枯草芽孢杆菌的介绍-第二版本

枯草芽孢杆菌的介绍 完成者：河岸 hkfced（http://blog.sina.com.cn/hkfced） 完成时间：2012-3-23 版本：第二版本 目 录 第一章 芽孢杆菌的简要介绍 ............................................................................................ 1 第一节 芽孢杆菌种类 ............................................................................................... 1 第二节 芽孢杆菌的达系统发展简史 ....................................................................... 2 第二章 枯草芽孢杆菌的转化系统 ..................................................................................... 3 第一节：常见转化方法.............................................................................................. 3 1 化学转化法..................................................................................................... 3 2 电转化............................................................................................................ 3 3 原生质体转化 ................................................................................................. 3 4 碱金属离子转化.............................................................................................. 4 5 质粒的其它转移方式....................................................................................... 4 第二节：标准操作..................................................................................................... 4 第一种方法：电转化 .......................................................................................... 4 第二种方法：Spizizen 转化 ................................................................................. 5 第三种方法：原生质体法(Takashi)....................................................................... 5 第四种方法：原生质体转化之二......................................................................... 6 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC 推荐）...................................................... 7 第三章 芽孢杆菌的表达系统 ............................................................................................ 8 第一节 芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） .............................................. 8 第二节 芽孢杆菌的缺点 ............................................................................................ 9 第三节 助表达系统 ................................................................................................... 9 第四节 芽孢杆菌基因表达的主要特点 ....................................................................... 9 第四章 枯草芽孢杆菌的转录翻译系统 .............................................................................. 9 第一节：转录系统................................................................................................... 10 第二节：翻译系统................................................................................................... 11 第五章 芽孢杆菌常用的宿主和载体 ............................................................................... 12 第六章 芽孢杆菌应用实例 ............................................................................................. 13 1 中国 .................................................................................................................... 