,可导致学习记忆功 能及SVZ神经干细胞增殖能力出现相似的明显下降趋势,褪黑素替代治疗后可 使上述指标出现相似的明显升高趋势并接近正常水平。说明褪黑素是确保学习 记忆及神经发生得以正常进行的重要激素之一;提示褪黑素可能通过作用于局 部神经干细胞以及星形胶质细胞上的相应受体的机制来促进神经干细胞增殖, 使SVZ-吻侧迁移途径-嗅球的神经发生链在结构和功能上得到不断更新,进而 提高学习记忆能力。 【关键词】 松果体; 褪黑素;替代治疗;学习记忆; 室管膜下区;神经干细胞;增殖;大鼠 【Abstract】 Objective To investigate the effects of melatonin replacement therapy on the learning and memory as well as on the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone(SVZ) of the lateral ventricle in pinealectomized adult rats.Methods Thirty male Sprague-Dawely rats were randomly divided into three groups with ten rats per group: sham-operated,pinealectomized and melatonin-replacement therapy. After two days of operations,the rats in melatonin-replacement therapy group received daily peritoneal injection of melatonin( 200μg/kg body weight,dissolved in 5ml of 5% ethanol-NaCl solution)for twenty one consecutive days; while the rats in sham-operated and pinealectomized groups were daily given the equal volume of vehicle under the same conditions. After sixteen days of operations,the rat performences in Morris water maze were detected for five consecutive days. n the number of proliferating cell nuclear antigen immunoreactive (PCNA-IR) cell nuclei in the SVZ was counted.Results Navigation tests showed that the escape latency for finding the platform during training trials of pinealectomized rats was significantly longer than that of sham-operated or melatonin-replacement rats (P,0.01). Probe tests revealed that pinealeetomized rats had much worse knowledge of the platform’s prcise location than sham-operated or melatonin-replacement rats did (P,0.01). Similarly,the mumber of PCNA-IR cell nuclei in the SVZ of pinealectomized rats was significantly lower than that in sham-operated or melatonin-replacement rats (P,0.01). ,melatonin replacement therapy reversed the above parameters(P,0.01), nearly reached the levels of sham-operated rats(P,0.05).Conclusion The data for the first time demonstrate that pinealectomy reduces the and impairs the learming and memory level of endogenous melatonin, processes as well as the proliferation of neural stem cells in the SVZ,whereas exogenous melatonin replacement therapy can reverse these changes,indicating that melatonin plays an important role in maitaining the normal learning and memory processes as well as in augmenting the neurogenesis in SVZ; and that melatonin may promote the neurogenesis in SVZ via activation of melatonin receptors in both neural stem cells and astrocytes,thereby enhancing olfactary memory. 