碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动力学、形态学的研究

碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动力学、形态学的研究 碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动力学、形态 学的研究 成亮等:碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动力学,形态学的研究 碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动力学,形态学的研究 成亮,钱春香,王瑞兴,王剑云 (东南大学材料科学与工程学院,江苏南京211189) 摘要:选用实验室自培育碳酸盐矿化菌,研究了体 系,细菌体体系,细菌分泌物液体系对碳酸钙结晶动力 学,晶体形貌影响.研究发现细菌液浓度增加,抑制碳 酸钙成核动力学"平台区"由O增加到7.8rain;细菌体 作为异相成核点加速结晶过程;分泌物抑制晶体成核, 并随着与Ca.混合时间的不同,"平台期"延长.球形 碳酸钙的产生是由细菌分泌物调控;Ca.同有机质 面一COO一和C一0结合,并且随着相互间作用程度 的增加,球状碳酸钙不规整表面逐步转变为光滑表面. 本研究对于微生物诱导碳酸钙的工程性应用如混凝土 微裂缝修复,古建筑表面防护处理,微纳米碳酸钙颗粒 制备等具有一定指导意义. 关键词:生物矿化;球形碳酸钙;碳酸岩矿化菌;电导率 中图分类号:Q939.99文献标识码:A 文章编号:1001-9731(2007)09-1511-05 1引言 众所周知,生物体采用温和的条件却能对反应实 行高度精密的控制,对能量,空间及原材料进行充分的 利用,且形成的材料性能优越,令人叫绝.对于生物矿 化材料超结构以及在不同生物体系分子间作用是如何 精确控制结晶构造,已有大量研究.现已证明,生物超 结构组装最终是由固一液和固一固界面分子间作用力决 定的.利用微生物的矿化作用,采用微生物技术沉积 出具有胶结功能的特定构形的碳酸盐,进行砂基材的 胶结和材料裂缝,缺陷的修复,最近几年在一些国家刚 刚起步?引. 微生物生命周期过程中新陈代谢的有机产物与无 机矿物之间有着复杂的生物矿化作用,无机相的结晶 严格受生物分泌有机质的控制的口].国内对有机质 调控无机物矿化的研究已有报道,但研究微生物菌种 在特定生长,酶化条件下诱导碳酸钙结晶的研究还未 见报道,本研究的目的是研究微生物诱导碳酸钙结晶 在动力学,晶体形态学方面的调控机理,对微生物诱导 碳酸钙工程性不同领域的应用具有一定指导意义. 2实验 2.1药品 采用菌种芽孢杆菌系;去离子水;牛肉膏,蛋白胨; CaC12,Na2CO3,分析纯. 2.2仪器 红外光谱仪:750傅立叶红外光谱仪;X射线衍射 仪:XD-3A型;扫描电镜(SEM):Sirion场发射扫描电 镜;数显电导率仪:DDS一12A型;高速离心机:一 TGL_16GA型(国产)等. 2.3实验方法 2.3.1菌种的培养 选用标准LB培养基高温灭菌,接种后不添加底 物,并在3O?恒温培养箱以170r/min培养24,48h, 待培养基混浊取出菌液,取3ml细菌液于lcm比色管 中,利用菌液中细胞浓度与其浑浊度成正比,与透光度 成反比,利用分光光度计测定其光密度0D值,可以相 应表示细菌液浓度.以OD值(吸光度)为1.6的菌液 浓度作为基准. 2.3.2细菌分泌物水溶液(以下简称分泌物液)和细 菌体水溶液(以下简称菌体液)制备 将培养好的细菌液(OD值1.6)在高速离心机上, 用5000r/min转速离心10min,取上清液制成分泌物 液,同时将离心出的细菌体以等体积去离子水再重新 溶出制成菌体液. 2.3.3结晶过程电导率测量与碳酸钙晶体的制备 (1)选用同一批培养细菌液(OD值1.6).分别浓 缩与稀释到OD为3.2,0.8,0.4的悬浮液50ml,以 200r/min转速搅拌下依次缓慢加入50ml,浓度 20mmol/LCaClz与Na.CO.