13 2 日本 .................................................................................................................... 13 3 加拿大................................................................................................................. 14 第七章 芽孢杆菌的产品 ................................................................................................. 14 第一节 核苷类产品 ................................................................................................. 14 第二节 核黄素 ........................................................................................................ 14 第三节 微生物制剂/益生菌 ..................................................................................... 15 第四节 工业酶制剂 ................................................................................................. 15 第八章 结语 .................................................................................................................. 15 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 .................................................................................. 16 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 .................................................................................. 16 致谢及参考文献 ............................................................................................................. 17 1 第一章 芽孢杆菌的简要介绍 芽孢杆菌作为一个属，于 1872 年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆 菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其 调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。芽孢杆菌是一个泛泛的概 念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如 168 菌株及其大量的衍生菌株。枯草 杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及 大量的衍生菌株。 目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短 芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆 菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等 12 种。 第一节 芽孢杆菌种类 目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至 2011 年 10 月（目前远不 止这个数字，NCBI 公布的更多），在 KEGG 上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有： 简称 菌种名称 测序时间 测序链接 bsu Bacillus subtilis 1997 RefSeq bss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W23 2010 RefSeq bst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10 2011 RefSeq bsn Bacillus subtilis BSn5 2011 RefSeq bha Bacillus halodurans 2000 RefSeq ban Bacillus anthracis Ames 2003 RefSeq bar Bacillus anthracis Ames 0581 2004 RefSeq bat Bacillus anthracis Sterne 2004 RefSeq bah Bacillus anthracis CDC 684 2009 RefSeq bai Bacillus anthracis A0248 2009 RefSeq bal Bacillus cereus biovar anthracis CI 2010 RefSeq bce Bacillus cereus ATCC 14579 2003 RefSeq bca Bacillus cereus ATCC 10987 2004 RefSeq bcz Bacillus cereus ZK 2004 RefSeq bcr Bacillus cereus AH187 2008 RefSeq bcb Bacillus cereus B4264 2008 RefSeq bcu Bacillus cereus AH820 2009 RefSeq bcg Bacillus cereus G9842 2009 RefSeq bcq Bacillus cereus Q1 2009 RefSeq 2 bcx Bacillus cereus 03BB102 2009 RefSeq bcy Bacillus cytotoxis NVH 391-98 2007 RefSeq