马卵母细胞ICSI后体外发育能力及妊娠后期卵巢黄体组织超微结构研究（可编辑）

马卵母细胞ICSI后体外发育能力及妊娠后期卵巢黄体组织超微结构研究（可编辑） 马卵母细胞ICSI后体外发育能力及妊娠后期卵巢黄体 组织超微结构研究 新疆农业大学 硕士学位 马卵母细胞ICSI后体外发育能力及妊娠后期卵巢黄体组织超微 结构的研究 姓名:王荣祥 申请学位级别:硕士 专业:动物遗传育种与繁殖 指导教师:陈静波;余雄 20090601 1马卵母细胞后体外发育能力及妊娠后期 卵巢黄体组织超微结构的研究 摘要 马胚胎移植及卵母细胞胞质内精子注射技术在国外均已取得突 破性进展,我国为养 马大国,肉马、乳马和赛马业市场虽然广阔,但良种马数量缺口很 大,利用新繁殖技术 如胚胎移植、体外受精是解决马繁殖率低和加速品种改良的有效 途径。 本试验从屠宰场采集马卵巢,系统研究妊娠和空怀卵巢,以及不同卵巢状态对卵巢 重量、形态和卵泡分布的影响。用采集到的卵母细胞为材料,评估卵丘形态松散型或 致密型、成熟培养体系或、体外成熟时间或以及离子霉素 结合激活对马卵母细胞胞质内精子注射后体外发育能力的影响。本试验 还对妊娠后期月月马卵巢黄体的超微结构进行了研究。 非繁殖季节马卵巢形态及卵泡分布的研究结果表明:妊娠和空怀马卵巢的重量和 形态,以及大、中、小卵泡数均无显著差异.;卵巢状态对马卵巢重量无显著 影响.;有个大卵泡的马卵巢的中卵泡数显著高于无大卵泡卵巢.。大 卵泡数与小卵泡数呈负线性相关一.,.;马在非繁殖季节有以上 大卵泡的卵巢占总卵巢数的.%,平均每个卵巢共有.个卵泡,大、中、小卵泡 分别占卵巢总卵泡数的.%、.%和.%。 马妊娠后期黄体组织超微结构的研究结果表明:大黄体细胞呈群状或索状 分布,细胞多呈圆形或椭圆形,体积较大。小黄体细胞呈梭形或多边形,体积小; 细胞间质存在丰富的胶原纤维。可观察到部分分泌颗粒,脂滴较多,线粒体、内质网、 溶酶体较少;黄体细胞质内多数细胞器崩解,黄体细胞呈现明显的退化,孕激素水平 的维持不再依靠黄体;在的五个视野内,占黄体细胞的.%,占 黄体细胞的.%;的细胞长径平均为.,短径平均为.,的 细胞长径平均为..,短径平均为./;的核长径平均为.,核短 径平均为.,的核长径平均为.“,核短径平均为.。 马卵母细胞后体外发育能力的研究结果表明:马松散型卵母细胞成熟率显 著高于致密型卵母细胞.,分别为.%和.%,但后分裂率无显 2著差异.,分别为.%和.%;两种培养体系对马松散型或致密型卵母 细胞成熟率以及后分裂率无显著影响。,但相同成熟体系培养松散型卵 母细胞成熟率均显著高于致密型卵母细胞.,然而后分裂率差异不显著 .;卵母细胞成熟率显著高于成熟率.,分别为.%.% 和.%.%,松散型卵母细胞在体系中成熟进行后分 裂率显著高于松散型或致密型卵母细胞在体系中成熟后进行的分裂 率.;后用离子霉素结合激活对马卵母细胞后分裂无 显著影响.。 关键词:马;;辅助生殖;体外受精;发育能力;黄体;超微结构 3 ? . ,’,,, . ., ?, , ,, . , , ,?,, / .? . :,.; .,.: , ,.%, . ; , ..%,. % .%,. ? , 4, : ;,. ; .% .% ,; ., .. ., . .. , .. ., ..;? .: ..%. .,.%,/ . .,.% %;.. ., .. .,.%~.% .%.%..:诵 .. .,:;; ; ; ; : 5缩略词中英文对照 6独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得新疆农业大 学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名: 嚼阚:嘭嘭年占具々?日 墀彳 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:新 疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文 档,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文,允许论 文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索,可以公布包括刊登论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此 彳 研究生签名 时间: 莎月勿阳 : 导师签名 时间: 月 /自 :矿 吻各 忑乃哆 .虮 啄伊狰 琢侈 7新疆农业大学硕士学位论文 第一章 动物卵巢黄体组织超微结构研究进展 卵巢上卵泡和黄体的出现是一个动态的变化,卵泡和黄体的生长呈周期性,成熟卵 泡和黄体的生长存在一个明显的交替过程。动物黄体由内类固醇生成细胞和非类固醇细 胞组成,黄体细胞的类固醇生成细胞主要有两种细胞类型:颗粒层细胞形成的大黄体细胞 ,和卵泡内细胞产生的小黄体细胞 ,。黄体 细胞间相互通讯调节,使发生利于黄体形成、维持功能和黄体溶解,导致下次排卵或者 继续妊娠获得后代 .,。在这个时期中大黄体细胞似乎经历着最显著的 改变,这种形态的变化反映了重要的生理活动。 .卵巢卵泡解剖组织学特点 ..卵巢的解剖结构 卵巢为雌性动物的生殖腺,具有内外分泌双重机能。卵巢组织由弹性的结缔组织构 成,表面被覆致密的白膜,白膜外面有一单层生殖上皮。