溶液,溶液总体积 150ml.测反应体系电导率变化,反应结束后过滤,干 燥制备碳酸钙晶体. (2)以分泌物液和菌体液作为碳酸钙沉积环境. 以体积比V(细菌分泌物液):V(CaCl.):V (Na2CO3)=1:1:1和V(菌体液):V(CaCl2):V (Na2CO3)一1:1:1,以200r/min转速搅拌下依次加 入浓度为10mmol/L的CaCl.和Na.C03溶液,测量 反应体系电导率变化,反应结束过滤,干燥制备碳酸钙 晶体. (3)将10mmol/L的CaCl.溶液与2.3.2中制备 成分泌物液以体积比(细菌分泌物液):V(CaC1.)= 1:1,200r/min的转速混合搅拌,分别于0,30,60min 后缓慢加入等体积10mmol/LNa.CO.溶液,测量体 * 基金项目:国家自然科学基金资助项目(50578035) 收到初稿日期:2007?02?08收到修改稿日期:2007?06?20通讯作者:成亮 作者简介:成亮(1982一),男,江苏扬州人,在读博士,师承钱春香教授,从事微生物矿 化机理及应用研究. 1512助材料2007年第9期(38)卷 系电导率变化,反应结束后过滤,干燥制备碳酸钙晶 体. 2.3.4分析检测 (1)sEM和IR分析,能谱元素分析 将2.3.3中(1),(3)制备取得的碳酸钙晶体制 样,进行SEM扫描电子显微镜一能谱,红外光谱分析. 借以表征晶体形貌和有机一无机复合物之间键合情况. (2)溶液电导率测定 为了保证体系离子反应均匀性,以200r/min速率 搅拌溶液.固定电导率仪在各反应体系中,检测溶液 电导率值随时间的变化. 3结果与分析 3.1菌液体系对碳酸钙结晶动力学及晶体形态影响 3.1.1结晶动力学影响 电导率参数表征了溶液中游离态离子的总浓度. 试验前后溶液的电导率的降低反映了溶液体系中导电 离子结合成不导电物质的一个过程[5].主要是Ca. 与Co;一离子结合形成不溶CaCO.晶体导致溶液中 离子浓度的减少,导电能力的降低.通过电导率曲线 (图1)可以看出,高浓度菌液体系下碳酸钙结晶动力 学曲线出现"平台区-[6,73,细菌液浓度越高,平台区越 长,由0min增加到7.8min,抑制晶体成核生长作用越 明显. 图1不同浓度细菌液体系电导率变化与时间关系图 Fig1Relationshipofconductivitytotimeindifferent concentrationbacteriasolutions 3.1.2菌液体系中碳酸钙晶体IR图谱与SEM图谱 由图2看出,在细菌液体系中,由于大分子带负电 带白质的空间作用使得CaCO.晶体中的c—O不对 称伸缩振动特征吸收峰由1429.Ocm-1向长波方向偏 移,当细菌液0D值为0.4和1.6时,峰值分别为 1417.54和1410.53cm_..有机物的存在使碳酸钙晶 体C-O键的结构发生了改变(今后可用TEM进一步 验证).同时在图中可以清楚地分辨出1655, 1630cm和1560---1510cm-1多肽区.作为蛋白质中 的C=O键,其特征峰由1657cm-1分别红移到 1642.11(b)和1628.07cm-1(a). Rhee等人[8已证实:Ca.能与胶原蛋白质中的羧 基一COOH配位,有机质中的大量游离羧基是Ca.的 第一类结合点].图中可以看出体系中存在的ca抖, 引起了羰基振动强度的降低.已知,蛋白质肽键中的 羰基C—O,一NH一能够与Zn抖,Co计,Ni抖,Pb. 等金属离子配位,生成环状配合物[1..,因此我们认为, 有机质/CaCO.复合物中,Ca.同肽键中的羰基发生 了配位作用,从而减弱了双键电子云密度,降低了双键 的强度,使红外图谱上的峰值发生红移.有机质肽键 中的羰基C=O是碳酸钙矿化的另一类成核位点. 图2不同细菌液浓度中形成的碳酸钙晶体红外图谱 Fig2FT—IRspectraofCaCO3crystalsformedindif— ferentconcentrationbacteriasolution 细菌液浓度不同时,相应的体系中有机质及有机 质分子中一COOH与C=O含量也不同.