btk Bacillus thuringiensis 97-27 2004 RefSeq btl Bacillus thuringiensis Al Hakam 2006 RefSeq btb Bacillus thuringiensis BMB171 2010 RefSeq bwe Bacillus weihenstephanensis 2008 RefSeq bli Bacillus licheniformis ATCC 14580 2004 RefSeq bld Bacillus licheniformis DSM13 2004 RefSeq bay Bacillus amyloliquefaciens FZB42 2007 RefSeq bao Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 2010 RefSeq bae Bacillus atrophaeus 2010 RefSeq bcl Bacillus clausii 2005 RefSeq bpu Bacillus pumilus 2007 RefSeq bpf Bacillus pseudofirmus 2010 RefSeq bmq Bacillus megaterium QM B1551 2010 RefSeq bmd Bacillus megaterium DSM 319 2010 RefSeq bse Bacillus selenitireducens 2010 RefSeq bco Bacillus cellulosilyticus 2011 RefSeq bck Bacillus coagulans 2011 RefSeq bag Bacillus coagulans 36D1 2011 RefSeq 第二节 芽孢杆菌的表达系统发展简史 芽孢杆菌表达系统是在 70 年代从枯草芽孢杆菌，又称枯草杆菌（Bacillus subtilis）开始， 逐步扩展至其它种的。 枯草杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因表达系统是与其早期的遗传学工作 密切相关的。Spizizen 于 1958 年发现枯草杆菌 168 菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌的遗 传学工作不断深入和发展。美国俄亥俄州立大学 Bacillus 遗传保藏中心（BGSC， http://www.bgsc.org/）至 1999 年保藏的 168 菌株的遗传突变株就有 890 个。它牵涉到了诸多 营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma 因子、DNA 重组与修复以及正负调 控等各方面基因的突变体。70 年代发明了 DNA 重组技术以后，特别是发现金黄色葡萄球菌 的带有抗性标志的质粒可作为枯草杆菌的载体以后，克服了枯草杆菌只有隐秘性质粒的困难， 枯草杆菌基因工程的工作更是加速发展。迄今，已经在枯草杆菌及其近缘种中克隆和表达了 大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩。 将携有外源基因载体导入宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。大肠杆菌的 氯化钙转化法对枯草杆菌无效，所以枯草杆菌基因工程表达系统中的宿主菌株用的最广泛的 就是在 DNA 重组技术发明之前就可以进行感受态转化的 168 菌株及其突变体。Spizizen 感 受态转化的基本原理：是细胞在 Spizizen 最低盐培养基中形成一段饥饿、易于摄取外源 DNA 3 片段的时期。一般步骤是先将其在较为丰富的培养基中培养，然后转接到贫瘠的培养基中， 使其形成感受态（一般非常短暂）。有关感受态时期参与摄取外源 DNA 的几种蛋白及其摄 取机制已有初步的研究。 第二章 枯草芽孢杆菌的转化系统 第一节：常见转化方法 1 化学转化法 芽孢杆菌属不能够使用大肠杆菌常用的化学转化法，枯草芽孢杆菌表达系统中应用最为 广泛的的宿主菌株是在 DNA 重组技术发明之前就可进行感受态转化的 168 菌株（色氨酸缺 陷型）及其突变体。对于 B. subtilis 来说，自然感受态是对数生长后期在一种二元信号转导 系统的调节下形成的，需要一系列相关基因的调控。按照这些基因的功能和表达时间的先后， 它们被分为早期感受态基因和晚期感受态基因。其中早期基因主要对感受态的形成起调节作 用，并进一步促进晚期感受态基因的表达。而后者主要负责细胞对外源 DNA 的吸附、吸收 和重组。 B. subtilis 的自然感受态是在对数生长后期开始形成的。这种生理状态的形成受到感受 态信息素的调节，只有当细胞达到一定的数目（一般在对数后期）时，细胞所分泌到培养基 中的感受态信息素的浓度达到一定临界值时后，感受态才能被诱导形成。 2 电转化 对于绝大多数微生物来说电转化是常见的转化效率最高的一种方法，芽孢杆菌属首次使 用电转化方法转化出现在1989年，目前芽孢杆菌属内最常使用的B. subtilis的转化率已经达到 10 4 - 10 6。对于化学转化法，芽孢杆菌属形成感受态的时间并不好把握，另外由于其感受态 的形成受到诸多基因的控制，对于一些经过诱变的工业生产株，往往不能形成感受态，所以 在实际操作中，一般采用电转化将外源DNA导入宿主细胞。由于电转化方法具有操作简单、 实验结果重现性好、参数容易控制等优点，目前已被许多实验室用来进行芽孢杆菌的基因转 化。但是，电转化法的操作条件对转化效率影响很大，因此最佳条件的建立非常重要。影响 电穿孔转化率的几个主要因素包括感受态的制备方法、电击压力、感受态和DNA溶液中离 子浓度、复苏液的选择和复苏时间等。 3 原生质体转化 原生质体转化技术是 20 世纪 60 年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是将细胞 通过酶解破壁，使之成为球状的原生质体，然后与 DNA 混合于高渗缓冲液中，在聚乙二醇 （PEG）介导下，使原生质体-DNA 发生相互凝聚，进行遗传转化，然后在适宜的条件下再 生细胞壁，获得转化子的过程。原生质体转化开辟了育种工作的新途径。自 1953 年 Weibull 首次用溶菌酶酶解分离巨大芽孢杆菌的原生质体，1979 年 Chang 等[创立了原生质体转化技 4 术后，它很快应用在微生物中，并得到了证实，成功地实现了酵母菌、霉菌和细菌等微生物 的转化。B. subtilis 经过一定处理后能够形成原生质球，这种原生质球经聚乙二醇（PEG） 处理后，能再生细胞壁而成为转化细胞，这种转化的转化频率非常高，B. subtilis 原生质球 转化时有 80%细胞被转化。质粒 DNA 的单体、多聚体以及开环 DNA 都可以转化。