刺梨汁SOD及其同工酶活力测定和定位染色

刺梨汁SOD及其同工酶活力测定和定位染色 刺梨汁SOD及其同工酶活力测定和定位染 色 觑嘲嘲鸶海《辩糕童il罐?.?_lll. 刺巢汁SOD及其同工酶活力测定和定位染色 壅堂 (浙江省台州师专生化系临海31700)(三王刺梨开发研究所) 摘要用透析法击嘹Vc测定刺梨 汁SOD活力操作简便,结果真实可 靠.测得刺梨汁SOD活力为588 U/ml.CH(211一CH1CH2OH处理测 得CuZn—SOD38.4U/ml,o2处 理测得Mn—SOD活力为144U/ ml,KCN处理测得Mn一,Fe—SoD 活力为22.8U/ml.聚丙烯酰腔凝 腔电泳定住染色法刺梨汁具有 CuZn一,Mn一,Fe—SOD3种同 醇. 关键词.垦三堕,硅盎型塞 整焦塞束 盎桶-g 超氧化物歧化酶(EC11511,简 称s0D)能催化超氧化物阴离子自 由基(o2)的歧化作用成为分子氧 和过氧化氢.它在抗炎,抗癌,抗衰 老及卫生保健等方面都有广泛应 用.良种刺梨(Rosarozburghii)是 极好的水土保持丛生灌水,适宜于 红,黄,棕等土壤生长,可在海拔 l000Ill以上高山正常生长结果,栽 培第2年每公顷产量可达3750kg, 也是一种高时效性的脱贫致富树 种.其果实由于有很高的维生素C, 黄酮类和SOD含量,号静三王果 品.发表的有关刺梨果汁SOD活 收稿日期:2000—05—03 性测定方法,大多采用邻苯三酚自 氧化法,刺梨汁没有经透析处理. 我们在用此法测定良种刺梨汁SOD 活性时,发现剜梨汁中Vc与SOD 同样具有抑制邻苯三酚自氧化作 用,若不排除Vc的干扰,将显着增 高SOD测定结果.本文研究了不 同浓度Vc对邻苯三酚自氧化的影 响,周SOD分子量在30000, 50000,采用透析法排除Vc的干 扰,测定刺梨汁中SOD活力.SOD 由于其酶活性中心所舍金属不同, 主要有CuZn一,Mn一,Fe—SOD3 种类型同工酶,利用不同抑翩剂可 以分别测定刺梨汁SOD活力,并用 定位染色法加以验证. 1材料和方法 11试荆 2,6一二氯靛酚为Merck公司, 丙烯酰胺(Acr),N,N一甲叉双丙烯 酰胺(Bis),N.N.N?,N?一四甲基乙 二胺(TEMED)为Pluka公司,氯化 硝基四氮唑蓝(NBT)为Sigma公司 产品,其余为国产分析试剂. 12刺梨汁 7月20日采自浙江省临海市更 楼乡良种剌梨种植园(当地成熟期8 月15日左右),常规榨汁,4000rpm 离心取上清液. 1.3Vc含量测定 羹丁『f2 e葛幽4}.; 采用2,6,二氯靛酚滴定法. 1.4刺梨汁透析 取刺梨汁2ml装入透析袋(透 析袋型号DC800,截留分子量为 10000,120011,GB公司出品),于 412下用蒸馏水透析23h,每厢1-2 h换水一次,透析结束计算稀释率. 1.5S0D活力测定 采用改良的邻苯三酚自氧化 法,同一样品重复6妖.酶活力单 位定义:在lml反应液中,每分钟抑 制邻苯三酚自氧化速度达50%的酶 量定义为一个酶活力单位. 1.6不同抑制剂时不同类型SOD 活力的抑制 CHCI~一CH3CH2OH(体积比 0,15:0.25,存活CuZn—SO),HzO2 (5mmol几,存活Mn—SoD),KCN (5mmol几,存活Mn一,Fe—SOD) 分别与刺梨汁透析液处理1h后,测 SOD活力. 1,7定位染色 刺梨汁透析液经10000rpm冷 冻离心10min.取上清液加遮糖至 30%,分别点样在垂直板状凝歧的4 个齿中.浓缩胶浓度为3%,分离胶 浓度为10%,412下电泳.电泳毕, 纵切凝胶,分别在PBS(50mmol/L, pH78),CHCI3一CH3CH2OH(体积 比015:025,现配),o2(5 资源研究,1997,(2). 2张鼎华,林卿.混农林业与林业 的可持续发展.生态经济, 1997,(5). 3向成华.林农复合生态系统评 价指标体系探讨四川林业科 技1995,(5):30--34. 4孙述涛.林农复合系统分类及 命名.南京林业大学, 1995,19(4):75,79. 24 5李文华,赖世登.罗菊春,阎树文. 中国农林复合经营.