有机质浓 度高时C=O红外吸收峰红移量14.89cm小于有 机物浓度低时28.93cm-1红移量.可以认为Ca.与 一 COOH及C=O间可产生多种不同形式的I-Ca~ (cO),]什配位螯合作用.当有机基团含量高时,单个 Ca.螯合多个有机基团形成高配位体;而当有机基团 含量低,则形成低配位体,配位体中多个C=O基团 同时受Ca.电荷离域作.由于电荷分配作用,高配位 体中单个C=O受作用强度要小于低配位体.受作 用强的红移量大,受作用弱偏移量小,从而出现了红外 图谱上C=O吸收峰偏移量随菌液浓度差别而不同. 由相应碳酸钙晶体SEM图可以看出,碳酸钙晶体 形貌有着很大的改变.伴随着菌液浓度的变化,碳酸 钙晶体由大小不一的球形或球状聚集体(如图3),转 变为规则长方体,长方体团聚体晶体及不规则聚集体 (图4),球形碳酸钙晶体基本消失. 图3镜图 Fig3SEMofCaCO3crystalsformedinbacteriasolu— tion(0D3.2) 细菌液体系对晶体生长初期成核具有一定抑制作 用,导致晶体动力学生长曲线出现"平台区",随着细菌 液体系浓度增大平台期延长(图1).而细菌液体系又 成亮等:碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动力学,形态学的研究 会调控晶体以特定形貌生长(图3,4),随着浓度的增 大,对碳酸钙调控机能越发明显.细菌液具有抑制晶 体成核与控制晶体生长形貌双重作用,其中有机质同 金属Ca抖间作用是调控碳酸钙结晶过程的关键. 图4菌液中(0lD0.4)结晶CaCO.的扫描电镜图 Fig4SEMofCaCO3crystalsformedinbacteriasolu— tion(OD0.4) 3.2不同体系在矿化结晶过程中的调控作用 在室温(20?)下,以分泌物液,菌体液,水溶液为 晶体生长体系环境,测碳酸钙结晶过程中的电导率变 化(如图5所示),发现相比水溶液体系,细菌分泌物体 系中电导率曲线具有明显的"平台区",平台区过后,具 有同水溶液中相似的曲线走势,进入成核区[1?.而菌 体液中电导率"平台区"消失,且成核速率明显加快. ',, { Timelmin 图5不同体系环境反应电导率与时间关系图 Fig5Relationshipofconductivitytotimeindifferent systems 图5可以看出,以分泌物液作为碳酸钙沉积环境 电导率降低值Ay=一0.175mS/cm明显小于水溶液 体系Ay=--0.224mS/cm和菌体液体系Ay=--0.228 mS/cm电导率降低值. 水溶液和菌体液中,Ca.与CO;一充分反应,电导 率降低值反映了正负离子消耗量.分泌物体系(pH> 9)中蛋白质等有机大分子中羧基电离成一COO一而使 分子呈负电性.Ca.中和表面带负电大分子(主要为 蛋白质),使大分子问絮凝成团聚体.团聚体包裹的 Ca抖无法参与碳酸钙形成,使CO;一离子相对过量而 存在溶液中,导致反应体系电导率降低值小.羧基基 团螯合Ca.(减少钙离子浓度)[1引,可降低体系离子过 饱和度;同时李广兵等[1研究证实碳酸钙结晶过程属 于扩散控制过程,体系中带电有机质基团阻碍无机离 子间相互迁移,碰撞,导致结晶初期离子结合速率下 降,从而抑制晶体的初期成核. 由SEM图可以看出,分泌物液作为晶体生长环境 时,形成具有纺锤形,球形的碳酸钙晶体(图6),同时 规则斜六方体晶体的出现可能是由于这部分晶体的生 成没有受到分泌物界面控制.细菌分泌物对晶体形貌 产生很大影响,晶体呈现表面发散型球状晶形;而细菌 体对晶体形貌几乎没有影响,形成表面留有孔洞及细 菌体的规则六方体碳酸钙(图7). 图6分泌物液中结晶CaCO.扫描电镜图 Fig6SEMofCaC03crystalsformedinbacterialse— cretionsolution 图7菌体液中结晶CaCO.