卵巢由皮质和髓质部组成,皮 质部包在髓质部的外面,内含不同发育阶段的卵泡、红体、白体 和黄体,其形状结构因 发育阶段不同而有很大变化陈静波,。皮质部的结缔组织含有许多成纤维细胞、 胶原纤维、网状纤维、血管、神经和平滑肌纤维,血管分为小支进入皮质,并在卵泡膜 上构成血管网。髓质部含有许多细小血管和神经,它们由卵巢门出入杨增明等,。 卵巢门上有成群较大的上皮样细胞,称为门细胞,具有分泌雄激素的功能,在怀孕时数 量增多杨增明等,。 卵巢的形状、大小和位置随母畜所处的不同生理阶段而异杨增明等,。马的 卵巢由卵巢系膜吊在腹腔腰区肾脏后方,左侧的卵巢位于第四、五腰椎左侧的横突未端 下方,即左侧髋结节的内下侧,而右侧卵巢位于第三、四腰椎横突之下,靠近腹腔顶杨 增明等,。马的卵巢为肾形,较大,附着缘宽大,游离缘上有特有的排卵窝,卵 泡发育成熟后均在此凹陷内破裂排出卵子杨增明等,。 8马卵母细您后体外芨弓能力及妊娠后溺巢黄体组织超徽结章勾酌研冤 ..卵泡的发育和分布 卵泡是位于卵巢上皮、包裹卵母细胞或卵子的特殊结构。动物在出生前,卵巢上便 含有大量原始卵泡,初生后随着年龄的增长而不断减少,多数卵泡中途闭锁,少数卵泡 发育成熟而排卵硎,。 原始卵泡 由卵原细胞和被覆在卵原细胞周围的一层扁平状的卵 泡细胞颗粒细胞构成,没有卵泡膜和卵泡腔。母畜至性成熟时,在垂体和的 作用下,初级卵泡 细胞周围出现透明带,卵泡细胞由单层扁平状发育成 立方或柱状,细胞逐渐由单层变成多层,卵泡周围的结缔组织包裹卵泡形成卵泡膜杨 增明等,。次级卵泡 由~层卵泡细胞包裹卵母细胞组成。卵 母细胞及其周围的一部分卵泡细胞逐渐移至卵泡一侧形成卵丘,周围的卵泡细胞形成放 射冠,内层的卵泡细胞形成颗粒层,卵泡膜分化为卵泡内膜和卵泡外膜杨增明等,。 次级卵泡细胞和卵母细胞的体积均较初级卵泡大,仍未形成卵泡腔。原始卵泡、初级卵 泡和次级卵泡均没有卵泡腔 ,统称为无腔卵泡 或腔前卵泡 。 次级卵泡进一步发育成为三级卵泡 ,卵泡细胞分泌的液体进入 卵母细 胞间隙,形成卵泡腔。随着卵泡腔的扩大,卵母细胞被挤在一边,被包裹在一团卵泡细 胞中,形成突出于卵泡腔的卵丘。其余的卵泡细胞则紧贴在卵泡腔的周围,形成颗粒细 胞层。卵泡腔是否形成及形成后的大小,可作为评定卵泡发育程度的依据,卵泡腔的大 小与卵泡大小一般呈正比例关系杨增明等,。三级卵泡进一步发育成为葛拉夫氏 卵泡 。这种卵泡扩展达卵巢皮质的整个厚度,甚至突出于卵巢表面,卵 泡的颗粒层外围被卵泡膜包裹。卵泡外膜为纤维状的基质细胞,内膜分布有许多血管, 内膜细胞参与雌激素的合成。卵泡腔内充满液体使体积增至最大时的卵泡称为成熟卵泡 ,卵泡逐渐接近卵巢表面并稍突出,此时初级卵母细胞已达到最大直径 .,。多胎动物在一个发情周期有数个至数十个原始卵泡发育为成 熟卵泡,而单胎动物一般只有一个卵泡发育到成熟并排卵,。三级卵泡、 葛拉夫氏卵泡和成熟卵泡均含有卵泡腔,统称有腔卵泡 。 9新疆农业大学硕士学位论文 曼兰曼皇曼曼甍曼曼曼曼曼鼍 量曼曼曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼量曼曼鼍曼曼曼曼曼曼量曼蔓鼍曼曼曼曼?一一 . .卵巢卵泡发生波 卵泡的生长发育过程又叫做卵泡发生波。牛的每个发情周期中,有批至批原始 卵泡发育成为三级卵泡,即每个发情周期有个或个卵泡发生波,每个卵泡发生波均 有一个三级卵泡发育成为成熟卵泡而排卵。马在繁殖季节的一个情期内有个卵泡 波,在非繁殖季节,马卵巢也有卵泡发生波张国庭,。 卵巢上的卵泡数量很多,每个卵泡均有同等发育潜力,表现为体积增大,雌激素分 泌量增多。这些卵泡在发生过程中分为选择期和优势期。选择期 是指从大量不依赖促性腺激素的小卵泡中选择某些卵泡进入促性腺激素依赖期,被选择 的卵泡发育进入优势期,这些卵泡具有发育成熟的能力,在发情周期中,有批卵 泡具有发育成熟的潜力 .,。但在每个发情周期,一般只有其中一个卵泡 发育成熟,这个卵泡相对于其它卵泡具有发育上的优势性,称为 优势卵泡 ,,其它卵泡则称为劣势卵泡或从属卵泡 ,。优势卵 泡有时不一定破裂排卵,但其直径必须是所有卵泡中最大的,且维持这种发育上的优势 性必须持续。牛优势卵泡发育快,卵泡液中雌二醇与孕酮含量的比值可达 。劣势卵泡的生长速度慢,卵泡液中雌二醇与孕酮含量的比值接近于,卵丘细胞发 育较差。优势卵泡对劣势卵泡的生长发育具有抑制作用杨增明等,。 .卵巢的机能 ..卵泡发育和排卵 卵巢皮质部表层聚集着许多原始卵泡,它由一个卵原细胞和单层卵泡细胞组成,卵 原细胞包裹在逐渐增多的卵泡细胞中发育,经过初级卵母细胞、次级卵母细胞最终发育 为成熟的卵子,由卵巢排出。不能发育成熟而退化的卵泡,萎缩成为闭锁卵泡,卵核申 染色质崩解,卵母细胞和卵泡细胞萎缩,卵泡液被吸收,最终失去卵泡的结构杨增明 等,。成熟排卵后的卵泡腔皱缩,腔内形成凝血块,称为血体或红体,以后随着 脂色素的增加,逐渐形成黄体杨增明等,。 10马卵母细瞧后体外发育能力及妊娠后鹈卵巢黄体组织趣微结构的磅究 ..分泌雌激素和孕酮 在卵泡发育的过程中,包围在卵泡细胞外的两层卵巢皮质基质细胞形成卵泡膜。卵 泡膜可分为血管性的内膜和纤维性的外膜,外膜和内膜细胞能合成雄激素,后者由卵泡 细胞或颗粒细胞转化为雌激素杨增明等,。