表皮干细胞、肝干细胞

null皮干细胞的研究进展2008年4月29日星期二9时5分21秒表皮干细胞的研究进展引 言引 言1. 人体最大的器官2.维持外貌 3.抵御微生物入侵4.紫外线辐射皮 肤null角蛋白角质化细胞颗粒细胞棘细胞基底细胞基膜真皮 外界迁移细胞干细胞分裂中的 干细胞核解体表皮层哺乳动物皮肤剖面图（示干细胞）(b)哺乳动物表皮增殖单位迁移细胞分裂中的干细胞(a)皮肤剖面1. 表皮干细胞的概念1. 表皮干细胞的概念表皮基底部具有不断增殖和分化能力的干细胞称为表皮干细胞 Epidermal stem cell, ESC 角质形成细胞干细胞 Keratinocyte stem cell, KSC 皮肤干细胞 Skin stem cel1null皮肤组织中的专能干细胞 成年组织干细胞 增殖分化为表皮中各种细胞成分 保持皮肤正常的表皮结构2. 表皮干细胞的来源2. 表皮干细胞的来源表皮干细胞胚胎干细胞间充质细胞已分化细胞毛囊处的干细胞造血或其他组织隆凸3. 表皮干细胞的分裂与分化 3. 表皮干细胞的分裂与分化分化方式 1. 对称分裂 2.不对称分裂干细胞TAC有丝分裂后细胞终末分化细胞4．表皮干细胞的分布4．表皮干细胞的分布 分 布初级表皮嵴表皮基底层胚胎期成人 没有毛发的部位:位于与真皮乳头顶部相连的基底层 有毛发的皮肤: 位于表皮脚处的基底层6. 表皮干细胞的典型特征6. 表皮干细胞的典型特征 2.自我更新能力1.慢周期性3.对皮肤基底膜的黏附7.表皮干细胞的标记物 7.表皮干细胞的标记物 表1 表皮细胞标记物 Table 1 markers of the epidermal cell角蛋白角蛋白角蛋白（keratins）是表皮细胞的结构蛋白，它们构成直径为10nm的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构。随着分化程度的不同，表皮细胞表达不同的角蛋白，因而角蛋白也可作为干细胞、定向祖细胞、分化细胞的鉴别手段。 表皮干细胞表达角蛋白19（keratin19,K19） 定向祖细胞表达角蛋白5和14(keratin5、keratin14,K5、K14)， 分化的终末细胞则表达角蛋白1和10（keratin1,keratin10,K1、K10） 毛囊角质形成细胞底角蛋白表达更为复杂，除上述地角蛋白以外，还有K6,K16,K17的表达。null角蛋白Keratin 黏附分子整合素α1β1、α2β1、α3β1、α6β4 :与层黏连蛋白结合 整合素α3β1 :与纤维黏连蛋白结合 整合素α2β1 :与胶原结合 表皮干细胞与基底膜的黏附作用是干细胞维持其特性的基本条件。表皮干细胞对基底膜的脱黏附是诱导干细胞脱离干细胞群，进入分化周期的重要调控机制之一 目前体外分离、纯化表皮干细胞也有利用干细胞对细胞外基质的黏附性来进行的 黏附分子 生长因子及其受体 生长因子及其受体 表皮发育过程中骨形态发生蛋白(BMPs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)及表皮生长因子(EGFs)均可刺激表皮来源的培养细胞的增殖 这些生长因子以自分泌或旁分泌方式行使调节功能。 重要的是生长因子FGFs和EGFs家族。 二、表皮干细胞的鉴别二、表皮干细胞的鉴别 利用表皮干细胞最显著的两个特征即慢周期性和自我更新能力来鉴别在体与离体干细胞是最基本且可靠的实验手段。 null表皮干细胞的慢周期性:可采用标记滞留细胞的方法识别在体的静息干细胞。 表皮干细胞的自我更新能力:在体外培养则表现为无限的增殖能力，形成细胞克隆。 