扫描电镜图 Fig7SEMofCaCO3crystalsformedinbacterial bodiessolution 3.3Ca.与细菌分泌物间作用对碳酸钙结晶过程影 响 从ca.与分泌物液混合不同时间后,体系电导率 变化值曲线图(图8)可以看出,随着混合时间的增加, 体系电导率初期"平台区"延长,动力学"平台区"由3.7 min延长至7.33min,并随后进入结晶成核区,且成核 速率呈现梯度下降趋势.随着ca.与分泌物混合时 间的延长,分泌物有机质抑制碳酸钙初期结晶成核作 用越明显,动力学调控作用越强. 图8电导率变化与时间关系图 Fig8Relationshipofconductivitytotime ca.离子与细菌分泌物混合不同时间后,制备碳 酸钙晶体具有很大的形貌差异.虽都基本呈现几何球 形,但混合0min,晶体晶粒尺寸为lOt.tm左右,表面粗 1514助 糙,规整度差(图9);混合60min,晶体晶粒尺寸为1, 3m,表面光滑,规整度很好(图10). !生笪!塑鲞 长基元模型"],大量晶体生长基元在有机质调控作用 下往晶界面堆积,晶体生长基元通过传输,热对流等动 力学因素传送到既有晶体表面时,由于大分子的静电 排斥,空问位阻等一系列作用,阻碍了生长基元移动到 晶体表面能量最低处,抑制了晶体正常的动力学,热力 学生长,最后形成我们所观察到的表面光滑球形.当 有机质一无机离子问作用较弱情况下,部分晶体生长基 元未同有机质作用,从而产生不规整界面. 图9O 图 描电镜 Fig9SEMofCaC03crystalsformedinbacterialse— cretionsolutionafterblendedCa0min 图1O 镜图 Fig10SEMofCaC03Crystalsformedinbacterialse— cretionsolutionafterblendedCa.60min 3.4有机一无机界面分析 图11,12分别为混合细菌分泌物体系下60min混 合制备得球状碳酸钙SEM和碳酸钙表面团聚有机质 SEM图,及对应条件下的表面元素能谱分析.图11 (a)看出球状碳酸钙表面吸附着大量微小团聚物颗粒. 对碳酸钙表面做能谱分析发现,界面区域元素集中分 布有C,0,N,Ca(图11(b))其中N元素的存在可以明 确判定有机一无机界面处存在生物有机大分子.对表 面吸附团聚体进一步分析发现,其主要元素成份为C, 0,N,不含Ca元素(图12(b)),可以断定球状碳酸钙 表面吸附的微小团聚物为微生物分泌的有机质(蛋白 质),并且有机质以球形颗粒团聚态存在于体系中(图 12(a)). 我们认为产生球状碳酸钙晶体主要原因是由于晶 体受有机质调控,产生多级生长和相互聚集.通常可 溶性有机质在水溶液中非极性基团藏于分子内部,极 性基团暴露于分子表面形成球状.Ca.离子的引入, 中和有机质表面负电荷,使多个有机质分子絮凝成为 晶体生长的限制空间.蛋白质大分子团表面所形成的 (蛋白质一Ca.)基元模板将作为碳酸钙结晶成核位 点.随着Ca.与有机质混合时间增加,Ca.与有机质 相互问碰撞,作用几率增大,数量增加,有机质充分调 控无机矿物离子矿化结晶.根据负离子配位多面体生 图11分泌物液与Ca.混合60min后CaC03扫描电 镜图及碳酸钙晶体表面能谱分析 Fig11SEMofCaCO3crystalsformedinbacterialse- cretionsolutionafterblendedCa060minand energyspectrumanalysisonCaC03crystals SUrface 图12分泌物液体系CaCO.