排卵后形成的黄体,由颗粒黄体细胞 和内膜黄体细胞组成,颗粒黄体细胞由排卵后的颗粒细胞变大而形成,呈多角形,其中 含有脂肪和脂色素的颗粒;内膜黄体细胞由内膜的毛细血管向黄体细胞内生长,内膜细 胞也增殖侵入其中而形成,比颗粒黄体细胞小,呈圆形杨增明等,。两种黄体细 胞都能分泌孕激素。 .黄体的形态学 ..黄体起源的研究 人们对黄体形成的卵泡细胞类型提出了两种假设。一种认为黄体直接来源于卵泡颗 粒细胞,这些细胞在排卵后不久由卵泡内膜变性而来 .,;另一种 观点 认为,黄体的形成与卵泡内膜及颗粒层都有关 .,。现较公认的观点为: 黄体的发育与卵泡膜和颗粒层都有关系,但它们与黄体特殊细胞类型的关系尚不清楚。 在年,就阐述了猪的黄体细胞起源于颗粒细胞和卵泡内膜细胞的观点, 并描述了猪的三种细胞类型:来源于颗粒细胞的黄体细胞:具有球形染色质核的 较小的细胞型:具深染胞质的纺锤形细胞型。;研究妊娠期 黄体后发现,尽管黄体细胞来源于卵泡内膜细胞和颗粒细胞,但许多细胞显示出过渡的 特点,不能确定它们的起源。许多研究者也证实了这些发现,并指出至少存在两种黄体 细胞,较大的细胞来源于颗粒细胞,而较小的来源于卵泡内膜细胞 .,。 ..黄体的形成和发育 接近成熟的卵泡卵泡液增加、卵泡壁变薄、卵泡表面的血管增多,而卵泡中心的血 管逐渐减少。接近排卵时,卵泡壁的内层经过间隙突出,形成一个半透明的乳头斑。乳 新疆农业大学硕士学位论文 头斑上完全没有血管,且突出于卵巢表面。排卵时,卵泡液及卵泡壁的胶原酶活性增强, 分解卵泡壁及卵巢的白膜,乳头斑的项部破裂,释放卵泡液和卵丘,卵子被包裹在卵丘 中而被排出卵巢外,然后被输卵伞接纳杨增明等,。 排卵后,卵泡壁塌陷形成皱璧猪和牛在排卵前成熟卵泡壁即己出现皱襞,卵泡膜 的血管受损伤出血,破裂的卵泡腔立即充满淋巴液和血液以及破碎的卵泡细胞,形成血 体或红体 。随着基膜的崩解,卵泡内膜的血管增生,并伸入到颗 粒层内,血液逐渐被吸收,在垂体前叶分泌的作用下,颗粒细胞增大变成多角形, 胞质内出现类脂颗粒,形成粒性黄体细胞;卵泡内膜细胞也发生类似变化,形成体积较 小,核和胞质着色较深的膜性黄体细胞,此时由凝血块构成的红体转变为黄体 。膜性黄体细胞多位于黄体内由结缔组织形成的小梁周围或黄体周缘。黄体细胞 呈团状或索状排列,富含毛细血管的结缔组织夹于其间,卵泡外膜包在黄体的外周形成 黄体被膜杨增明等,。 马、牛和猪排卵时流血较多,血体较大。羊排卵后流血较少,血体 较小。血体进一 步发育,形成黄体。黄体细胞有三种来源:血体中的颗粒层细胞增生变大,并吸取类 脂质而变成黄体细胞;卵泡内膜分生出血管,布满于发育中的黄体,随着这些血管的 分布,含类脂质的卵泡内膜细胞移至黄体细胞之间,参与黄体细胞的形成,成为卵泡内 膜细胞来源的黄体细胞;来源不明的黄体细胞。黄体细胞增殖所需的营养物质,最初 由血体供应陈静波,。以后,随着卵泡内膜来的血管伸进黄体细胞之间,黄体细 胞增殖所需营养则改由血液提供。黄体是机体中血管分布最密的器官之一,其分泌机能 对于维持妊娠和卵泡发育的调控起重要作用杨增明等,。 .黄体的功能 家畜一般在发情周期第血管生长及黄体细胞分化完成,所以黄体通常在发 情周期第或第达到最大体积和最高分泌机能,即血液中孕酮水平在发情周期第 ~达到最高水平杨增明等,。母畜如果未孕,则此时的黄体称为周期黄体或假黄体 ;如果妊娠,则称为妊娠黄体或真黄体 。妊娠黄体可以稍微继续增大,直马卵母细胞后体外发旁能力及妊娠后弱?巢黄体 组织超徽结构的研冤 到妊娠中期停止增大,并在整个妊娠期都存在,以分泌孕酮,维持妊娠,直到妊娠终止 才退化。但是马黄体在妊娠第左右便退化,以后维持妊娠主要依靠胎盘分泌的孕 酮杨增明等,。周期黄体一般在发情周期第一开始退化。在退化时,颗粒 层黄体细胞退化很快,表现在细胞质空泡化及细胞核萎缩。随着微血管的退化,黄体的 体积逐渐变小,颗粒层黄体细胞逐渐被成纤维细胞所取代杨增明等,。最后,整 。 个黄体被结缔组织取代,形成一个白色斑痂,称为白体 黄体是内分泌器官,可分泌孕酮及雌激素,一般认为孕酮是由粒性黄体细胞分泌, 雌激素由膜性黄体细胞分泌杨增明等,。但黄体的主要功能是合成和分泌孕酮, 孕酮对生殖调控具有重要作用,可促使子宫腺分泌子宫乳及乳腺发育,为维持妊娠做好 准备。在发情周期的黄体期,高水平的孕酮能抵制子宫收缩并刺激子宫内膜,特别是子 宫内膜腺体的生长和发育,孕酮对大多数哺乳动物的妊娠维持是 必不可少的 .,,至少在怀孕期前/阶段,在妊娠期摘除黄体即发生流产。孕酮还可刺激乳 腺的生长和发育,特别是对小叶.腺泡的发育。黄体除了产生孕酮和雌激素外,还能产.,; ., 生许多其它激素如催产素 .,、松驰素 、后叶激素运载蛋白、前列腺素及胰岛素如?胰岛素生长因子.。 . 和的起源 .. 和的起源与转化 等认为,黄体中存在三种主要细胞类型:?小的非类固醇生成细胞 ,主要包括血管细胞如内皮细胞、红细胞、白细胞和结缔组织细胞如成纤维细 胞;?小的类固醇生成细胞;?大的类固醇生成细胞“。 人们普遍认为,只起源于卵泡颗粒细胞,而来源于卵泡的内膜细胞。然 而,已有证据表明可以转变为;随着黄体日龄的增加,还可以分化为。 和等运用排卵前的卵泡膜和颗粒细胞表面抗原的特异单克隆抗体追 踪绵羊黄体的细胞起源,结果发现颗粒层抗体与的结合率受生殖周期阶段的影响, 他们由此提出了和起源发育模式:所有都起源于卵泡内膜;直至发情周 新疆农业大学硕士学位论文 期的;几乎所有的均起源于颗粒层,这个时期过后,起源于卵泡内膜的开 始出现,颗粒层来源的在早孕期间消失,而来源于卵泡膜的则维持整个妊娠 期。