β-地中海贫血三重突变杂合体的基因型分析

p-地中海贫血三重突变杂合体的基因型分析 胡朝晖 刘元力 曾征宇 张晓璐朱庆义 ·I临床遗传学论著· 【摘要】 目的对1例罕见的p地中海贫血三重基因突变杂合子进行基因型分析。方法采用反向 点杂交和DNA测序法分析患者p珠蛋白基因型。结果反向点杂交结果显示，此病例p珠蛋白基因上有 转录子+40～+43、密码子41／42、IVS-2．6543种突变。基因克隆以及DNA测序分析证实患者一条染色体 上存在+40一+43(．AAAC)+c041／42(．咖)复合突变；其同源染色体上存在IVS-2—654(c—T)点突变。患 者基因型为[+40一十43(-AAAC)·c041／42(．1娜)]／IVS-2．654(C—T)。结论p地中海贫血[+40一+43 (．AAAC)·C1)41／42(．1'c'Tr)／r、I]突变基因型是我国一种新的地中海贫血突变类型。 【关键词】p地中海贫血； 突变；基因克隆；测序 ptII；出图啪liamajorcausedbyeompoulldheterozygosityfor4-40to4-43(·AAAC)，IVS-．2-654(CtoT)and eodon41／42(-a'crr)HUZhao-hu／，LIUYuan-li，ZENGZher蟹-yu，ZHANC,Xiao-lu，ZHUqing-yi． (c枷ng=houKingmMC砒erforClinicalI．a,boratory，Q坷，鹌洳u，C,uangdong，510330P．R．Ch／na．Erna／／：zhao— huitm@yahoo．tOm) 【Abstract】ObjectiveToreporttheanalysisofarareptha】as鳅11iaternaryheterozygote[+40tO+43(． AAAC)‘cD41／42(一11饥’)‘IVS-2-654]causingpt}la】asseIniamajorinaChinese．MethodsUsingPCIt-ASOprobe hybridizationanalysisto8calrl17knowntypesofbeta-thalassemiamutations，andgenecloningandDNAsequencingtoi- dentifytheunderlyingcausativemutation．ResultsReversedotblot(RDB)analysisshowedthatthepatient’st3-globin genehadthreemutationsto：+40tO4-43(-』恤～C)，c041／42(一唧)andIVS-2—654(CtOT)．p-globi．genecloning andsequencingprovedthat，thetwodeletionsof+40to+43(一从AC)andCD41／42(一咖)co-existedOnthes03ne chronllosome，andtheotherhomologouschromosomehadallIVS-2-654(CtoT)mutation．Sother．tuentisacompound heterozygoteof[+40tO+43(一舢诅c)·CD41／42(-咖)]／IVS-2—654(CtOT)leadingtot3-th,aassemlamajor．Con- dusion13aetriplemutationof[+40tO+43(一AAAC)·CD41／42(-l'crr)／rIi]isarlewgenotypeofbeta-thalassemia inChinese． 