哺乳动物侧脑室室管膜下区(subventricular zone ,SVZ)是脑内终生存在神 经发生(neurogenesis)的一个主要部位,由此产生的神经干细胞通过有丝分 裂形成祖细胞(progenitor cell),后者迁移到嗅球,分化成新的中间神经元, 代替衰老或死亡的神经细胞,使局部神经环路的结构得到不断更新,从而发挥 正常的嗅觉及嗅觉记忆功能,1,。褪黑素是主要由松果体合成和分泌的一种神 经内分泌激素,已证实其不仅具有促进胚胎个体发育及体外培养神经干细胞增 殖的功能,2,3,,而且还可提高学习记忆能力,4,。然而,迄今仍匮乏有关 褪黑素对成年在体SVZ神经发生及学习记忆影响的报道。为此,笔者最近进行 了研究并初步观察到,松果体切除对成年大鼠SVZ神经发生及学习记忆均产生 类似的负性效应,5,。为进一步揭示褪黑素、神经干细胞及学习记忆三者之间 的内在联系,本研究通过观察褪黑素替代治疗对上述指标的影响模式,为阐明 学习记忆的神经内分泌机制提供新的资料。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 小 鼠抗人PCNA单克隆抗体为DAKO公司产品;生物素结合IgG、链霉菌抗生物素- 过氧化酶(SP)及二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒均为福州迈新公司产品;褪 黑素为Sigma公司产品。 1.2 动物与分组 选用清洁级健康雄性Sprague- Dawely大鼠30只,8,10周龄,体重150,180g,由广西医科大学实验动物中 心提供。将大鼠随机分为以下3组,每组10只:假手术、去松果体及褪黑素替 代治疗组。 1.3 动物模型的建立 参照袁群芳等的方法,4,,进行松果体切 除术,假手术除不切除松果体外,其余步骤与上述相同。所有动物在光暗周期 的环境中分组饲养,自由饮水、进食。 1.4 替代治疗方法 术后第2天开始进 行相应的干预,褪黑素替代治疗组的每只大鼠按200μg/kg 剂量将褪黑素溶于 0.5ml的5%(V/V)乙醇-生理盐水中,每天在固定时间(18:00 pm)腹腔注射 1次,连续给药21天。在相同条件下,每天给予假手术组和去松果体组的每只 大鼠腹腔注射0.5ml的5%乙醇-生理盐水,连续注射21天。 1.5 学习记忆能 力的测定 1.5.1 定位航行实验 于术后16天开始用Morris水迷宫(医学院药 物研究所研制,型号:DMS-2)测试,历时4.5天,每天分上、下午2个时段, 每只大鼠在每个时段测试4次,记录大鼠每次自入水直至找到并爬上平台所需的时间,即逃避潜伏期,如60s找不到平台即记录为60s,以此作为判断大鼠学习能力的指标。 1.5.2 空间探索实验 在测试的第5天下午撤走平台,将大鼠放入水中,通过电脑测试系统记录大鼠在2min内的游泳轨迹,出大鼠在原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比,以此作为判断大鼠记忆能力的指标。 1.6 组织切片制备 各组大鼠在完成测试学习记忆能力后,1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,经心脏灌注100ml 生理盐水,继之灌注500ml的4%多聚甲醛固定液(0.1mol/L PB液配制,pH 7.4,4?)。除去颅盖骨,将头部固定于脑立体定位仪上,参照大鼠脑立体定位图谱,6,,在前囟前1.6mm至前囟后4.8mm的范围内切取脑组织块,置于相同的固定液后固定3h(4?),转 蔗糖溶液(0.01mol/L PBS配制,pH 7.4,4?),待组织块下沉后行冠至30% 状连续冰冻切片,片厚40μm,隔3取1,收集于0.01mol/L PBS中,待反应。 1.7 免疫组化反应 采用SP法检测SVZ的增殖细胞核抗原(proliferating cell nucleus antigen,PCNA)的表达,主要步骤如下:切片入3%(V/V)H2O2溶液室温15min,消除内源性过氧化物酶的活性;入0.1%(V/V)Triton X-100溶液(0.01 mol/L PBS配,pH 7.4)室温孵育1h;正常羊血清室温封闭抗原20min;小鼠抗人PCNA单克隆抗体(1:100)室温孵育22h;生物素结合IgG室温孵育2h;SP室温孵育2h;0.05%DAB(含0.01%(V/V)H2O2)室温显色约30s。在上述过程中,完成每一步骤后均用0.01mol/L PBS(pH 7.4)漂洗15min,然后再进行下一步骤。常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照实验除用羊血清代一抗外,其余步骤与上述相同。 1.8 细胞计数 每只动物选取3张切片(前囟前0.8mm、1.0mm、1.2mm)作为观察对象,6,,光镜下(40×10)计数左侧侧脑室SVZ的背侧、外侧及内侧3个视野的PCNA阳性细胞数。 1.9 数据统计 采用SPSS 10.0统计软件中的单因素方差分析对原始数据进行统计处理,用最小差异显著性检验(LST)及Games-Howell检验对数据进行两两比较,以双侧α=0.05作为显著性检验水准,最后得出的数据以x?s表示。 2 结果 2.1 Morris水迷宫测试结果 各组大鼠的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比分别见表1及图1。 