科学出版 社,199410, ? FORESTSCIENCEANDTECHNoLoGY2000?9 曩?曩爱嚣每潮;獭pI9}麓蠢ll曩.0_1:I_曩I1;曩 mmol/L,现配)和KCN(5mmol/L, 现配)中浸摇1h,清水洗净,先黑暗 下在NBT(2.45mmol/L)中浸泡20 min,取出凝胶黑暗下放人含有28 mmol/LTEMED,0.028mmol/L 核黄素的36mmol/L,pH7.8PBS15 rain,最后将凝胶浸在含有0.1 mmol/LEDTA的50mmol/LpH 78PBS,并于4000lux荧光下显 色,SOD的活性谱带是出现在蓝色 背景上的无色透明区带. 2结果与讨论 2.1不同浓度Vc对邻苯本酚自氧 化速度的影响 用测定SOD活力相同方法考 察不同浓度Vc对邻苯三酚自氧化 率的影响,结果见表1.邻苯三酚和 Vc溶液所加的量均为10”I. 寰1不同浓度Vc对部苯 三酚自氲化连鹰的影响 组剐?25/抑制 mi?率(%) 邻苯三酚(标准自拣氧化速鞠)0750/ 邻苯三酚+0.1mg/mlVc0074507 邻苯三酚+02mg/mlvcO07ll52 邻苯三酚+lmg/mlVc0056225l 邻苯三酚+2rag/mlVc0032956l 邻苯三酚+3mg/mlvc0.007290.4 从表1看出,vc溶液在较高浓 度(1mg/ml以上)时对邻苯三酚即 具有明显的抑制作用,而刺梨汁Vc 浓度经测定为1O52mg/ml,对邻苯 三酚自氧化法测定S.D活力的干 扰十分显着,必须设法除去. 2.2刺梨汁Vc在透析过程中浓度 的变化 在多个透析袋中分别装人2m1 刺梨汁,开始时每隔1h换蒸馏永1 次,4h后每隔2h换永,透析不同时 间后测刺梨汁Vc浓度.结果见表2. 表2表明,刺梨汁在4”C下经23 h透析,Vc浓度从19.52mg/ml降 寰2科梨汁经不同时遗折Vc浓度变化 注:8月15日成熟时为20408mg/lOOg. 至0.103mg/m1.对邻苯酚自氧化抑 制率为07%左右,可以认为对SOD 活力测定干扰甚小.测得的S【)D活 力较为真实. 2.3刺梨汁S.D活力测定 分别测定刺梨原汁,23h透析 液及40C下2d透析储藏液对邻苯 三酚自氧化的影响,并换算为 “S0D”活力,结果见表3. 裹3不同处理辫寨汁对部 苯三酚自氧化的彤响 ?A325/mi~SOD活力(U/w*) *邻苯三酚自氧化速度:?25/vain =0.0750,8月15日成熟时为92U/ml. 从表3看出,刺梨原液由于含 有高浓度的Vc,测出的”SoD”活力 与真实值相比悬殊,而透析液在4? 下储藏2d后,SOD活力变化很小, 说明4?下经23h透析,刺梨汁 SOD活力损失很少,测出的活力真 实可靠. 2.4SOD同工酶活力剥定 用不同抑制剂处理刺梨汁透析 液,可测定各类型SOD活力,结果 见表4. 刺梨汁有CuZn一,Mn,Fe— SOD活力,但CuZnSOD活力相对 较高.陈淮杨等报道CuZn—S【)D 主要存在于真核细胞中,Fes()D 主要存在于原核细胞中,Mn—S()D 在原核和真核细胞上都存在.植物 细胞里S()D含量最多的是CuZn— S()D.实验结果与其报道一致. 2.5SoD同工酶的定位染色 用聚丙烯酰胺凝胶对刺梨汁透 析液进行电泳,用不同抑制剂处理, 染色后,SOD活性谱带为出现在蓝 色背景上的无色透明区带.对PBS 处理,CHCh—CH3CH2OH处理, H2处理和KCN处理的结果表 明,CHCh—CH3CH2OH处理的只有 Rf为0.21带保存,为CuZnS0D 谱带;H202处理只有Rf为012的 Mn—SOD谱带;KCN处理只有Rf 为012和052的Mn一,FeSoD 谱带,与后2实验相互印证,说明刺 梨汁具有CuZn一,Mn,Fe—SOD 3种同工酶. 3结论 1.刺梨汁因含高浓度Vc.对用 邻苯三酚自氧化法测定S()D活力 干扰很大.在低温条件下用透析法 去除Vc测定刺梨汁SOD活力操作 寰4刺梨汁SOD同工酶活力 *邻苯三酚自氧化速度:?A325/mn:0.0750(下转第32页) 25 FOF:tESTSCIENCEANDTECHNOLOGY2000?9 ll?_000-坩每8酶峨商鳓l两嘲曩i8i簿曩00_0Il: 济林的营造.