但也有实验表明,和各有不同的来源,在整个黄体期并未发生分化和转 变。绵羊大小始终保持不变,但数量增加;大黄体细胞数量不变,但体积增大。 尽管与数量比例在整个黄体期逐渐增加,但这两种细胞在黄体中所占的体积 基本恒定。和的分类主要根据其形态和大小,在黄体发育早期,这两种细胞 大小差别不明显 .,。 .. 的亚群 猪存在两种,一种滑面内质网 ,,无指纹 状,为;另一种大,呈管状指纹样,这些约占到细胞体积的%,为。 在妊娠黄体中的数量较周期黄体的数量要多一些,并且能够分化为。 在牛的研究中,也观察到了和,含有类固醇生成细胞所具有的典型的 ,而含有丰富的扩张管状的,它具有在扩张的膜的空间内出现压迹 的趋向,在两种之间未观察到其它的区别陈静波,。 .黄体细胞的分类 ..非类固醇生成细胞 黄体的非类固醇生成黄体细胞包括来自微血管系统的巨噬细胞和内皮细胞等。黄体 的毛细管网分布广泛,多数类固醇生成细胞似乎都与毛细血管网相邻。巨噬细胞对细胞 吞噬活动非常重要,参与免疫反应,似乎与黄体退化有关。内皮细胞直径约,一 般认为排列在微血管网系统的毛细管的腔内,分泌的因子既参与黄体形成过程,也参与 黄体溶解过程杨增明等,。 。.类固醇生成细胞 类固醇激素分泌细胞主要有两种,和。直径占黄体细胞的马卵母细胞后体外发再能力及妊娠后期卵巢黄体组织超微结构的研究 %。促黄体素刺激时,分泌孕酮,是维持孕酮的基础分泌。直径~, 占黄体细胞的%。对无反应,是分泌催产素的类固醇生成细胞,在孕酮的基 础分泌中起主要作用。在排卵前卵泡脱去了%%的颗粒细胞的前体,使血 ., 液循环中孕酮含量减少%. 。 ..黄体细胞通讯 黄体细胞自身通过自分泌与旁分泌在黄体功能调节中起着重要的局部调节作用 .,,和的共培养导致母牛和母羊孕酮生成的协同增加 .,;。内皮细胞与共培养也促进孕酮的分泌。不同细胞., 间的物理接触可发生互作,用培养液抑制孕酮分泌就是例证 ;。 .黄体退化时超微结构变化与特征 ..黄体细胞退化 牛黄体形态上的退化在发情周期的第和妊娠期的第时就可观察到,同时 类固醇生成细胞也经历着同样的形态学变化陈静波,。在发情周期观察到 的变化很明显,主要是大脂滴持续增多,线粒体低密度包涵物开始出现,含有分泌颗粒 的数量和每个黄体细胞分泌的颗粒数急剧下降。然而,在发情周期中,黄体分泌 高水平孕酮,含有丰富的类固醇生成酶的和蛋白质,黄体重量并未下降陈静波, 。当黄体具有这些功能特征,同时又出现形态退化时,预示着黄体正在经历退行 性变化。 ..脂滴 含有脂滴是黄体开始退化的标志。这时黄体细胞将胆固醇转变为类固醇的能力 下降。在整个发情周期都有脂滴,这与自身分泌孕酮的能力较低一致,但 对反应时的情况例外。牛在妊娠时,细胞质内脂滴丰富,黄体细胞开始退化陈 新疆农、监大学硕士学位论文 静波,。 ..线粒体包涵物 线粒体内涵物开始有一个小的包涵体,可逐渐变大,最终附着在线粒体脊上,导致 线粒体直径增大,这些包涵体的内含物被认为是蛋白类降解物,可能是功能异常线粒体 产生的酶类物质的混合物。用对处理无反应的去垂体小鼠的试验 证明,这些内含 物是循环作用的结果。牛妊娠期约前妊娠黄体既无脂滴,也无线粒体内涵物; 母牛妊娠后线粒体内涵物与脂滴同时出现。等 认为,是妊娠开始 退行性变化的临界时间。 ..分泌颗粒 ...分泌颗粒的分布 和等最先描述了牛黄体细胞的致密颗粒,他们将这些结构 称之为“密集体”。这些密集体被证明在执行细胞的分泌功能,年等将之称为 分泌颗粒。分泌颗粒的直径为~,外周有膜。由于组织样品固定时本身含 的蛋自质类内容物吸附了饿离子,因此电镜图像为黑色。高尔基复合体的新生颗粒在 和中都可看蛰 .,;。在溶黄体的初期线粒体出现电子密 集体。分泌颗粒在细胞质靠近副核仁区形成,然后向细胞表面扩散,最后在细胞膜上胞 吐排除细胞外 .,。’等认为除细胞的体积外,存在分泌颗粒 是与的区别。等认为在牛发情周期的分泌旺盛期,构成了牛 黄体的主要部分,至少在黄体期中期有三种颗粒:微过氧化物酶体、初级溶酶体和分泌 颗粒。在整个发情周期中,这些分泌颗粒在黄体细胞胞质内的浓度与细胞分泌孕酮峰有 关。细胞质内其他亚细胞器数量的变化与利用储存在脂滴中的类固醇前体增加孕酮和蛋 白质的合成,将合成物包装在分泌颗粒中的情况相一致。 家畜黄体细胞分泌颗粒在细胞质中常常是均匀分布。细胞质含颗粒群的区域内线粒 体消失,具有分布广泛的微丝网架结构,形成细胞骨架,这种结构调整与胰腺细胞含 马卵母细胞后体外发葛能力及妊娠后期卵巢黄体组织起微结构的砑究 有胰岛素颗粒依赖微管和微管有关蛋白激酶的迁移情况类同。黄体的微循环系统发育充 分,多数电镜图像的颗粒群和胞吐都有毛细管存在。产生大量分泌颗粒的粗面内质网很 稀少,’等仅在%的中观察到了粗面内质网。除了颗粒,形态 上主要表现的是有丰富的滑面内质网和线粒体类固醇激素的合成能力。 牛颗粒比数量多,妊娠月~月颗粒增加,直径也增大;月~月, 颗粒数量增多,体积变大。分泌颗粒在细胞质靠近副核仁区形成,然后向细胞表面扩散, 最后在细胞膜上胞吐排出细胞外。牛妊娠前期到后期分泌颗粒的 变化呈现逐渐增多,增 强的趋势陈静波,。 ...颗粒分泌物的种类 处在发情周期的牛的同一分泌颗粒中含有催产素和后叶激素运载蛋白两种分泌物。 妊娠中期的颗粒不含有催产素 .,。颗粒分泌的其他黄体蛋白类物质 有分泌颗粒包装的备选物,包括有组织抑制因子,金属蛋白酶和,载体蛋白 和.。的膜被小分泌颗粒~丰富,妊娠牛黄体细胞的形态变化与 空怀牛很相似。