红景天苷抗衰老和抑制黑色素作用研究

北 京 日 化 红景天苷抗衰老和抑制黑色素作用研究 胡国胜 王改香 上海相宜本草化妆品有限公司 Abstract： Rhodiola rosea has the effects of anti·oxygen and anti—aging．It has being reported that the main effective component is rhodioloside．In this pape~in vitro and in vivo tests were used to observe the effects of rhodioloside and the cream containing rhodioloside in anti—oxygen and anti-aging． The result showed that rhodioloside had satisfied effects of anti--oxygen and anti--aging and the cream containing rhodioloside was able to improve the skin color and the elasticity of skin．It can be used as a natural active ingredient for whitening and an ti—wrinkle． 摘要：红景天具有抗氧化和抗衰老作用，文献报道其主要有效成分为红景天苷，本文采用体外试验和人 体试用效果观察，对红景天苷及含有红景天苷的霜剂的抗衰老和抑制黑色素作用进行了观察。结果表明， 红景天苷具有较好的抗氧化和抑制黑色素的作用，含有红景天苷的霜剂能够改善皮肤色素，增加皮肤弹 性，可以作为较好的美白、抗皱天然植物活性成分。 红景天为景天科景天属(Rhodi ol a L．)多年生草本植物，主要分布在北半球的喜马拉雅山区、亚洲西 北部和北美洲，生长在海拔 1600~4000m的高寒、干燥、缺氧、强紫外线照射、昼夜温差大的地区，具 有极强的环境适应能力和生命力。我国应用红景天很早，在藏医 《四部医典》和李时珍的 《本草纲目》 中均有记载。 近年来的药理学研究表明，其主要药理活性成分为红景天苷及其苷元酪醇、酪萨维、红 景天素等。很多研究证明红景天苷具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基、增强记忆、改善睡眠 等多种药理作用 卜 。本文通过体外试验和人体试用试验，观察了红景天苷和含有红景天苷的霜剂的抗 衰老和美白功效。 1．与 1．1仪器与试剂 紫外可见分光光度计 (UV759S)，二苯 基苦 基 苯肼 (DPPH)(SIGMA 公司)，维 生素 E ((+)一0【一Tocophero1)(SIGMA公司)，L一酪氨酸(SIGMA公司)，酪氨酸酶(SIGMA公司)，维生素 C(SIGMA 公司)，红景天苷由上海市中药化研究中心提供，分子式：C14H2007；CAS：10338—51—9：高效液 相色谱法 HPLC>98％。其他试剂均为纯 。 1．2实验方法 1．2．1 DPPH自由基清除率的测 。] 6 北 京 日 化 将维生素 E用无水乙醇配成 0．2rag·mL 浓度的溶液备用，红景天苷用 50％K,醇稀释成一定浓度的 溶液，DPPH用无水乙醇配制成浓度为 2x10一mol·L。的溶液备用。 维生素E：反应总体积为5mL，在试管中加入4mLDPPH溶液，然后分别加入 lmL不同浓度的维 生素E无水乙醇溶液，充分混合，在室温下静止 lh，在 517nm波长处测定各吸光度。以无水乙醇为空 白调零，每一吸光度平行测 3次，取平均值按以下公式计算清除率： 清除率 (％)：(1-Ai-Ai)*100％ Ao 式中，Ai为加入维生素E后的DPPH溶液的吸光度 Ai为 DPPH的溶剂和维生素 E混合后的溶液的吸光度 A0为未加维生素 E的DPPH溶液的吸光度． 红景天苷：反应总体积为 5mL，在试管中加入 4mLDPPH溶液，然后分别加入 lmL不同浓度的红 景天苷溶液，充分混合，在室温下静止 1h，在 517nm波长处测定各吸光度。以50％无水乙醇为空白调 零，以下方法同维生素E，计算清除率。 1．2．2酪氨酸酶活性抑制率的测 】 将维生素 C用去离子水配成 2．0mg·mL 浓度 (现配现用)，L-酪氨酸用 pH=6．8的磷酸缓冲溶液配成 0．4 mg·mL 浓度的溶液备用，酪氨酸酶用磷酸缓冲液配置成 100u．mL～，红景天苷溶液用 50％乙醇稀释。 按下表准确量取 Al，A2，B1，B2四组反应液，均匀混合。置于 37~C水浴中恒温 10min，再在 ． AI， B1中分别加入0．5mL L．酪氨酸溶液混匀20min，迅速移入比色皿中，475nm测定。