耐干旱,抗风蚀,耐沙埋的乔灌木树 1.6.3技术思路种,如柽柳,沙拐枣,梭梭,沙枣和胡 干旱地区造林必须依赖灌杨等;行距2,3m,株距1.5m.沙 溉.采用常规地面灌溉造区果园须根据所栽果树类型进行选 林,要平整沙地,作畦或开择,一般行距4,10m,株距3,8 沟,修渠引水.由于远离m. 水源,造林成活率低.165模式成效评价滴灌造林, 1.64主要技术措施虽一次性投入较高(450,800元/ 图1直立式涉障在新月型沙丘迎风坡设置方洁示意(1)水源平衡根据667m),但具有节水(70%左右), 工材料的发展,这种抄障的应用会单井出水量(m/h)和水的不用平沙整地(可随沙丘起伏设置 越来越广.利用率,按成林时最热月份单位面毛管),排盐,防盐(湿润范围内的土 1.5.5模式成效评价以宁夏中积日耗水量(ii~lm/d)或单株日耗水体形成淡化空间),造林成活率高 卫抄坡头为例,各类机械沙障充分量(mm///~),设计灌溉量,灌溉周期(成活率可达85%,90%,较常规造 发挥了固,阻,输的作用,在有效保和轮灌区.林提高40%,50%),减少灌溉管理 障包兰线畅通中发挥重大作用.(2)首部主要由水泵,过用工(90%以上)等优点,一般1,2 1.5.6模式典型区及适宜推广区滤系统和施肥罐3部分组成.水泵a即可收回滴灌系统的全部投资. 沙障类型较为全面的典型区在扬程的选定,经管网系统的水力学166模式典型区及适宜推广区 宁夏中卫沙坡头.本模式适用于各计算后,能满足最不利的一条毛管配合滴灌技术营造的防沙阻沙 地带沙区,但在不同地方应用时应滴头所需的工作压力即可.井灌区林带的典型模式见于新疆南疆塔里 有所侧重.的过滤系统,一般经离心和筛网两木盆地塔中石油公路和南疆铁路库 16滴灌节水造林治沙模式级过滤即可.施肥罐可根据单井出车段;沙区滴灌果园的典型模式分 1.6.1模式概述以井灌为水源的水量和轮灌区面积,选择相应容量布于新疆和田地区的洛浦县,巴音 干旱区造林治抄,在应用滴灌节水规格的施肥罐.格椤蒙古自治州焉耆县,克孜勒苏 灌溉技术时.必须要对水源平衡,首(3)管网系统布局滴灌系统自治州阿图什市,吐鲁番地区吐鲁 部工程,管网系统的布局等进行专的管网,一般由主管,支管和毛管三番市.本模式可在干旱地区的流动 门的设计,根据造林治沙的目级管网构成,毛管垂直于支管,支管和半流动沙丘沙地以井灌为主的绿 的,选择相应的树种.垂直于主管.对于高大沙丘,毛管洲外围的造林治沙,营建果园以及 16.2模式适宜条件绿洲外围应按等高级设置.铁路,公路,输水干渠等的防沙阻沙 和沙区铁路,公路两侧流动沙丘的(4)树种选择和株行距防沙中广泛应用.(未完) 防沙阻沙林带,以及沙区井灌区经阻沙林带的营造一般多用耐高温,? „„„„„„(„„„„„„(„„„„„„„„„„„„„„(„„(„„„„„„„„„„(„„(„„„„„„„„„„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(„„ (上接第25页)色法进一步证明刺梨汁具有CuZn苯三酚自氧化法测定超氧化物歧 简便,结果真实可靠.测得刺梨汁一,Mn一,Fe—SOD3种同工酶,R化酶活性的方法生物化学与生物 中SOD活力为588U/ml.分别为0.21,0.12和0.52.物理进展,1991,18(2):163. 2.用不同抑制剂处理透析液,参考文献4罗广华,王爱国,付爱根.鉴别超 可测得不同类型SOD同工酶活力.1吕国安超氧化物歧化酶(SOD)氧化物歧化酶类型的定位染色 CHC13一CH3CH2OH处理测得研究概况.沈阳医药,1996,11生物化 学与生物物理进展, CuZnSOD活力384U/ml,H,岛处(2):201996,23(4):356,359. 理测得Mn—SOD活力为14.4U/2宁正祥.食品成分分析手册.北5陈淮阳,刘望夷从超氧化歧化 m1,KCN处理测得Mn一,Fe—SOD京:中国工业出版社,1998:306酶的分布和结构看其分子进化 活力为228U/ml.,308.生物化学与生物物理进展. 3聚丙烯酰胺凝胶电脉定位染3邓碧玉,哀勤生.李文杰.改良的连1996,23(5):408,412? 32 讯FORESTSCIENCEANDTECHNOLOGY2000?9