用β1整合素的抗体来鉴别表皮干细胞:表皮干细胞表面高表达β1整合素，而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达β1整合素 . 角蛋白 8. 表皮干细胞的分化调控8. 表皮干细胞的分化调控内部遗传物质 外部环境 内源性因素： ①细胞的结构蛋白，特别是负责细胞不对称分裂的蛋白 ②控制基因表达的转录调节因子 ③干细胞与非干细胞系子代细胞的染色体修饰 ④设置短暂性扩增分裂的生物钟null微环境:表皮干细胞壁龛 stem cell niche 包括： ①邻近的各种细胞 ②细胞分泌的多种细胞因子 ③由膜蛋白介导的细胞间相互作用 ④整合素与细胞外基质。9．表皮干细胞的临床应用9．表皮干细胞的临床应用9.1 创伤修复 9.2 组织 9.3 基因治疗 9.4 整形美容9.1 创伤修复9.1 创伤修复在美国，每年有60万人要割取皮肤去治疗皮肤癌；还有1万-1.5 万人要进行皮肤移植以治疗严重的烧伤。 多年来人们一直试图通过刺激或诱导患者自身创面残存的上皮细胞来修复创面。表皮干细胞能主动地参与创面修复，促进创面再上皮化。 值得人们进一步深入研究的是，是否还存在由成熟的表皮细胞逆分化为表皮干细胞或表皮干细胞样细胞的机理 9.2 组织工程9.2 组织工程 将皮肤干细胞按组织工程的原理构建皮肤，已成为解决临床治疗中皮源缺乏的根本途径。 自体皮肤干细胞有望成为更可靠的种子细胞来源。 如果将来能像分离表皮干细胞那样分离出真皮干细胞，可为临床患者提供大量自体表皮或真皮细胞，构建全皮替代物，则不仅解决了皮肤移植中的免疫排斥问题，而且将开辟新的种子细胞来源途径。9.3 基因治疗9.3 基因治疗表皮干细胞的无限自我更新和多向分化潜能使其成为基因治疗首选的靶细胞 治疗方法： 1 导入标志性基因或一个异源基因 2 使细胞内原有基因过度表达 3 基因打靶 4 诱导某个基因的突变等 大疱性表皮松解症表皮细胞编码整合素亚基α3、β3的基因突变，导致整合素表达异常，引起表皮与真皮的连接障碍。大疱性表皮松解症null Mavilio 等把表达层黏连蛋白5β3 cDNA(LAM5-bata3)的逆转录病毒载体转移到LAMB3缺陷的JEB患者表皮干细胞内进行体外培养，然后将这些细胞移植到患者病变部位。 在随后的1年内观察发现，移植部位皮肤完好，没有水疱、感染、炎症反应及免疫排斥反应，并且移植部位新生的表皮更新是由基因转染的干细胞维持的，这一现象说明基因治疗已经取得巨大成功。 9.4 整形美容9.4 整形美容研究人员出“干细胞原位培植四维抗衰老美容整形手术”， 即将干细胞原位培植皮肤再生技术应用于皮肤衰老整形中，同时在衰老组织的三维改变中，加上时间因素，根据研究对象的具体特点及要求，临床上给予最大满足。 9. 表皮干细胞的应用前景9. 表皮干细胞的应用前景 ①异常组织结构中表皮干细胞的演变规律 ②从整体的角度出发，在异常组织或发生缺损的组织器官原位启动表皮干细胞的正调控机制 ③寻找更经济、更接近真皮基质的三维支架， 促进表皮层与真皮层的有效整合 ④朗格罕细胞、黑色素细胞在表皮层中的再现以及真皮的血管化null*美宝国际集团董事局主席、北京荣祥再生医学研究所主任医师徐荣祥教授 在一九九六年烧伤创面上找到皮肤器官原位再生的原始细胞“角蛋白十九型皮肤干细胞”，破解了人体皮肤器官原位再生之谜，成功实现人体其它器官原位利用普通组织再生，从而建立起人体组织器官再生医学，并获得美国专利。 徐荣祥于2002年发表“五年内复制人体206个组织器官、转变66种癌细胞系”的宣言，在科学界、医学界激起轩然大波。 null*徐荣祥教授在皮肤干细胞原位再生方面取得了原创性的重大突破。