以缓冲液调零。 表 1—1 反应液组成 按下式计算对酪氨酸酶抑制率： 抑制率(％)：(1一．B1-B2)木100％ A1——A2 2． 结果与讨论 2．1 DPPH 自由基清除率的测定 2．1．1 DPPH的吸收光谱 通过全程扫描 (230nm~800nm)，实验选用 517nm为测定波长。 2．1．2维生素E反应时间与自由基清除率的关系 7 北 京 日 化 其他条件不变，实验考查了不同反应时间对自由基清除率的影响，其结果如下表2—1。 表 2-1 反应时间与自由基清除率的关系 以反应时间为横坐标，自由基清除率为纵坐标，作得曲线如图2．1。 57．30 56．70 56．60 56．5O 56．40 t／min 60 70 图2-1反应时间和自由基清除率的关系 从图中可以看出，随着反应时间的延长，自由基清除率逐渐增大，1h以后，增加趋于平缓，体系较 为稳定，故本实验选择的反应时间为 1h。 2．1．3维生素E浓度与清除DPPH的关系 在 DPPH用量为4mL、反应时间为 lh的反应体系下，维生素 E浓度与其对自由基清除率的关系由 表 2．2可知 表2．2 维生素E浓度与自由基清除率的关系 以维生素E浓度 (mg·mL )为横坐标，自由基清除率 (％)为纵坐标，做标准曲线如图2．2。 0 0．02 0．04 0．06 0．08 0．1 0．12 0．14 0．16 0．18 浓度／(mg．mL1) 图2．2维生素E浓度与自由基清除率曲线图 O 0 O O 0 O O O 0 0 0 O 0 0 0 0 0 0 0 O 0 0 O 0 0 0 0 0 0 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 96＼料 螟醐E{|皿 北 京 日 化 从图可知，随着维生素 E浓度的增大，其自由基清除率也愈大，表明清除自由基能力与浓度呈明显 的量效关系。在 0．02～0．16mg·mL 范围内，自由基清除率与维生素 E浓度呈现良好的线性关系，回归 方程为 y=5．1914+488．43x(其中Y为自由基清除率，X为维生素E的浓度)，相关系数 R=0．9965。其 IC50 为 0．09174 mg‘mL一。 2．1．4红景天苷浓度与自由基清除率的关系 按照方法 1．2．1实验，红景天苷浓度与 自由基清除率的关系如表 2—3 表2．3 红景天苷浓度与自由基清除率的关系 以红景天苷浓度 (mg·mL )为横坐标，自由基清除率 (％)为纵坐标，做标准曲线如图2-3。 O 0．0 1 0．O2 O．03 0．04 0．05 0．06 0．07 0．08 浓度／(mg．mE- ) 图2．3红景天浓度与自由基清除率的关系 从图可知，随着红景天苷浓度的增大，其 自由基清除率也愈大，表明清除自由基能力与浓度呈明显 的量效关系。当浓度增加到 0．04mg·mL 以后，清除率增加趋势缓慢。在 0．01～0．030mg·mL 范围内， 自由基清除率与红景天苷浓度呈现良好的线性关系，回归方程为 )r=1．612+2000．5x(其中 Y为自由基清 除率，X为红景天提取液的浓度)，相关系数 R=0．9970。其 IC50为 0．02419 mg·mL一。 2．2酪氨酸酶活性抑制率的测定 2．2．1恒温时间对酪氨酸酶活性抑制率的影响 按照表 1—1数据，加入酪氨酸酶，维生素 C和缓冲溶液，混匀，37~C水浴中分别保温 5min、10min、 15min、20min、25min时，计算维生素 C对酪氨酸酶的抑制率。结果如表 2-4 9 0 0 0 0 0 0 O 0 0 0 0 O O 0 O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O 0 0 0 0 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ％ 自 由 基 清 除 率 北 京 日 化 表 2-4 恒温时间与抑制率的关系 以恒温时间为横坐标，抑制率为纵坐标，作得曲线如图2—4。 图2-4恒温时间与抑制率的关系 实验选择恒温时间为 10min。 2．2．2反应时间对抑制率的影响 按照表 1—1数据，加入酪氨酸酶，维生素 C和缓冲溶液，混匀，37℃水浴中保温 10min，加入 0．5mLL． 酪氨酸溶液，反应 2min、4min、8min、12min、16min、20min、24min、28min、32min，计算维生素 C 对酪氨酸酶的抑制率。结果如下 表 2．5反应时间与抑制率的关系 以反应时间为横坐标，抑制率为纵坐标，作得曲线如图2．5 lOO．00 90．00 80．00 槲 70．OO 喾 60-00 50．O0 40．OO 30．O0 20．O0 图2．5反应时间与抑制率的关系 从图中可以看出，随着反应时间的延长，维生素 C对酪氨酸酶的抑制率逐渐增大，20min以后，增 加趋于平缓，体系较为稳定，故本实验选择的反应时间为 20min。 