和分离牛黄体的催产素,也证实了黄体颗粒含有神 经垂体素运载蛋白和催产素。虽然己证明这些颗粒含有孕酮和孕酮结合蛋白,但是 等没有找到颗粒含有孕酮结合蛋白的证据。等认为和之间形态和 直径上差异明显,没有观察到过渡型细胞,即没有一种细胞具有两种细胞的特征,结构 ‘ 特征表明没有内膜和颗粒细胞都生成的证据。 . 和超微结构的差异 牛、羊和猪等家畜黄体组织中存在着两类形态和功能不同的黄体 细胞和。 呈多角形,细胞体积较大,核呈圆球形,胞质着色浅,充满细小脂滴;体积较 小,核和胞质染色深,主要分布在结缔组织形成的小梁及外周区,细胞呈群或索状排列。 ..绵羊 绵羊的体积大,呈多面体;核呈圆形或 .,:, 历播农业大学硕士学位纶文 有一个或数个核仁。呈纺锤形,核不规则,由于含异染色质而浓染,通常也能见到 一个或多个核仁,核膜常有复杂的折叠;细胞核/胞质约为:;较高三倍多。 体积约为’。,仅.×。,直径约是的两倍分 别是和 .,。 猪具有高度卷曲的膜和大量管状的,处于黄体中期的黄体组织的扫描电 镜观察发现:为规则的圆形,具有大量微绒毛及长的突起。长短不一的微 绒毛直立或横于表面,微绒毛之间常形成网络。发情周期第黄体的表面皱缩。 周期的,为圆形,具有光滑的表面。透射电镜观察表明,膜卷曲, 有许多微绒毛和长突起,胞质内小线粒体丰富。含有小泡及较多 的脂滴 和线粒体,细胞膜规则,仅含有少量微绒毛 .,。对妊娠黄体的扫描电 镜观察显示,妊娠和时存在许多 .,。含有大量的微 绒毛,同样也构成网络,结果表明妊娠黄体与周期黄体的特点相似,如 表面光滑及许多小泡 .,。然而,妊娠黄体的含有较周期黄体 数量更多的线粒体,核形也有所不同,在妊娠核为树叶形,而周期为圆形; 含有许多线粒体及大的指纹状 .,。 在牛黄体中,和共同构成黄体体积的%,直径组成黄体细 胞的%、黄体容积的%;直径~仅组成黄体细胞的%,但构成黄 体容积的% .,。的结构特点有:?相邻之间的粘合连接; ?呈同心的螺纹状形成“指纹”形态;?在全部发情周期和妊娠阶段中细胞内有丰富 的细胞质脂滴;?弥散分布的细长具管状峭及晶体包涵物的线粒体,还含有具有成 堆的高尔基器及与高尔基器凹面相连的新生颗粒。结构特点有:?整个细胞质中整 齐分布的丰富的无密集螺纹;?在发情周期及妊娠早期无脂滴:之间缺乏马郛母细胞后体外发蔼能力及妊娠后期巢黄体组织起徽结构豹研冤 曼量曼曼曼皇曼曼曼皇皇曼曼曼曼曼曼曼曼璺曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼皇曼曼鼍皇曼曼曼曼量寰皇曼曼鼍曼曼鼍曼量曼 一.. 粘合连接;?细胞质中充满密集的球状线粒体含层状和管状晴:?在黄体形成和退化 期间可见线粒体内有电子致密的包涵物中线粒体包涵物是类晶体状;?丰富的分 泌颗粒形成一个大的颗粒簇 .,。在两种类型的黄体细胞中都可见到成 堆的粗面内质网。 . 和功能上的差异 在家畜,基础孕酮分泌主要来自,但在和腺普酸环化酶作用下,产生 大量孕酮,这与受体大量存在于结果一致 .,。生成孕酮 的能力主要受调节。通过激活蛋白激酶,增加细胞内钙离子浓度,使细胞 内代谢酶活性降低,抑制胆固醇的合成和胆固醇向孕酮的转化,并可能导致自溶, 产生细胞毒性而间接引起变性和孕酮分泌的降毛 .,。 灵长类动物猴基础孕酮也主要来源于,同时,还是黄体激素的主要来源, ., 这种分泌雌激素的特性是灵长目动物猿猴与家畜黄体功能的一个重要区别 。较能产生更多的孕酮。尽管牛的较的类固醇生成细胞少%, 但却能产生远比多的孕酮,绵羊产生孕酮的能力是的倍,猪产 生的孕酮量始终超过产生的孕酮 .,。 .展望 虽然多年来人们对黄体已从各方面进行了深入的研究获得了许多成果,但是还有一 些问悬而未决,需继续研究,未来的主要研究方向有:不同类型黄体细胞的来源及 不同类型黄体细胞相互转化;不同类型的黄体细胞的分离与鉴定;不同类型细胞 相互作用及调节分泌类固醇激素及多肽激素的机理;黄体组织分泌激素和因子的种 类、作用及其提纯;黄体细胞脂滴、空泡、分泌颗粒、线粒体包涵体在发情周期及妊 娠期出现的确切时间及变化规律。要弄清妊娠期黄体的超微结构变化规律,需要知道妊 娠的确切天数,品种和年龄。 新疆农业大学硕士学位论文 第二章 马卵母细胞胞质内精子注射的研究进展 .前言 过去十几年,马的繁殖技术有了很大的提高,但传统的体外受精方法所产生的结果 并不令人满意。在这期间,仅有两个后代出生,且卵母细胞使用的还是排卵前的卵 母细胞。这主要是由于马卵泡直径比较大且表面比较坚硬,从而造成卵母细胞的回收率 低。同时,卵母细胞发育到 期的比例也是低的。马精子体外获能效率比较低,这是 因为精子对体外获能和穿卵过程具有抵抗作用。?的失败显然与精子的穿透率有关, 因为在用、透明带切口或钻孔后,卵母细胞的受精率是显著提高的。是可能而 有效的体外受精方法。随着技术的进步和的应用,上述问题在很大程度上被克服。 目前已经有体外受精后代的出生。体外受精技术可以被用于精子数量少的公马上, 并且作为一种判定马冻精质量好坏的实验室检测方法。 胞质内精子注射 ,是世纪年代后期发展 起来的一种新型的体外受精技术,它是借助显微操作仪,将处理后的精子或生精细胞直 接注入卵母细胞胞质内,从而完成受精的过程。哺乳动物在正常 受精过程中,精子必须 穿过透明带与卵质膜融合进入卵中,显微受精将体外受精与显微操作技术相结合,可使 精子越过透明带和卵质膜所形成的正常受精障碍。