他们对被烧伤的皮肤进行适当处理后，成功地直接诱导上皮组织基底层的干细胞分化生成皮肤细胞，使受伤的皮肤得以迅速康复。该技术显示我国干细胞研究已率先进入组织和器官的原位干细胞修复和复制阶段，在国际上处于领先地位。 10. 展 望10. 展 望 相信，在不久的将来，随着相关技术的发展和成熟，人类有望在时空上精确调控表皮干细胞，从而更好地为自身的健康服务。肝干细胞肝干细胞肝干细胞的发现肝干细胞的发现1956年，Farber将肝内可能具有分化潜力的细胞描述为卵圆细胞 1958年Wilson和Leduc提出肝干细胞的概念。 近年来，人们发现肝干细胞移植对急慢性肝脏疾病有明确的治疗作用，使之成为消化领域的研究热点。肝干细胞的来源肝干细胞的来源分为肝源性肝脏干细胞和非肝源性肝脏干细胞 肝源性肝脏干细胞：包括卵圆细胞、分化的肝细胞、胚胎肝细胞和胆管上皮细胞 非肝源性肝脏干细胞：源于胚胎干细胞、骨髓造血干细胞、骨髓间充质干细胞及胰腺上皮干细胞等不同来源的肝脏干细胞源于胚胎干细胞的肝干细胞源于胚胎干细胞的肝干细胞Hamazaki等在体外成功地将小鼠ES细胞定向分化为成熟的肝细胞,该细胞能表达AFP、甲状腺转运蛋白、A2抗胰蛋白酶、白蛋白等肝细胞特征。 Hu则在直接观察到体外ES细胞向肝细胞转化的过程中，发现在培养液中体外ES细胞能转化为可分泌AFP、白蛋白（ALB）的肝细胞。 来源于骨髓干细胞的肝干细胞来源于骨髓干细胞的肝干细胞Lagasse等将骨髓组织细胞移植给致死量放射线照射鼠，发现在受鼠肝脏中发现骨髓造血干细胞来源的成熟肝细胞，提示造血干细胞可以转化为肝细胞。 Theise等将正常雄性小鼠骨髓移植到正常雌性小鼠体内，应用荧光原位杂交方法检查雌性小鼠肝脏细胞Y染色体，发现雌性小鼠肝脏的部分肝细胞表达Y染色体，提示骨髓干细胞在正常肝脏环境中能分化为肝细胞。 Petersen等将雄性大鼠骨髓干细胞移植到致死量放射性肝损伤且肝细胞增生被抑制的雌性大鼠模型体内，发现该模型大鼠的部分肝脏细胞表达Y染色体，提示骨髓干细胞不仅在正常肝脏环境能分化为肝细胞，而且在肝脏某些病理的环境中也能分化为肝细胞。 胰腺上皮干细胞胰腺上皮干细胞胰腺中存在着肝脏前体细胞。 Wang等用野生型E.colilacZ转基因小鼠胰腺细胞移植入同系酪氨酸代谢酶基因（FAH）突变的小鼠脾脏,在小鼠脾脏中能检测到FAH（+）的肝细胞团。 从胰腺分离的胰岛前体细胞在体外培养中可分化为肝上皮细胞，提示在胚胎发育过程中,一些原始的多能干细胞保持着未分化状态滞留在机体组织中。 胰腺肝脏细胞同源性的这一特征，为进一步的临床治疗提供了又一肝干细胞来源。 肝干细胞 的特征 肝干细胞 的特征 　 位于胆小管和Hering管部, 细胞体积较小, 呈圆形或椭圆形, 细胞质少, 核质比例大, 胞核呈卵圆形, 故其被称为卵圆细胞. 具有特殊的细胞标记：细胞表面高度表达OV-6、白蛋白、 细胞角质素 （CK）等,形态呈卵圆形。 卵圆细胞来自终末小胆管Hering管细胞,其数量与肝损伤的严重程度有关。在成年动物肝脏内肝卵圆细胞含量非常少,通常情况无法检测到。 肝干细胞的分离方法 肝干细胞的分离方法 目前分选、纯化肝干细胞的方法有密度梯度离心、流式细胞技术结合免疫荧光标记单克隆技术、免疫磁珠分选技术等。 密度梯度离心无需特殊仪器及抗体，操作过程简单，可减少复杂操作对细胞活性的损伤，采用protease E选择性破坏肝实质细胞，20μm滤膜滤过清除体积较大细胞，后经Percoll密度梯度离心获得高产量及活性率的肝干细胞。 