2．2．3维生素c的含量对酪氨酸酶活性的影响 在酪氨酸酶的量为 0．4mL、恒温时间为 lOmin、反应时间为 20min的反应体系下，维生素 C的浓度 与其对酪氨酸酶抑制率的关系由表 2-6，图2-6可知。抑制率随着浓度的增加而增加，当含量超过 0．1Omg， 10 北 京 日 化 呈明显的量效关系。在 0．005~0．020mg·mL 范围内，酪氨酸酶抑制率与红景天苷浓度呈现 良好的线性 关系，回归方程为y=14．82+2545．6x(其中y为酪氨酸酶抑制率，X为红景天苷的浓度)，相关系数R=0．9965。 其 IC50为 0．01382 mg·mL～。 上述结果表明，红景天苷具有较好的清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的作用，在抗衰老和美白化妆品中 具有广阔的应用前景。 3．含红景天苷霜剂对皮肤黑色素和皮肤弹性的影响 3．1测试方法 3．1．1测试仪器：德国CK MC一760皮肤测试仪 3．1．2测试对象：上海中医药大学美容学校的健康无皮肤病的女学生 (共 100名)，年龄范围：19-21岁， 平均年龄：20岁。 3．1．3测试方法 测试部位规定左右手臂内测为测试区域，以避免光照对于皮肤色度的影响。左侧涂含红景天苷的面 霜，用于黑色素测定，右侧涂含红景天苷的面霜，用于皮肤弹性测定，涂抹的面积要求在 5cm×5cm， 样品每次取 0．05g左右，相当于2mg／cm2。要求测试的部位每日涂抹一次含红景天苷的面霜，连续使用 48天。使用开始前先测试受试部位皮肤的黑色素含量等级和皮肤弹性值 (三次测量平均值)，作为对照 值，测试产品使用 48天后再次测试受试部位皮肤的黑色素含量等级和皮肤弹性值 (三次测量平均值)。 试验期间学生受试部位不涂抹其他任何化妆品。 3．2测试评价 含红景天苷的面霜使用后与使用前比较，黑色素含量等级减少 2个等级以上，皮肤弹性值增加 2个 等级以上，视为有效，黑色素含量等级减少 4个等级以上，皮肤弹性值增加 4个等级以上，视为有明显 有效，黑色素含量等级减少 6个等级以上，皮肤弹性值增加 4个等级以上，视为显著有效，黑色素含量 等级减少不到2个等级，皮肤弹性值增加 2个等级以下，视为无效。 效果评价公式： F 。=M 2一M 1 2 无效 Fm／x=M2一 1 [2，4) 有效 Fmid=M2一M1 [4，6) 明显有效 F。 =M2一M 1 6 显著有效 有效人数+明显有效人数+显著有效人数 总有效率= 总测定人数 12 × 100％ 北 京 日 化 式中： r一黑色素减少或者弹性值增加等级 一 产品使用后三次平均测定值 二产品使用前三次平均测定值 4人体皮肤测试结果 4．1含红景天苷的面霜美白效果的测试结果 从附表列出的测试结果归纳出含红景天苷的面霜的美白测试效果 (见表一)。由表一可以看出，人 体皮肤使用含红景天苷的面霜后，美白总有效率达到了90％。无效 l0人，有效 34人，明显有效 25人， 显著有效 31人。 表一：红景天幼白面霜美白效果分布表 效果等级 人数 ％ 总有效率 有效 34 34％ 9O％ 明显有效 25 25％ 显著有效 31 31％ 无效 10 10％ lO％ 合计 100 100％ 100％ 4．2含红景天苷的面霜皮肤弹性测试结果 从附表列出的测试结果归纳出含红景天苷的面霜的皮肤弹性测试效果 (见表二)。由表二可以看出， 受试者皮肤使用含红景天苷的面霜后，皮肤弹性数值增加了 88％。无效 12人，有效 34人，明显有效 31人，显著有效 23人。 表二：红景天幼白面霜改善皮肤弹性效果分布表 效果等级 人数 ％ 总有效率 有效 36 36％ 84％ 明显有效 27 27％ 显著有效 21 21％ 无效 16 16％ l6％ 合计 100 100％ 100％ 13 北 京 日 化 5结论 本次人体试用功效测试结果显示：含红景天苷的面霜具有美白和增加皮肤弹性的功效，其中含红景 天苷的面霜抑制黑色素的总有效率为90％，含红景天苷的面霜增加皮肤弹性的总有效率为84％。 参考文献 1． 崔艳梅等，红景天属植物化学成分及药理作用研究进展。华东师范大学学报，2008，06，44(3)： 328． 2．佟力等，红景天的药理作用研究进展。中外医疗，2008，(27)：137— 3． 彭长连，陈少薇，林植芳，等．用清除有机自由基 DPPH法评价植物抗氧化能力[J]．生物化学与生 物物理进展，2000，27(6)：658—661． 4．刘宇红，董银卯，李才广．皮肤美白剂抑制酪氨酸酶活性的研究[J】．日用化学工业，2001，(1)：21。23． (接40页)参考文献 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