表1 大鼠在水迷宫训练的逃避潜伏期 (s,x?s) 注:分别与褪黑素替代治疗组和假手术组比较,*,0.01 P 从表1可见,除测试的第1时段外,去松果体组大鼠在其余测试时段的逃避潜伏期均比褪黑素替代治疗或假手术组大鼠明显延长,组间的差异有非常显著性(P,0.01),而褪黑素替代治疗组大鼠与假手术组大鼠的逃避潜伏期较为接近,组间差异无显著性(P,0.05)。在整个测试中,去松果体、褪黑素替代治疗及假手术组大鼠9个时段的平均逃避潜伏期分别为33.89、19.73及18.28s,其中去松果体组的平均逃避潜伏期分别比褪黑素替代治疗组和假手术组明显增加了71.8%和85.4%,组间差异有非常显著性(P,0.01),但褪黑素替代治疗组与假手术组之间差异仍然无显著性(P,0.05)。 注:与褪黑素替代治疗组和假手术组比较,*P,0.01图1 3组大鼠在原平台象限游泳距离的百分比 从图1可见,去松果体、褪黑素替代及假手术组大鼠在原平台象限游泳距离的百分比分别为18.7%、40.3%及45.8%;去松果体组大鼠分别比褪黑素替代治疗组和假手术组大鼠明显下降了53.6%和59.2%,组间差异有非常显著性(P,0.01),而褪黑素替代治疗组与假手术组大鼠之间差异无 显著性(P,0.05)。 2.2 PCNA阳性细胞的变化 SVZ的PCNA免疫反应产物定位于细胞核,呈棕黄色,阳性细胞核为圆形、椭圆形或梭形,各组大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核形态均无明显差异。此外,用羊血清替代—抗的反应结果也为阴性。对各组大鼠左侧侧脑室SVZ的PCNA阳性细胞核计数的结果见表2。 表2 大鼠侧脑室SVZ神经干细胞的增殖变化 注:与去松果体组比较,*P,0.01 由表2可见,去松果体组大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数分别比褪黑素替代治疗组及假手术组大鼠明显下降了37.1%和38.8%,组间差异有非常显著性(P,0.01),而褪黑素替代治疗组与假手术组之间则差异无显著性(P,0.05)。 3 讨论 神经干细胞是一种具有高度增殖能力的原始细胞,为了解这类细胞的增殖状态,常通过观察其细胞周期中的标志物变化来加以断判之。PCNA既是属于种系发生中高度保守的DNA多聚酶δ辅助蛋白,又是参加细胞DNA合成的一个不可或缺的蛋白因子,7,。PCNA定位于细胞核,在神经干细胞增殖的DNA合成期中表达,且其表达水平与DNA合成的活跃程度呈正比,8,,故PCNA是神经发生动力学的一个重要指标。由于PCNA具有以上特点,故本研究用其来观测神经干细胞的增殖变化。 既往研究表明,在体外培养的新生大鼠SVZ神经干细胞经表皮生长因子刺激后,再加入褪黑素可明显提高神经干细胞的增殖率,2,,而且褪黑素还可加速个体胚胎生长和发育的进程,3,,说明褪黑素对细胞发生及胚胎形成均产生明显的正性效应。由此可推测,褪黑素有可能对成年在体SVZ神经干细胞的增殖施加某种。为探讨这一,笔者最近做了相关研究,结果初步显示,通过切除松果体消除内源性褪黑素的主要来源,可明显降低成年大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数(P,0.01),5,;本研究结果则显示,褪黑素替代治疗可使因去松果体下降的PCNA阳性细胞核数明显升高到正常水平(P,0.01)。因此,以上结果与其他作者的基本一致,2,3,,也充分证实了笔者的推测,即褪黑素对成年在体SVZ神经干细胞具有促增殖作用,而且此作用呈现出对部位、细胞种类及发育阶段的非依赖性。其作用机制可能与两方面有关:(1)褪黑素直接作用于神经干细胞上的相应受体,3,,使PCNA表达上调,促进更多的细胞进入DNA合成期,为产生更多的子细胞提供了合成代谢的物质基础;(2)褪黑素作用于局部星形胶质细胞上的相应受体,9,,促进星形胶质细胞与神经干细胞相互作用并合成及释放多种细胞生长因子,后者可保护子细胞完成迁移抵达终点以及分化成局部中间神经元,10,,这对于完成使局部神经环路的结构得到不断更新转归和整合以及维持功能的可塑性均有重要的生物学意义。 袁群芳等报道,4,,松果体源性褪黑素具有提高大鼠在Morris水迷宫的记忆能力。笔者前期的研究,5,、本研究亦表明,去松果体可使大鼠在Morris水迷宫的学习记忆能力下降(P,0.01),褪黑素替代治疗则可提高去松果体大鼠的学习记忆能力(P,0.01),这与上述作者的相一致。此外,本实验结果还首次显示,在去松体或褪黑素替代治疗状态下,学习记忆的变化与PCNA阳性细胞核数的变化之间存在着惊人的相似之处,故两者的变化趋势呈现出平行关系。提示褪黑素很有可能通过前述的机制来提高SVZ的神经发生,使神经干细胞产生更多的祖细胞,经吻侧迁移途径(rostral migratory stream)源源不断地迁移到嗅球,最终分化成颗粒细胞和小球周细胞,从而提高嗅觉记忆功能,11,;也有可能通过促进基底前脑胆碱能系统的功能来提高学习记忆能力,4,。至于是否另有提高学习记忆能力的其他机制,有待于进一步研究澄清。 临床研究表明,嗅觉障碍是在老年性痴呆早期首发的主要症状之一,并随病程 进展而加重,12,。此外,老年性痴呆患者脑脊液的褪黑素水平显著下降,褪 黑素分泌的节律性也明显紊乱,13,。这些结果提示,在老年性痴呆的发病中, 有可能由于褪黑素的合成和分泌减退以及节律异常,导致SVZ神经干细胞的增 殖严重受损,使嗅球需要更新的局部中间神经元得不到及时补充,进而引发嗅 觉及嗅觉记忆功能障碍。因此,除了可用褪黑素调动原位SVZ神经干细胞来防 治老年性痴呆外,还可在用神经干细胞移植或基因治疗该病中宜添加褪黑素, 使得移植的神细干细胞能有效分裂、整合到靶组织,目的基因也能长期表达产 物,从而在该病的神经结构重建及功能恢复方面有可能获得意想不到的效果。 【】 1 Taupin P. 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