线形质 粒 DNA 的转化效率大约为环状分子的 1%。最为重要的是这种方法能够转化不能形成感受 态细胞的 B. subtilis，另外许多其它种的芽孢杆菌也能够使用这种转化方法。但是这个质粒 转化系统在实际操作中应用较少，因为使用原生质体转化时，大质粒的转化效率较低。并且 原生质体的再生需要营养丰富的再生培养基，因此不能从再生培养基上直接选择营养缺陷型 标记的克隆子。 4 碱金属离子转化 碱金属离子转化法是新近发展起来的一种芽孢杆菌转化方法。碱金属离子诱导转化 B. subtilis 的标准程序如下：收集处于对数生长中期的菌体，先用 4.1 mol/L 的 KCl 溶液在 30 ℃ 处理，然后加入质粒，30 ℃静置 30 min，加入等体积的 70%的 PEG6000 溶液，缓慢混合， 30 ℃保温 10 min，再置于 42 ℃水浴 5 min，30 ℃冷却。上述 PEG 悬浮液经稀释后离心收 获菌体，用新鲜培养基悬浮，并在 37 ℃震荡培养 2 h，扩增后的细菌培养液即可涂布选择 性平板进行筛选。这种转化方法己知适用于 B. subtilis NB22 和短短小芽孢杆菌等菌株。在 所有的金属离子中，只有达到饱和浓度的 K+和 Cs+离子有效，在一定浓度内其转化率与 DNA 量成正比。这种方法的最大特点是线型质粒分子转化率虽然较环状分子低，但明显高于用线 型质粒转化感受态细胞。对于染色体 DNA 片段而言，情况正好相反，也就是说，稀土金属 离子转化法能特异性地转化质粒 DNA。 5 质粒的其它转移方式 此外，在枯草芽孢杆菌之间，以及枯草芽孢杆菌和大肠杆菌之间，还可以细胞融合相互 转移质粒。在苏云金芽孢杆菌中又发现了一种类似接合方式转移质粒的现象。 第二节：标准操作 第一种方法：电转化 实验试剂：GM:LB+0.5M 山梨醇；ETM:0.5M 山梨醇，0.5M 甘露醇，10%甘油；RM：LB+0.5M 山梨醇+0.38 甘露醇 电转仪：eppendorf 方 法 （ 本 人 亲 自 验 证 ， 使 用 的 菌 株 为 WB600 ， 质 粒 为 PWB980 ， http://blog.sina.com.cn/s/blog_60ea2d8f0100q173.html）： 1）新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于 5ml LB 培养基中，过夜培养.。 2）测量摇管内 OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的 OD 在 0.19-0.2 之间。培养 基为 50ml GM。37℃，200rpm 培养至 OD600=1.0（大约 3-4 小时）左右。 3）取全部菌液冰水浴 10 min，然后 5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。 5 4）用 40ml 预冷的电转缓冲液 ETM 洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此 漂洗 3 次。 5）将洗涤后的菌体重悬于等 500μl 的 ETM 中，每管分装 60μl. 6）将 60μl 感受态细胞中加入 1-6 μl 质粒，冰浴孵育 5min，加入预冷的电转杯（1mm） 中，电击一次。电转仪设置：2.0kv（另外我还尝试过 0.8kv，1.2kv），25μ F200Ω，1mm， 电击 1 次. （持续时间 4.5ms-5ms 之间） 7）电击完毕立即加入 1ml 复苏培养基 RM，37℃，200rpm，复苏 3h 后，涂板。37℃， 过夜培养 第二种方法：Spizizen 转化 取新鲜活化菌种一环接入装有 5mLGM1 培养基的试管中，37℃、200rpm 培养过夜，取 500μ L 菌液转接入相同的 GM1 培养基中，37℃、200rpm 培养 4-5 小时使菌体生长达到对 数期末期，然后取 0.75mL GM1 菌液接入装有 5mLGM2 培养基的试管中，37℃、200rpm 培 养 1.5 小时，制得感受态细胞，将待转化质粒 DNA 与 1mL 感受态细胞混匀后在 37℃静置 1 小时，然后 37℃，200rpm 震荡培养 1-1.5 小时，取适量菌悬液涂布选择培养基，37℃培养 24-48h 后，挑选转化子。 10×Spizizen 基本盐培养基(g/L)：(NH4)2SO4 2，K2HPO4 8.3，KH2PO4 6，柠檬酸钠 1.2，无离子水配制。0.1Mpa 压力下灭菌 20min。 Spizizen 基本培养基：10×Spizzen 基本盐培养基 100ml/L，50%(w/v)葡萄糖 10ml/L，色 氨酸母液（5mg/ml）10ml/L，琼脂 1.5%（w/v）。0.06Mpa 压力下灭菌 20min。 GM1 培养基和 GM2 培养基：母液 0.1Mpa 压力下灭菌 20min 后按下表混合。 母液 GM1 培养基 GM2 培养基 40%葡萄糖 100μ L 100μ L 20mg/mL 酸水解酪素 100μ L 50μ L 50mg/mL 酵母抽提物 100μ L 0μ L 20%(w/w)MgSO4.7H2O 5μL 40μL 10×Spizzen 基本培养基 500μ L 500μ L H2O 3195μL 3310μL 总体积 5000μ L 5000μ L 第三种方法：原生质体法(Takashi) 1、活化：从活化 24 小时新鲜的 CM 平板上挑取单个菌落，接种于 30ml CM 液体培养 基中，37℃过夜培养。 2、转接：次日取 2%菌液接种于新的 30ml CM 液体培养基中，培养 3h 左右，至 OD570 为 0.4~0.8。 3、收集菌体：取 30ml 菌液，4℃下 3500rpm 离心 10min，弃上清。用 10mlSMM 洗涤 两次。 4、制备原生质体：约用 6ml SMM 重悬，使 OD570 为 2.0，加入溶菌酶（终浓度 200μ g/ml）在 37℃慢摇作用 30min，制备原生质体。 5、原生质体高渗悬液的制备：3500r/min 离心 15min，弃上清。用 10ml SMM 洗涤一次。 原生质体重悬于 300μ l SMM 中，得到“原生质体高渗悬浮液”。 6 6、转化：将待转化的 40μ l 质粒 DNA（约 1μ g）与 10μ l CaCl2 溶液（2mol/l）混匀， 再与 50μ L 的 2*SMM 溶液混匀，加入 100μ l 待转化菌株的“原生质体高渗悬浮液”，混匀 后冰浴 10min， 加入 40%的 PEG4000 溶液 1800μ l，混匀后冰浴 1min 后立即加入 30ml HCP-1.5 溶液以终止 PEG4000 的作用；3500r/min 离心 15min，弃上清，收集转化后的原生 质体；用 5 ml HCP-1.5 溶液重新悬浮，30℃静置培养 3~5h.。 7 筛选：取 500μ l 菌液转至 5ml HCP-1.5 半固体培养基中，混匀。