参与肝干细胞增生和分化的因子参与肝干细胞增生和分化的因子包括干细胞因子及其受体c-kit系统 干扰素γ 肿瘤坏死因子α（TNF-α） 白细胞介素-6（IL-6） 表皮生长因子（EGF） 转化生长因子-β（TGF-β）、 肝细胞生长因子（HGF） 成纤维细胞生长因子（FGF）家族等。 HGF, EGF、FGP能促进骨髓干细胞的增生、分化 TGF-β能诱导骨髓干细胞的凋亡 而TNP-α、IL-6对骨髓干细胞的生长无明显影响。 目前很难确定促进和诱导肝干细胞分化及扩增的关键因素，这也是影响肝干细胞临床应用的一个难题。 细胞移植治疗急慢性肝脏疾病 细胞移植治疗急慢性肝脏疾病 肝干细胞的移植方法较多 常用方法包括：腹腔移植、脾移植、门静脉移植、肝动脉移植等。 目前，动物实验进行较广泛，各种途径的移植应用于急慢性肝病的治疗 而临床上主要以肝动脉方式移植最为常用。腹腔内移植 腹腔内移植 腹腔是干细胞移植最方便易行的治疗方法，但由于其有效的作用主要是通过肝脏受损伤时干细胞提供的细胞因子的作用，而并非腹腔内干细胞的增殖与分化的作用。且受腹腔内干细胞分化、增殖条件的限制，基本无临床应用前景。脾内移植 脾内移植 经脾脏进行胚胎干细胞移植治疗 Wilson’s病模型鼠，移植后第2、4周，在肝内可见胚胎干细胞来源的干细胞增殖。说明脾脏内移植的胚胎干细胞有分化为成熟肝细胞的能力。 采用人胎肝干细胞在小鼠腹腔及脾内移植，移植后观察结果证明了胎肝干细胞能在损伤肝脏中增殖并分化为肝细胞。 移植在脾脏的干细胞虽然能在短期内达到改善肝功能的目的，但由于其不能在脾脏内形成有效的肝小叶等排泌结构，其依赖于脾脏内干细胞的分化，长期效果主要是来源于由脾脏回流到肝脏的干细胞的分化增殖。 门静脉或肝内移植 门静脉或肝内移植 理论上肝脏本身是肝细胞移植的最佳器官，因为门脉内含高浓度的嗜肝细胞因子和局部生长因子。 Lagasse等将纯化正常小鼠的骨髓造血干细胞（HBSC）经静脉移植给有代谢性肝病（酪氨酸血症Ⅰ型）的小鼠，发现能逆转后者的肝功能、延长其寿命。 Akushida T等通过门静脉进行干细胞移植治疗Wilson’s病模型小鼠，移植后14天，肝内发现干细胞来源的肝细胞，而腹腔内移植则无此发现。 Fan TX等在此途径进行干细胞移植时也有类似发现，并发现干细胞可经肝脏种植于脾及骨髓中。经门静脉移植的多篇文献显示，干细胞可在不改变器官微结构的情况下与受体肝实质相融合。 但临床应用中，移植后门静脉及肝小静脉血栓形成是影响其广泛应用的又一障碍。 肝动脉移植 肝动脉移植 采取患者自体骨髓分离纯化骨髓干细胞，行肝动脉方式移植入肝脏中治疗慢性肝功能衰竭。姚鹏等的结果自体骨髓干细胞移植治疗8周后，移植组患者临床症状、肝功能和凝血机制明显改善。 张强等报道同样方法经肝动脉自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化患者，结果20例患者中14例有效，6例无效，收到良好短期疗效。 由于临床工作只是起步阶段，但有效的临床结果令人鼓舞。 肝干细胞移植治疗肝病的展望 肝干细胞移植治疗肝病的展望 　　随着肝干细胞研究的深入，以下问题的解决，可能会推动干细胞移植的临床应用： （1）自体干细胞分离方法的简化和体外扩增速度的加快，是决定其用于治疗急性肝病的重要因素； （2）加强对干细胞诱导分化机制的研究，防止向肿瘤细胞分化； （3）移植途径的简单化，经皮经肝的门静脉移植可能是治疗肝病的最简单的有效方法，如何预防移植后血栓的形成是一个较重要的课题； （4）进一步研究与干细胞嗜肝特性相关因子，最终达到经外周血进行干细胞移植治疗肝病的目的； （5）开展干细胞基因修饰后移植治疗遗传性疾病及其他基因异常疾病的研究。