表面吸附物扫描电镜图 及吸附物能谱分析 Fig12SEMofabsorbatesOncrystalsCaC03surface andenergyspectrumanalysisofabsorbates 成亮等:碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动力学,形态学的研究1515 4结论 (1)碳酸岩矿化菌体系对碳酸钙结晶过程具有 抑制作用,反映为电导率曲线所表现出的动力学"平台 区",并且随着菌液浓度增大"平台区"延长,由0增加 到7.8min. (2)细菌体作为异相成核位点,对碳酸钙液相结 晶过程具有促进成核作用;细菌分泌物抑制晶体初期 成核,并随着与Ca抖混合时间增加,动力学"平台区" 由3.7min延长至7.33min,相应结晶成核速率降低. (3)细菌体对碳酸钙晶体形貌不产生影响,细菌 分泌物能够调控球形碳酸钙的产生. (4)有机质由于团聚而形成的局部微空间构成 碳酸钙晶体生长微环境,其表面存在有与Ca抖相互作 用基团一COO一和C=O,并且随着相互间作用程度 加强,球状碳酸钙不规整表面逐步转变为光滑表面. 参考文献: [1]Gonzalez—MunozMT,()marNB,Martinez-CanameroM, eta1.[J].JournalofCrystalGrowth,1996,163:434—439. [2]OmarNB,Gonzalez-MunozMT,PenalverJMA.[J]. Chemosphere,1998,36(3):475—481. Studyonkineticsandmorpholo [3]KrgerN,DeutzmannR,SumperM.[J].Science,1999, 286(5442):1129-1132. [4]KrogerN.[J].Science,2002,298(5593):584—586. [5]粟智.[J].光谱实验室,2005,22(3):295—297. [6]NielsenAE.KineticsofPrecipitation[M].London:Per— ganoonPress,1964.1. [7]KoustoukosPG.[J].JChemSocFaradayTransI,1984, 80:1-181. [83RheeSH,LeeJD,TanakaJ.[J].AmCeramSoc, 2000,83(儿):2890—2892. [93HuangZhaolong,ZhangWei,CuiFuzhai.[J].Spectros— copyandSpectralAnalysis,2004,24(5):539—542. [1O]SigelR,MartinB.[J].ChemRev,1982,82(4):385— 426. [儿]张小霓,于萍,罗运柏.[J].应用化学,2004,21(2): 187-191. 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BacterialsecretionrestrainedCaCO3nucleation,anditsinductiontimeprolongedasdifferentblendedtimewith Ca 抖.TheresultindicatedthatglobalCaCO3crystalswereinducedbybacterialsecretion,andtherewerenucle— ationsites—COO— andC=Oinorganicsubstances.IrregularsurfaceofglobalCaCO3wasconvertedtoregu— laronewhentheactionenhancedbetweenCa抖andnucleationsites.Theresultsareusefulforengineeringap— plication,suchasrepairingmicro—crackonconcretesurface,protectingoldbuildingsurfaceandproducingmi— cronandnanocalciumcarbonategrains. Keywords:biomineralization;globalcalciumcarbonate;carbonate-mineralizationmicrob e;conductivity