【doc】细胞悬浮法培养苇状羊茅,多年生黑麦麦草和多花...

【doc】细胞悬浮法培养苇状羊茅,多年生黑麦麦草和多花... 细胞悬浮法培养苇状羊茅,多年生黑麦麦草 和多花... 细胞悬浮法培养苇状羊茅,多年生黑 麦草和多花黑麦草再生植株 S.J.Dalton [摘要]本文就细胞悬浮法培养牧草再生植裸的方法进行了研究,并成功地用此法 从苇-扶 羊茅,多年生黑麦草和多花黑麦草原生质体细胞克隆中获得了再生植株,而且进一 步使苇状羊茅 和多年生黑麦草在土壤中建檀. 一 ,引言 利用许多遗传操作技术的前提是原生质 体再生植株的能力,但在禾谷类作物和禾草 中,只有六种作物能用此法再生出植株.其 中,能成功地转移到土壤中的只有水稻和甘 蔗.本研究从苇状羊茅,多年生黑麦草和多花 黑麦草原生质体细胞克隆中获得再生植株, 并使苇状羊茅和多花黑麦草在土壤中建植. 二,细胞悬浮和原 生质体培养 1.纽胞悬浮液制备培养 先从不同类群碎裂的成熟胚直接制备成 幼胚细胞悬浮液,再从中分离出再生原生质 体.所用的三种材料是从七种黑麦草,苇状 羊茅,鸡脚草和猫尾草中筛选出来的,形成 细胞悬浮液的效果最佳.由许多成熟胚制 备远交种细胞悬浮液,其目的在于;1)利 用廉价的分生组织资源J2)不经过愈伤组 织阶段,省时}3)通过基因蛰混合培养, 获得各物种"典型"细胞悬浮液.然而,在 每一物种内,细胞悬浮系的形态变异却与从 单个基因型愈伤组织培养的一样.由碎裂胚 胎的细胞悬浮液培养出一些再生植株,其同 工酶结果明,个体细胞悬浮液(或至 一 32一 少为再生组织)的异质性不高. 在含有高浓度2,4一D(10毫克/升)的液 体培养基上培养了30个成熟胚,形成细胞悬 浮液.l0天后,再在含有正常浓度2,4一D 的新鲜培养基上培养.一经建植,将小而密 集的克隆转移到80的新鲜培养基上,继代 培养,每周一次. 2.愿生质体分离和培养 继代培养4天后,就可以分离原生质 体,也可在悬浮液产生后4周内尽快分离. 但是,在悬浮液形成约20周前,产量通常 不高(不到3×10.克).同衰老,易碎的悬 浮液分离的原生质体相比,幼嫩细胞悬浮液 分离出的原生质体,大部分小而密集. )羊茅和多年 最初由幼小(13~20周龄 生黑麦草悬浮液分离出的原生体,在液体培 养基上不存活.但曾发现,该培养基很适于 从含有3蔗糖和l0甘露醇的老龄细胞悬 浮液分离出原生质体,并形成禽伤组织克 隆.然而,当原生质体培养在含6.84葡萄 糖和5%甘露醇的高渗透势培养基(PC) 上,才能形成克隆.将由供试品系细胞悬浮 液分离出来的三种植物的原生质体培养在 PC.培养基上,就钱够形成细胞克隆.担当 原生质体培养在平皿内琼脂固化培养基上 时,则得到的结果不一致. 3.愿生质体接种率和克隆培养 / 苇状羊茅原生质体是三个供试材料中效 果最好的,在2O个细胞悬浮系中,有15个分 离出了原生质体,接种率达0.1,1.0(每 板400~4000个克隆)(见表1).而9个 多年生黑麦草和6个多花黑麦草品系中分别 只有1个和2个品系分离出的原生质体,具 0.1,1.0接种率.虽然单个细胞,易碎的 和坚宴的细胞都形成了克隆,但每个板上坚 实细胞克隆不到5O个,这取决于细胞悬浮系 及其周龄. 原生质体的克隆接种到与PC培养基组 成相同,但无甘露醇的团体培养基上,培养 几周后,再将所有由密集克隆发育来的胚胎 和结节愈伤组织都接种再生培养基上,结 果苇状羊茅和多年生黑麦草胚状体长出了绿 色和白化苗,但多花黑麦草胚胎发生不够明 1襄细胞悬浮原生质体接种率 每个细胞-~r-'i,目肥具有0.1 悬浮系汾悬浮系培,1 .O种类养出原生 接种率自离出原生质体数 品系数质体个数(×10) 1,l50.1,91苇状羊茅l5/20 (78)(460) l,92,98多年生黑麦草1/9 (22)(230) 2,48,31.5Z/6多花黑麦草 (17)(107) 注:括号内为总数 显. 三,细胞悬浮和原生质体克 隆再生植株 1.细胞悬浮和原生质体克鹰之比较 同各细胞悬浮系的克隆一样,平板培养 的原生质体细胞克隆一般也具有相同的形 态.平板培养时,大多数细胞悬浮液最初能 够再生出绿色苗,但再生能力随时问而下降 (见表2).