而卵母细胞质内注射技术则可排除透 明带和精卵质膜这两重障碍,故不要求精子是能动的、活的,甚至可以是不完整的,而 且从理论上讲,只要有一个精子就有可能受精。因此技术在动物受精和发育机理 研究、畜牧业生产及人医临床实践中有着极为广阔的应用前景。 主要表现在以下几个方面:第一,利用技术可以进行同种和异种动物受精机 理的研究,对于解决发育生物学和生殖生物学有关受精机理问题具有重要意义。第二, 技术可以提高种公畜和珍贵野生动物的精液利用率,对野生动物资源保存和拯救珍 稀动物方面有着重要的现实意义。第三,通过受精可使形态异常、弱动或不运动 甚至死精子进入卵内受精,故该技术对于治疗人类、家畜和珍贵野生动物的某些男雄 性不育症具有特殊的临床意义。第四,与其它生物技术结合,在畜牧业育种、转基马郛母细胞后体外发育能力及妊娠后期卵巢黄体 组织超微结构的研究 因动物生产和性别控制等方面发挥一定的作用,例如用精子作为外源载体己成为 转基因的主要方法之一。第五,推动精子分离技术的推广应用,提高优良种畜精子的利 用效率。 .国内外研究概况 早在世纪年代初,等就进行了卵胞质内精子注射试验,他将 海葵的精子注射到海葵的卵母细胞中,卵母细胞未被激活也没有形成原核。年代中期, 等在蟾蜍卵母细胞中注入青蛙精子发现有原核形成,同年利用单精 注射技术注射了枚爪蛙卵,获得只形态正常的爪蛙,成为单精注射后代出生的首 例报道。随后等将人或仓鼠精子注射到仓鼠卵母细胞中均形成了原核。 等对金黄地鼠的研究发现精子注入卵胞质前的预处理具有促进精核 去浓缩,提高卵子受精率的作用。直到年代末,才有哺乳动物的后代出生的报 .,; .,, 道,世界上报道的首例哺乳动物的后代是家兔 ., 从年代初开始,技术在其它哺乳动物上也相继取得了突破,包括牛; 、人 .,、羊 .,、马 ,、小鼠 .,、猪 .,、驴 .,、猴 .,等都纷纷有后代出世。值得提出的是,年等在世界上首次 报道采用卵胞质内单精子注射技术成功获得了人类健康的新生婴儿,使得该技术在人类 生殖上的应用取得重大突破。等分别把牛、羊、鲸鱼的精子注射到牛的卵母 细胞内雄原核形成率分别是.%,.%,.%,分裂率分别是.%,.%,.%。 等的实验表明,猪、牛、羊、小鼠和人的精子注入到猪卵母细胞内,原核形 成率没有明显差异。 我国的同类研究起步较晚,卢圣忠进行了牛和猪精子显微受精的研究:牛冷 冻精子注射的受精率为.%,分裂率为.%;猪新鲜和冷冻附睾精子注射的受精率达 .%,分裂率达.%。年顾文艺等将绵羊精子可溶性提取物与单个不 运动绵羊 精子注入体外成熟的绵羊卵母细胞质中,发现精子和精子提取物共同注射具有明显的促 进胚胎发育作用。同年,李子义又进行小鼠精子和球形精子细胞的注射,胞质内 新疆农业大学硕士学位论文 精子注射卵的存活率.%,受精率.%,卵裂率.%,囊胚率.%李子义等, 。在人的显微辅助受精技术研究方面,庄广伦等年首次在我国获得成功。近 年来国内一些医疗机构也相继开展了此项工作,并取得比较好的成果商微等,; 曾俐琴等,:徐珉等,;徐建亚等,。 在已有的研究中,研究人员都是通过体内或体外方式收集卵母细胞的。手工取卵要 比活体采卵的效果好。但是屠宰场数量和卵巢收集时间影响了卵母细胞的成熟率。另外, 直径的卵泡能提供更有活性的卵母细胞。有研究表明,马卵母细胞培养一, 核成熟率在%一%。近年的研究表明,后卵裂率在%%。等研究 了卵母细胞与输卵管内膜上皮细胞或胎儿皮肤成纤维细胞的共培养是否影响后的 马卵母细胞发育潜力。在、输卵管内膜上皮细胞、胎儿皮肤成纤维细胞中,卵母 细胞期到达率分别为%、%、%。精子获能是体外受精的另一难点。目前仅 有一种处理方法有比较高的受精率,即用钙离子载体处理。等报道,用 处理时,受精率为%一%;等报道,用处理,受精后有% 的卵裂率和 %的囊胚形成率。 随着技术的进步,透明带钻孔、等其他受精技术也被应用。是可能而有效 的体外受精方法,克服了卵母细胞的低受精率问题。现在已经有体外受精马的后代。 扩大了精子使用范围,减小了受体感染子宫内膜炎的危险,但同时也存在对卵母细 胞的机械损伤,以及注射过程中卵母细胞溶解导致胚胎发育率降低的问题。’ 等的研究表明,比有更高的受精率,分别为.%和.%。等 的研究结果表明,不同活力的精子后卵裂率没有不同,胚胎发育的阶段比例也没有 明显不同。等的研究表明,硫柳汞的激活处理可导致一个重复的钙离子增加, 。 比乙醇、肌醇的激活处理显著提高了激活率,.细胞阶段的比例可达到%。同时他们 的研究还表明,后共培养系统能够提高卵裂率和胚胎发育率。近年来, 的使用提高了激活率和卵裂率,卵裂率可达%。 使用限制在于胚胎发育的方法未建立起来。但是后的胚胎在受体输卵管内 的发育率可达%,表明如果有一个合适的培养环境就可以有一个高效的胚胎生产。 有研究表明,后体内输卵管内和体外培养的胚胎发育率是%和%。在牛上,马卵母细咆盾体外发育能力及妊娠后期卵巢黄体组织超微结构的研究 ...............??????...........?,,???? 一?????????????????????? 后受精卵发育到囊胚的比例为%%,而马则小于%,即使是共培养体系。近来, 在/.并且是混和气体下,囊胚发育率大于%,妊娠率达%,即使其中 的一半在早期流产了,但随着方法的改进,胚胎丢失、发育的缺陷机率是会降低的。 .