【KeyWOrdS】p血llas锹llia；mutation；genedone；l瑚lllellCe p地中海贫血(简称p地贫)，是一种常见的血液遗传病，由 于p珠蛋白基因突变导致p珠蛋白合成受抑制而引起的溶血 性贫血。由于世界范围内的移民不断发生，地中海贫血实际上 已分布在世界范围，目前全世界已发现的阻珠蛋白基因突变有 200多种，包括碱基置换，小的碱基缺失等，中国也发现有30多 种基因突变⋯，这些突变可造成p珠蛋白基因合成产物降低(B +地贫)或不能合成(酽地贫)而引起p地中海贫血。该病为常 染色体隐性遗传，且有高度异质性，p地贫纯合子患者需定期输 血维持生命，但是p地中海贫血的严重程度可由于合并弘地中 海贫血而有明显改善，p地贫纯合子复合∞地中海贫血时其可 不依赖输血。 我们采用聚合酶链反应(polyma艘chainreation，PCR)和反 向点杂交技术，对1例p地中海贫血患儿血样进行检测，发现 基因型为[+40，+43(．AAAC)·cD41／42(．rI℃．I，I')]／IVS-2—654(C —T)的特殊病例，如下。 1对象与方法 Ll对象患儿，女，广东海丰县澎湃纪念医院儿科临床诊断 作者单位．510330广州金域医学检验中心 为重型8地中海贫血，采取患儿静脉血2mL，EDTA抗凝。由于 患儿死亡，无法联系到家属未采取到家系其他成员血样。 1．2试剂和仪器DNA提取试剂盒(上海申能博彩)，LA砌 酶(El本TaKaRa公司产)，凝胶回收试剂盒(OMEC月,)，廿地贫基 因诊断PCR试剂盒(深圳亚能)，p地贫基因诊断反向斑点杂交 试剂盒(深圳益生堂生物企业有限公司)，r,CEM—T载体(Prom． 单)，PCR引物由上海英骏生物技术公司合成，基因扩增仪FI'C． 200型(MJResearch)。 1．3地贫基因突变检测提取患儿基因组DNA，n地贫基因诊 断采用四重PCR，同时检测中国人常见的3种缺失突变(．p”， ．一。2和．SEA)；13-地贫采用反向点杂交法检测基因突变型，p地贫 基因诊断采用PCR结合反向点杂交技术，检测中国人群8个常 见突变位点[TATAbox-29，TATAbox-28，CDl7，CD41-42，CD43。 CD26(HbE)，CD71／72，IVS2nt654]和9个“稀少”突变位点 (TATAbox-32，TATAbox-30，Cap+40一+43，IVSInt，CDl4-15， CD27／28，IVSl-1，IVSl-5，CD31)。经变性、杂交、显色后出现蓝 色斑点为阳性，具体操作方法见试剂盒说明。 1．4 B珠蛋白基因全序列扩增 根据CenBank基因库核苷酸 序列(基因号：NⅣ925006．1)，用Primerpremier5．0软件设计包 含转录启动子．100序列以及3个外显子在内的B珠蛋白基因序 万方数据 列，上游5’．AGAAACCATCTCGCCGTAAA-3’(865272—865291)；下 游5'-AGTGCCAGAAGAGCCAAC,GA-3’(867429—867448)。勾’增 用TaKalhLA死g酶。I：'CR反应体系总容积50止，每一反应体 系中含10×LA扩增缓冲液5皿，上下游引物各200nn帕l／L、250 nm／LdNTP$，DNA约200ng，2．5UTaKaRaLA‰酶。反 应条件为940c1min，65℃2rain，35个循环，最后72℃10rain。 1．5 PER扩增扩增产物用凝胶回收试剂盒回收目的片段一 纯化一连接到珊T载体，操作方法按试剂盒说明书。然后 参照分子克隆实验手册[2】，将连接产物转化进E．doiDH5a中， 37℃培养过夜。 1．6阳性克隆筛选鉴定挑取多个培养的单克隆，接种于含 50∥mLAmpLB培养液中，37℃震荡培养过夜。用v-gene质粒 快速提取试剂提取质粒DNA。以提取的质粒DNA为模板，用 前面的p珠蛋白全基因组引物PCR扩增筛选阳性克隆。 