加入 kann（50μ g/ml） 抗性 HCP-1.5 再生平板中，37℃夹层培养。 CM 培养基 葡萄糖 1％，蛋白胨 1％，酵母抽提物 2％，牛肉膏 0.5％，NaCl 0.5％，pH7.2，115℃ 灭菌 15min 2*SMM 培养基 蔗糖 342.4g（1M），顺丁烯二酸 4.46g（0.04M），MgCl2·6H2O 8.12g（0.04M）加去 离子水定容至 1000mL，pH7.5，115℃灭菌 15min HCP-1.5 培养基 250ml 琥珀酸钠（2M PH7.3），酪蛋白水解物 5g，酵母抽提物 5g， MgCl2·6H2O 1.9g， 葡萄糖 5g， K2HPO4 3.5g ， KH2PO4 1.5g， 聚乙烯吡咯烷酮 15g ，115℃灭菌 15min 再生培养基：HCP-1.5 培养基加 2%琼脂 半固体 HCP-1.5 培养基：HCP-1.5 培养基加 0.8%琼脂 溶菌酶（一般用途）用水配制成 50mg/mL 溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。 第四种方法：原生质体转化之二 1、活化：从活化 24 小时新鲜的 LB 平板上挑取单个菌落，接种于 30mL LB 液体培养 基中，37℃过夜培养。 2、转接：次日取 10%菌液接种于新的 30mL LB 液体培养基中，培养 3h。 3、收集菌体：取 30mL 菌液，4℃3000rpm 离心 10min，弃上清。用 20mL SMMP 洗涤 一次。 4、破壁：制备原生质体：用 1mL SMMP(含 0.1mg/mL 溶菌酶），在 37℃作用 20min， 制备原生质体。 5、原生质体高渗悬液的制备：3000r/min 离心 10min，弃上清。用 10mL SMMP 洗涤一 次。 原生质体重悬于 500μ L SMMP 中，得到“原生质体高渗悬浮液”。 6、转化：将待转化的质粒 DNA50μ L（约 1μ g）与等体积的 2*SMM 溶液混匀，加入 500μ L 待转化菌株的“原生质体高渗悬浮液”，混匀后冰浴 30min， 室温放置 10 min。 7 复苏：取 500μ L 菌液转至 5mLSMMP 摇管中，37℃，150rpm 培养 5h 后，加入 kann （50μ g/mL）抗性再培养 5h。涂布在 kann（50μ g/mL）抗性平板上挑选转化子。 2*SMM 培养基： 蔗糖 172.2g（0.5M），顺丁烯二酸 2.23g（0.02M），MgCl2·6H2O 4.06g（0.02M）加 去离子水定容至 1000mL，pH7.0，115℃灭菌 15min SMMP 培养基： 蔗糖 172.2g（0.5M），顺丁烯二酸 2.23g（0.02M），MgCl2·6H2O 4.06g（0.02M），葡 萄糖 1％，蛋白胨 1％，酵母抽提物 1％，牛肉膏 0.5％，NaCl 0.5％，K2 HPO40.5%加去离子 水定容至 1000mL，pH7.0，115℃灭菌 15min CMR 完全再生培养基： 7 蔗糖 172.2g（0.5M），顺丁烯二酸 2.23g（0.02M），MgCl2·6H2O 4.06g（0.02M），葡 萄糖 1％，蛋白胨 1％，酵母抽提物 1％，牛肉膏 0.5％，NaCl 0.5％，K2 HPO40.5%，调 pH7.2～ 7.5，而后加入 1.5％的琼脂粉，115℃灭菌 15min. 溶菌酶（一般用途）用水配制成 50mg/mL 溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。 溶菌酶(原生质体转化)普通溶菌酶 0.22μ m 过滤灭菌后，用 SMMP 调制成 1mg/mL 的终 浓度。 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC 推荐） Competence development in B. subtilis is one of several stationary phase processes triggered by a nutritional downshift. Since the pioneering work of Anagnostopolous and Spizizen, number of protocols for preparing competent B. subtilis cells have appeared. The following method, modified by Ron Yasbin from protocols developed in the Frank Young lab at Rochester, was used routinely in Stan Zahler’s wonderful bacterial genetics course at Cornell. This protocol assumes that you use a spectrophotometer that accepts 16×125 mm test tubes. If your spectrophotometer, like mine, works only with cuvettes, simply increase the culture volume to 10 or 20 ml in a 250-ml Erlenmeyer flask. 1. Streak recipient strain on one-half of a Tryptose Blood Agar Base plate. Incubate overnight (18 hr) at 37°C. 2. Inoculate a few colonies into 4.5 ml of Medium A in a 16×125 mm test tube that lacks visible scratches. Mix the contents of the tube thoroughly. Read its optical density at 650 nm in the spectrophotometer. Adjust the OD650 to be 0.1-0.2, maintaining the volume at 4.5 ml. 3. Incubate at 37°C with vigorous aeration. Read the OD650 every 20 min, plotting OD650 against time on semi-log paper. After a brief lag, the OD should increase logarithmically—that is, they should fall on a straight line. Note the point at the culture leaves log growth—the graph points fall below the straight line. In B. subtilis genetics, this point is known as t0. It should take 60-90 minutes of incubation and occur at OD650=0.4-0.6. 