影响胞质内单精注射受精率的相关因素 是一种 胞质内单精注射是指用显微操作技术将单个精子注入卵胞质内 的过程 新型的体外受精技术,对于细胞和分子机制研究很有意义,其可以调控注射入卵的成分 及量以观察对受精的效应;确定授精时刻以观察精卵融合时间及受精后续事件发生时 间;可固定精子进入位点,控制原核极性和胚胎质量,利于研究受精后精核的解聚和原 核的发育能力陈秋菊等,,对揭示哺乳动物雌雄配子间相互作用机理和受精本质 具有重要理论意义,对提高良种公畜的利用率和保护濒危动物资源及拯救珍稀动物具有 潜在的实践意义杨增明等,。 目前,已被应用于人类的辅助生殖 .,、突变系小鼠的种质资源 .,等方面。在传统的体外受 保存 .,及转基因动物生产 精过程中,哺乳动物的精子与卵细胞作用发生在个不同水平:?卵丘颗粒细胞和透明 质酸细胞外基质放射冠;?卵透明带 ,;?卵子质膜。的受精 机制有别于,它避开了过程中这大屏障的筛选作用,其以单精受精率高、多精 受精率低及不受精子浓度、形态、活力的影响等优点,在全世界得到广泛应用并受到高 度关注。理论上讲的受精率应该为%,但研究结果发现其受精率仅为%左右 .,,因此有必要了解技术的影响因素,以期进一步提高的成 功率。 ..卵子状态 卵母细胞成熟后才具有受精能力,卵的成熟包括胞核及胞质的成熟。排出第一极体 仅是卵母细胞核成熟的标志,极体的不同形态反映核成熟度的不同。通常超数排卵能使 大量的卵母细胞快速达到期,但同时促进了第一极体的退化,造成期卵的第一 新疆农业大学硕士学位论文 ‘曼皇曼曼曼曼皇鼍曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼舞曼曼蔓曼曼曼曼皇曼皇曼曼皇鼍皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼罡鼍曼曼曼曼鲁曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼皇皇 极体呈现不同形态,这种卵母细胞异常受精率较大,其正常受精卵也会产生低质量的胚 胎,而且它的纺锤体容易受损,染色体易丢失:第一极体形态异常也会导致非整倍体增 ..加,影响胚胎发育,此种卵细胞不应该用于辅助生殖技术彭弋峰等,。卵母细胞 胞浆充分成熟有个重要标志:?皮质颗粒向浆膜下迁移并沿质膜 呈线性排列;? 成群线粒体散开。这是由于前者为精子进入胞浆后迅速发生的皮质反应和透明带反应创 造了良好的条件,后者有利于卵母细胞充分成熟过程中能量的利用。另外,卵母细胞的 质量均以受精率、卵裂率及良好胚胎形成率等方面来评定。朱亮等试验结果显示, 观测有纺锤体的卵母细胞的正常受精率和良好胚胎形成率,均明显高于无纺锤体的卵母 细胞,但是正常受精的卵母细胞卵裂率,并不因为其是否有纺锤体而有所不同。 ...卵巢保存时间 等研究表明马卵母细胞发育能力受采集到培养的时间间隔影响 .,。试验所用大量卵母细胞来自屠宰后的母马,这在在地理条件及所需数量上 受到很大的限制。等报道马卵巢在?~?保存~不利于卵母细胞体外 成熟 .,。屠宰后立即收集卵母细胞有利于增加减数分裂的恢复率,尤其 对于致密型卵母细胞 .,。等用保存一的卵巢获得 .,; 的卵母细胞后的囊胚率为%% .,。本 试验的用保存一的卵巢获得的卵母细胞后的桑椹胚或囊胚率为.%~ .%。有报道称卵巢在和?运输~获得的马体外成熟卵母细胞移植至 人工授精受体的输卵管后的妊娠率分别为%和% .,。然而,他们用 不运输时间的卵巢进行体外培养的卵母细胞移植后的妊娠率为% .,。 ...卵母细胞类型 卵丘细报松散的马卵母细胞与其他物种不同。卵丘细胞致密的马卵母细胞大多是从 生长卵泡中采集的,而卵丘细胞松散的马卵母细胞大多是从闭锁卵泡中采集的 .,。松散型卵母细胞比致密型卵母细胞更频繁的来自早期凋亡的卵泡 ’ ,。有研究评估致密型和松散型卵母细胞的卵丘细胞层中凋亡细 胞比例时发现松散卵丘细胞中的凋亡细胞数量显著高于致密卵丘细胞中的。 马?母细匏后奉外发葛能力及妊娠屠期卵巢黄体组织起微结构的研究 本研究表明马松散型卵母细胞的体外成熟能力比致密型高,这与 等年, .,; 等年的研究结论一致 .,,但也有报道称 .,。这种差异可能源 松散型与致密型卵母细胞有相同的成熟能力’ 于卵巢的运输时间,或依据卵丘形态分类时的不同。 ...体外成熟 ., 体外培养马胚胎的混合培养体系已经在应用了,如用单层卵丘细 胞共培养 、单层非洲绿猴肾细胞共培养’ .,或添加%的滋养层体 系 ,。另外,后琼脂嵌合合子移植入绵羊输卵管可获得高的囊胚发 .,; 育率 .,。最近,等报道用添加 的/作为培养体系可获得%%的囊胚发育率 .,。有 研究报道,用相对简单的培养体系和添加表皮生长因子 ,, 胰岛素样生长因子 ,.,以及或者添加其他激素如促黄体 素,雌二醇和孕酮的培养体系,对马核成熟率,分裂率,发育至致 密桑椹胚或囊胚期.,; 的能力没有差另 .,。 ..精子状态 对精子几乎没有限制,活精子、死精子、射出的不运动的精子、附睾精子和睾 丸精子都可用于,并可获得很高的受精率杨增明等,。精子头是受精最重要 的部分,单独精子头注射可以使卵细胞活化;精子尾注射却不能;注射精子核也可活化 卵细胞,但活化率较低陈秋菊等,。人们据此提出了精子因子假说,该假说认为: 精子胞质中存在某种或几种可溶性信号分子,在精卵质膜融合或稍后,该信号分子通过 融合进入卵子胞质中,从而激活卵子内钙释放系统而使卵子活化。即精子内存在卵细胞 活化因子 . ,。