1．7地贫基因型分析将反向斑点杂交检出的阳性者克隆， 用p地贫反向点杂交试剂盒检测，分析该患者地贫基因型，随 后将杂交结果送上海英骏公司进行测序验证，序列比对采用 DNAMAN软件分析。 2结果 ·419· 2．1母，p地贫检测结果用四重PCR扩增法检测患儿a珠蛋 白基因，未检出．|～，．a4。2以及一SEA基因突变。p地贫基因诊断 发现患儿B珠蛋白基因扩增产物可与CD41／42和IVS-2．654正 常和突变探针杂交，以及与CAP突变位点杂交。明该患儿同 时存在CD41／42，IVS-2-654以及CAP3突变位点。 2．2口珠蛋白基因克隆杂交结果挑取6个阳性克隆，用反向 点杂交方法分析。筛选的阳性克隆中检出eapsite+cD41／42(． TCITI')突变型和IVS-2-654(pT)突变型两种基因型。 2．3基因测序结果eapaite+cD4l／42(．，I℃1’11)阳性克隆中检 出+40～43(．AAAC)复合密码子41／42(．7啊r)突变，IVS-2．654 (C—T)阳性克隆检出ⅣS-2．654(pT)突变(图1)，基因测序证 实患儿基因型为[+40—43(．AAAC)·CD4l／42(．TClT)]／Ⅳs-2． 654(C-*T)。 啪∞ft∞∞^1^^^^‘tc^c∞f^c^‘c“tcT^竹a州“^竹T∞"Ct0●【^c^^CtCT洲●n^∞^●0讨c■ACPCCAlGG'TGCAC：cTGAL'T(crG瞄雎^翦'c，雠靠l盯0优mT翻蔷蚴鲥“^CCT∞●t“^CTTC订I 婀 m 拼 aUI 凼 瑚 l 斟 搬 Sl 搿 辫 蛳 b'TG雎GCCCIGGG(AGGrrG‘'TATCAAGGTTMAAG雎AGGTlTAAGGAG．aCCAATAGAAACTGGGC,OTGTGGAGACAGAGAGGJICTCTTGCATTTClC^T^‘∞^CtC^CtCtCtclCCCT-TTGGTClATttTCCCACCCT'lrI雠CTGCTGGTGGIClACC 街 ■l 描，再 秘 埘 能 猫 憎 椭 t77 m‘‘僦【^‘‘叼7‘^“ccm‘∞‘"FTGIfICCACTCCT‘盯∞T‘m，‘懈^一c∞T^瑚T‘从澉K^T雠^^c^从H蛳Ⅺ‘ccTtT砖T‘盯‘戤Tc∞tc肺‘叭^慧clc从‘懈成CTTlGCzACACTGAG'rGA“lr(m 疋n{ SlIP m 懈 161 m _ ∽ 61'／ ∞I 懈 图l患儿+40一43(一AAAC)复合CD41／42(一TcrI．)突变测序图箭头示突变 3讨论 p地贫是广东省最常见的遗传性血液病之一，密码子41／ 42和IVS-2-654是中国人较常见突变⋯1，转录区+40一+43(． AaAC)突变，最早在中国人群中发现【3]3，但该突变携带率较低， 在中国人群中发现很少，容永忠等【4J对广州市区3662例产前 检查人群调查以及谭金荣等【5]对广东四会2531例成人和新生 儿调查均未检出该种突变，此突变为中国人群中罕见突变。本 篇报道的病例其p珠蛋白基因克隆和杂交结果以及测序结果 显示，密码子41／42以及cap+40一+43两个突变位点发生在 同一条染色体上，而在同源染色体上则存在IVS-2-654突变。 其中+40一+43(．Axac)和CD41／42(．唧r)组成的等位基因型 为首次报道并已在GenBank注册(GenBankaccessionNo． EI溯9)，首次证实中国人群中存在[+40一+43(-AAAC)· cD41／42(．Tcrr)／N]地贫基因型。但由于无法联系到患者家 属，未能进一步进行家系分析。 患儿为同时携带3种地贫突变型的p地贫纯合子，其中 CD41／42(．．I℃T1r)是一种移码突变，可导致合成无功能肽链，造 成p地中海贫血【63；+40一+43(．