维生素B2检测方法

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 维生素 B2检测方法的研究进展 维生素 B2又称核黄素，是维持机体正常结构与功能的必需营养物质，具有多种生理功能， 参与碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢，促进生长发育；与呼吸链的能量产生有关；强化肝功能、 调节肾上腺素的分泌；保护皮肤毛囊黏膜及皮脂腺的功能；在维生素 B6、叶酸转化成辅酶及合 成色氨酸反应中也发挥着重要作用。维生素 B2缺乏可出现眼角炎、舌炎等一系列皮肤黏膜症状 〔1〕，并可以使脂质过氧化酶加重，必需脂肪酸代谢障碍〔2〕，使得大脑学习能力下降。维生 素 B2缺乏还与贫血、一些肿瘤的发生密切相关〔3〕。全国第4次营养调查明，居民膳食中维 生素 B2普遍缺乏〔4〕。随着人们对生活质量要求的提高，营养缺乏病的防治也越来越受到关注， 维生素 B2作为营养补充剂或者是功能调节因子被广泛用于保健食品和药品当中。因此，研究选 择一种快速准确的检测维生素 B2的方法对于营养缺乏病的诊断有着极其重要的意义。 1 传统分析方法 1.1 微生物法 干酪乳酸杆菌【Lactobacillus casei,LC】的生长需要维生素 B2,培 养基中若缺乏维生素 B2该细菌便不能生长。在一定条件下, LC 生长情况及其代谢物乳酸的浓度 与培养基中维生素 B2含量成正比,因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品中维生素 B2的 含量〔5〕。 1.2 荧光法 维生素 B2微溶于水，其溶液呈强的黄绿色荧光。在稀释液中其荧光强度 与核黄素的浓度成正比。根据这一特性以及荧光分光光度法的灵敏度高、仪器简单、选择性好 和测量快速等特点，荧光法〔6〕被广泛应用于维生素 B2的分析。但是该方法整个操作过程都 要求避光，不稳定、易受干扰。游离核黄素对光极为敏感，碱性条件下光照下即分解产生光黄 素，光黄素的三氯甲烷溶液具有较强的荧光发射， 在250 min 内荧光强度是稳定的，且不受光 的影响〔6〕，故可在最佳激发波长450 nm、最大发射波长510 nm 处测定〔7〕。因此在对游离型 核黄素的测定中，光黄素荧光测定法〔8，9〕被广泛应用。 1.3 分光光度法 是中国药典的方法并被广泛应用于维生素 B2的检测工作 中，它简便实用，不需要专门昂贵的仪器。但是用紫外分光光度法测定其含量所受影响因素较 多，实际操作过程比较繁琐，耗时较长，且水浴加热的温度对测定结果影响较大，因此重现性 不够理想。许多研究者在利用分光光度法测定维生素 B2时，都在药典方法的基础上做了一定改 进，表现在改进操作方法促进样品溶解〔10〕，或者改变溶剂溶液加速样品溶解〔11，12〕。 2 现代分析方法 2.1 电化学法 根据溶液的电化学性质（如，电极电位、电流、电导、电量等）与被 测物质的化学或物理性质（如，电解质溶液的化学组成、浓度、氧化态与还原态的比率等）之 间的关系，将被测定物质的浓度转化为一种电学参量加以测量。杨培慧等〔13〕采用循环伏安 法，探讨玻碳电极表面的电活化方法，利用 VB2在电极表面的吸附性，建立了对 VB2的定量分析 方法，获得满意结果。刘莺等〔14〕以液体石腊碳糊电极为工作电极，建立了核黄素在液体石 蜡碳糊电极上的伏安特性及脉冲伏安法测定，采用微分脉冲伏安法进行 VB2的定量分析。王怀 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 生等〔15〕采用碳糊电极对 VB2进行了研究，建立了测定 VB2的吸附溶出伏安法。 2.2 化学发光法【CL】 化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧 化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光 子【hM】,利用发光信号测量仪器测量光量子产额。谢志鹏等〔16〕发现，Na2SO3歧化反应的中 间态产物〔Na2SO4〕能与鲁米诺（Luminol）构成化学发光体系，通过高锰酸钾（KMnO4）的桥 梁作用，维生素 B2能使体系的发光强度减弱，其强度的下降值与维生素 B2浓度在一定范围内呈 良好线性关系，从而建立了测定维生素 B2的流动注射CL 新方法。张琰图等〔17〕基于水溶性 维生素在碱性介质中只有维生素 B1和维生素 B2，可与 K3Fe【CN】6直接氧化产生化学发光的原 理，建立了反相高效液相色谱【RP HPLC】分离柱后化学发光检测维生素 B1和维生素 B2的新方 法。CL 具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点，加上 RP HPLC 具有高效分离的特 性，使得 HPLC CL 成为一种有效的痕量及超痕量分析技术。 2.3 毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE），又称高效毛细管电泳【HPCE】, 是20世纪80年代后期在全球范围内迅速崛起的一种分离分析技术，它是以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度（即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上 移动的距离）和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，是近年来发展最快的分析 方法之一。很好地分离了维生素 B2黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸，并在检测复合维生素 〔18〕时对 B族维生素和烟酰胺也达到了很好的分离效果〔19〕。具有快速、高效、高灵敏度、 易定量、重现性好及自动化等优点，已广泛地应用于小分子、小离子、多肽及蛋白质的分离分 析研究〔20〕。紫外、荧光、电化学、质谱、激光等类型检测器均已运用于毛细管电泳技术，从 检测灵敏度的角度来说，毛细管电泳技术提供了很好的质量灵敏度，而高效液相色谱法具有良 好的浓度灵敏度。 2.4 HPLC 是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离，分离过程是 一个分配平衡过程。高效液相法因其样品前处理简单、样品用量少、分离速度快、可一次性分 析多种水溶性维生素而逐渐成为检测维生素 B2的常用分析方法，具有简便、快速、分辨率高、 检测限低的特点。采用 RP HPLC 测定维生素 B2时，固定相采用氰基柱或是氨基柱进行分离， 但综合分离效果及价格等各方面因素采用 C18反相色谱柱被较为广泛地应用于分离维生素 B2。 多数方法或采用流动相中加入胺类改性剂，以克服碱性维生素的峰脱尾现象〔20～22〕；或采用 两种流动相体系，以梯度洗脱〔21～26〕；或采用碱性去活色谱分离柱〔27〕；有的还需预柱进 行前处理〔22〕，但柱的平衡时间长，柱寿命短；或在分离测定中进行紫外扫描，对于不同组分 采用不同的检测波长〔22，27，28〕, HPLC 法的检测波长各不相同， 200～450 nm 的波长范围 内在267、375与444 nm 的波长处均有吸收，267 nm 为较多使用的检测波长。