另外,过程中没有细胞膜的 融合,故精子制动很必要,其能破坏精子细胞膜,使精子细胞膜肿胀,卵细胞中的精核 去浓缩因子进入精细胞,使精细胞释放,激活卵细胞张轶乐等,。而且在制 动过程中,精子质膜受到损伤,能够提高受精率,这是由于质膜完整的活动精子注入卵 飘疆农业大学硕士学位论文 子后,精子在胞质内运动一段时间,会对卵子的细胞器和细胞骨 架造成损伤。 等把反复冷冻受到破坏的精子进行显微受精,体外培养发育至囊胚并产 下犊牛。在 年他又将从睾丸分离的精子细胞和次级精母细胞体外培养后获得的精子 细胞分别注入体外培养成熟的牛卵母细胞质中,胚胎的囊胚发育率分别是.%和 .% .,,等等将猪的球形精子细胞和球形精子细胞核注入电 激活的猪成熟卵母细胞中,囊胚率分别是%和%。这些研究使得可利用的精子大大 增加。 . ...不同发育阶段的精子 球形精子细胞能否象精子一样参与基因组的配合并完成胚胎发育同样受到关注。 年,等应用.操作系统将小鼠球形精子细胞核注入电激活 的卵胞质内,获得了健康的小鼠后代。在随后的研究中证明,在人工激活情况下, 球形精子核可以和球形精子一样活化卵子,形成原核,说明球形精子细胞也能够激发钙 振荡,且存在于精子核,但是不充分或缺少是球形精子受精率低且难以预测.,; 的原因之 .,。也有观点认为球形精子不能激活 卵子,而可能在精子变态时才被激活 .,。 有报道称,将初级精母细胞注入成熟的卵母细胞的卵周隙中或卵胞质内,发现初级 精母细胞也可以完成减数分裂,并形成雌雄原核 .,。也有研究表明 ‘ 将睾九次级精母细胞进行后成功获得了小鼠后代 .,或成功妊娠 ., 。 以上说明初级精母细胞,次级精母细胞,各级精子细胞通过都可以完成受精, 这为临床治疗不同程度生精障碍的男性患者提供了一个可行的途径。由此可见,从睾九 精子到射出精子,虽然其成熟程度有很大不同,但对受精不产生显著影响。 精子是在睾丸中发生、变态并进一步在附睾中成熟而获得正常受精能力的。精原细 胞经数次有丝分裂后,形成初级精母细胞;初级精母细胞再经第一次减数分裂后,形成 次级精母细胞:后者在完成第二次减数分裂形成球形精子细胞;球形精子细胞发生变态 脱离曲精细管后,依次经过附睾头、附攀体和附睾尾,最终发育为成熟的精子。不同发 马母细胞后体外发育能力及妊娠后期卵巢黄体组织超微结构的研究 鼍曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼 一. 一 一 一一一一一.一一一.一 育时期的生精细胞,其成熟度不同,所以其受精潜力也不同。一般情况下,常规体外受 精多选用附睾尾或射出精子。而对于不同发生阶段的精子注射效果同样很好,已在 很多动物上得到证实。如:小鼠睾丸精子受精,顺产只仔鼠 .,。 徐珉等禾用人睾丸细针抽吸技术结合,获得.%的受精率。李满等 较了人的射出精子、附睾和翠丸精子的,结果受精率、卵裂率及妊娠率均无显著差 异。 球形精子细胞 是初级精母细胞经过两次减数分裂后形成的单倍体 雄性生殖细胞。等把仓鼠球形精子核注入成熟的卵子内,%的卵子中精核 能够发育形成雄原核,%的受精卵能够分裂。等报道了兔球形精子 细胞 核成功,并有妊娠和产仔结果。等将猪的球形精子细胞和球形精子细胞 核分别注入到提前电激活的卵母细胞质内,体外培养囊胚率分别为%和%。在人类 上,年月,日本科学家首次报道了人类球形精子细胞获得妊娠,但于 早期流产。等于年报道,他们采用长形精子细胞注射技术并最终出生了位健 形精子细胞注入卵子后出 康的女婴。同年等从无精子症病人精液中获得 生了位正常健康婴儿。对精子发生障碍的病人来讲,这种方法已成为其获得试管后代 的可选方法。 等从成年小鼠睾丸中分离到次级精母细胞,将其核注入卵母细胞质 中,细胞、细胞、桑堪胚和囊胚发育率分别为%、.%、.%和.%。枚~ 细胞胚胎移植后产仔鼠只,产仔率%。年等将初级精母细胞核注入至 正在成熟中的卵母细胞中,可以同时形成雌、雄原核。 由此可见,显微受精技术使精子不需穿越透明带和卵质膜所形成 的受精障碍,大大 降低了对精子各项指标例如精子活力、精子获能、顶体反应等的要求,不同发生阶段 的精子细胞通过显微受精技术也能实现受精。 ...精子活力 精子的活力对胚胎体外发育的影响同样引起了人们的关注。等将获 能处理的牛附翠精子不加冷冻保护剂在.中冷冻.解冻两次,以停止其运动,再将精 预疆农业大学硕?学位论文 子注入牛体外成熟的卵母细胞质中,受精卵可发育到囊胚,并获得头犊牛。随后, 分别采集仓鼠、小鼠、人、马和鱼的精子,用超声波去除精子的质膜、 顶体及尾巴后,精核于?~?水浴或蒸汽中处理一,然后将精子核 注入仓鼠卵胞质中。结果表明,精核于?条件下处理,仍具有原核发育潜力。 将灭活仓鼠梢子核的温度提高到?,虽发生解聚,但却不能形成雄原核。 等将小鼠处死后保藏于冰柜中,后取出附睾精子,%的精子仍具有活动 能力。但不能完成体外受精,实施后,受精率达%以上。后取出的 精子进行 仍能产生正常的胎儿。上述结果表明精核对低温和高温都具有很强的耐受性,死精 子同样具有受精和发育潜能,关键是遗传物质是否受到破坏。 ...精子获能与预处理 过程中直接将单个精子注入卵胞质内,穿越了透明带和卵质膜所形成的受精障 碍。所以精子获能与否对结果不产生显著的影响。等用超声波处理牛 精子使其头尾分离,将精子头实施,胚胎可以顺利发育至囊胚。等 对小鼠精子分别采用和超声波处理,去掉精子质膜和尾部,实施后得到了 较高的囊胚发育率。以上结果说明,去膜精子和精子头实施仍能 正