虽然形成苗的数量下降了,但 白化苗和易碎组织的比侧却在上升.然而, 对易产生原生质休克隆的大多数细胞悬浮系 来说,在悬浮液明显停止再生后,仍可从分 离中得到苗,不过这些通常是白化苗.在细 胞悬浮渡再生期内,再生绿色苗的原生质体 克隆在分离中有形成的迹象. 2.由苇状羊茅培养再生植株 2O个细胞悬浮系经6,l22周悬浮培养, 分离出了原生质体.平板培养时,12个品系 细胞克隆能再生出绿色苗,但36周后,即停 止再生(表2).形成白化苗的l1个品系, 通常持续较长的时问,至48周后才停止再 生.只产生胚胎组织的两个品系14~15周后 即停止.但是,这两个品系却能从原生质休 克陛形成苗(表3).从另外一个明显只能 形成白化苗的悬浮原生质体克隆中也再生了 绿色苗.总共从l2个细胞悬浮系的原生质 袁2细胞悬浮液阁糖对平板培养细胞悬浮和原生质体克鹰中苗形成的影响 分离出能丹j成苟的原生 种类质体克隆的同龄平板培养细胞悬浮克隆停止再生苗周 绿色苗白化苗绿色苗白化苗 苇状羊茅(20)18~34(6)1l,63(12)l2,36(12)l1,48(11) 多年生黑麦草(19)24,30(1)2l,63(5)15~29(6)19,63(7) 多花黑麦草(6)25"-"33(1)21,33(1)12~43(5)18~43(3) 注:括号内为细胞悬浮系数量 体克隆中再生出了苗,其 中9个品系的再生苗是在 细胞悬浮液明显停止再生 苗后的原生质体分离出来 的形成克隆的大多数苗 仅来自于2个品系(251 个绿色,510个自色). 120多个植株在土壤中建 植,但在结实能力被确定 以前,需春化处理. 3.多年生悬麦草再生擅株 9个细胞悬浮系经 ll,63周悬浮培养,分离 亵3细胞悬浮原生质体克隆再生苗的比较 种 i再生出苗的原J 类lll绿色苗l白化苗l一一一 多花黑麦草(6)f24'(1){4(1)f5'(1) 注:括号内为细咆悬浮系数日,?为敏感系 出了原生质体平板培养时,6个品系的悬 浮克隆能再生出绿色苗,但29周后即停止, 而再生出白化苗的7个品系培养时能持续 63周(表2).一个品系不能再生出苗, 似乎也不能形成胚胎,但可形成具白化苗的 原生质体克隆.最敏感的品系中,悬浮培养 22,63周后,373.个原生质体克隆再生出白 化苗(表3).这也是唯一一个接种率超过 0.1的品系.悬浮培养24~30周后,原生 质体克隆形成的两个绿色幼株不能在土壤中 存活.悬浮培养21~34周后,从3个品系的 原生质体中产生出了15个具白化苗的克隆, 其中两个是在细胞悬浮停止再生苗后产生 的.某些原生质体克隆具绿色部分,但不能 进一步发育. 4.由多花黑壹革培养再生擅株 悬浮培养12~33周后,从6个细胞悬浮 系分离出了原生质体,其中5个品系的克隆 再生出了绿色苗,并能保持43周,3个再生 出了白化苗,也能保持43周(表2).有一个 悬浮系一直到l8周只能产生胚胎组织,5个 悬浮原生质体形成了细胞克隆,但是,克隆 形成率较低(<O.1),且接种率高的品 系中只有2个再生出了苗,虽然一个克隆形 成了白化苗,但这是在细胞悬浮液停止再生 一 34一 后分离出来的,其它品系的克隆再生出了绿 色苗,其中5个绿色幼株在土壤中建植 四,讨论 为了提高植株再生率,把该技术应用于 更广泛的基因型上,尚需做进一步研究但 是,本研究结果表明,如果能从生长快的幼 嫩胚状体细胞悬浮中分离出原生质体的话, 则在细胞悬浮克隆丧失再生绿色苗的能力以 前(典型的为悬浮培养30周后),也能从禾本 科植物的原生质体再生出绿色苗.从培养在 含葡萄糖的高渗透势培养基上的细胞悬浮中 分离胚胎,产生原生质体是可行的.虽然从 这三种植物原生质体克隆中都得到了绿色苗 和白化苗,但只有苇状羊茅和多花黑麦草植 株能在土壤中建植.同多年生黑麦草相比,多 花黑麦草不易形成白化苗,但本研究中多花 黑麦草材料是特为胚胎反应选出来的,而苇 状羊茅和多年生黑麦草材料是普通栽培种. 禾本科植物,尤其是多年生黑麦草培养中, 白化苗的形成是进一步研究的主要障碍. 姚爱兴译自《PlantCell,Tissue andOrganCalture》, 1988,V.12,137~140. 王槐兰校