AAAC)突变是p珠蛋白基因 5’非翻译区缺失突变，可导致口+地中海贫血【7,81；IVS-2-654(C-" T)为由于该位点出现的碱基置换形成了一个新的裂解信号，影 响正常位点的剪接，产生异常mRNA，导致p+地贫【9]。一条染 色体上同时出现两个突变，在国内外发现的较少，具体发生机 制并不清楚，推测可能与基因发生的频率高低有关，李厚钧 等[10]在甘肃地区发现的[．28(A---G)·CDl7(A-+T)／N]基因型， 这两种基因型在当地的检出率高达28．2％和14．0％，本病例的 基因型CIMl／42(一TCIT)在广东地区的突变频率也高达 41．9％[1】1。根据国内外对此类突变类型的家系分析发现，一条 染色体上出现双重突变杂合子，另一条染色体正常时，此种突 变导致的结果仅相当于一个点突变，患者仅表现轻度贫血症 状，相当于单一的点突变杂合子【11，圳，但是当两条染色体上出 现三重突变时，可能会造成严重后果，Fedorov等Ⅲ』曾报道过l 例Ⅳs-I-l(G—C)纯合子复合-42(C-"G)导致重型p地中海贫血 的病例，Heath等【13]也报道了1例[Nt494+129T---C·NT494+ 132C----A](沉默突变)复合Ntl58C-,-T(F))突变结果导致中间型 地贫的家系分析报道。 万方数据 ·420· 主堡匿堂遣堡兰鲞查垫堡笙!旦箜垄鲞箜!塑墅!』型鲤：地垫堕：型：垄：坠：皇 患儿两条染色体上的p基因均存在致病突变，可导致p珠 蛋白链合成严重不足，这也可能是导致临床表现为重型地中海 贫血的原因。根据目前报道的类似病例的家系分析发现，这些 复合突变型均为在家系类遗传突变，并且符合孟德尔遗传规 律，推测患儿父母可能有一方基因型为[+40一+43(一AAAC)· CD41／42(一7I_cIT)／N]。值得注意的是，此3种突变在目前实验 室通过基因筛查皆可发现，因此加强地中海贫血产前诊断，对 防止或减少地贫儿出生是很有必要的。 参考文献 l IJ0llgGF，融删．eds．Hemoglobin＆Hemoglobinopathies．1sted． C“l／lgxi：SciencePress，2003．225-229，233-235．[龙桂芳，张俊武．血 红蛋白与血红蛋白病．第1版．广西：广西科学技术出版社，2003． 225．229，233-235．] 2 Sambro&J，FritschEF，ManiatiaT．Molecularcloning：alabora姗IIl∞． 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罕见的t(3；14)(q29；q11)一例 周敏马金元徐樨巍宋文琪 患儿女，2岁。因说话不清，走路不稳就诊。患儿系第l 胎，足月顺产，生后无窒息，出生身长56em，体重3550g。8个 月会坐，I岁会独站，I岁半学走步。出生时父亲年龄26岁，母 亲年龄24岁。父母非近亲婚配，表型正常。 查体：3岁半时身高为103cm，体重17k。头偏大，眼距 宽，鼻梁低，双耳廓大，双耳位偏低(图1)，腭弓高，心肺无异常。 细胞遗传学检查：外周血淋巴细胞培养，常规制片，G显 带。染色体核型为45，XX，t(3；14)(3衄一3q29：：14p11— 14q^er)，见图2。 讨论据文献报道的t(3；14)病例少见，且染色体的断裂 点均与本例不同。染色体畸变所引起的I临床效应多种多样，尤 以生长发育迟缓，智力低下多见，并常伴有五官、四肢、内脏等 多发畸形。本例患儿具有语言表达障碍，还伴有眼耳鼻的异常， 作者单位：100045北京儿童医院遗传室 临床细胞遗传学· 图1患儿面部图 图2患儿染色体核型图 箭头示异常染色体 据此，患儿的临床表现与染色体异常的相关性很大。 (收稿日期：2{X豫-Ol一14) (本文编辑刘萍) 万方数据