4. Continue incubation for 90 minutes after the cessation of log growth (t90). Transfer 0.05 ml of this culture into 0.45 ml of pre-warmed Medium B in a 16×125 mm test tube. Set up one tube for each transformation you intend to perform, plus an extra for a DNA-less control. 5. Incubate the diluted cultures at 37°C with vigorous aeration for 90 min. At this point, the cultures should be highly competent. 6. Add 1 μg of DNA to the competent cells and incubate at 37°C with aeration for 30 minutes. 7. Plate aliquots of the transformed cells onto selective agar. 10× Medium A base: Yeast extract 10 g Casamino acids 2 g Distilled water to 900 ml Autoclave, then add: 50% glucose, filter-sterilized 100 ml 10× Bacillus salts (NH4)2SO4 20 g K2HPO4·3H2O 183 g KH2PO4 60 g 8 Na+citrate 10 g MgSO4·7H2O 2 g Water to 1000 ml Medium A Sterile water 81 ml 10× Medium A base 10 ml 10× Bacillus salts 9 ml Medium B Medium A 10 ml 50 mM CaCl2·2H2O 0.1 ml 250 nM MgCl2·6H2O 0.1 ml 第三章 芽孢杆菌的表达系统 生物安全性要求我们的宿主菌最好具有非致病性。而绝大多数芽孢杆菌恰恰能满足这一 要求，而且还具备了一些其他菌株所没有的优良特性。事实表明，芽孢杆菌可以作为一些原 核生物、真核生物和哺乳动物等的外源蛋白的表达宿主。有的已经大规模投入生产。 蛋白质分泌（Protein Secretion）是指蛋白质经由细胞膜向细胞外运输的过程，又称为易 位（Translocation）。蛋白质分泌是 Bacillus 的一大特点，蛋白质组学研究表明，B. subtilis 中至少有 4 种蛋白质分泌途径，大约有 300 个蛋白质可以被分泌到胞外。B. subtilis 中主要 的蛋白质分泌途径主要包括（1）Sec 分泌途径和（2）Tat 分泌途径，其它分泌途径有 ABC 转运子途径（ABC Transporter），主要用于细菌素等分子的输出；（3）Com 分泌途径，它与 B.subtilis 细胞感受态形成有关，负责此过程中外源 DNA 的结合和摄取，该过程是通过 ComGC、ComGE、ComGD 和 ComGG 这四个蛋白质实现的，经由该途径输出的蛋白质其 前体信号肽由第四类信号肽酶（Type IV SPase）切割。微生物将蛋白质分泌到胞外是为了实 现所需的生理功能。因 B.subtilis 蛋白质分泌功能发达，其主要的分泌途径可被用于外源蛋 白质的高水平分泌表达。蛋白质分泌机理和应用技术是 B. subtilis 研究的重要课。深入研 究其分泌途径的机理，有可能克服其中存在的分泌瓶颈，将 B.subtilis 改造成为一个优秀的 外源蛋白质分泌工厂。 第一节 芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） 1、非致病性：除个别种（炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌）外对人畜无害。 2、转化外源 DNA 的感受态系统也同样适用于转化重组 DNA。 3、质粒和噬菌体都可以作为克隆的载体。 4、细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷璧质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂 有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。 5、能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而 不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。例如：α 淀粉酶、蛋白酶及杀虫晶体蛋白等。 6、良好的发酵基础和生产技术，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。 7、没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体：在 E.coli 表达系统 中，若重组表达的外源蛋白质中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或者翻 译提前终止；而目标蛋白质产物形成包涵体会导致蛋白质不可溶，给分离纯化和回收目标蛋 白质造成麻烦。而 B.subtilis 表达系统在这两个方面都不存在问题。 9 第二节 芽孢杆菌的缺点 1、能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解。 2、能自发形成感受的的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低。 3、存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定。 第三节 助表达系统 芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统（参考文献：Tjalsma H, Bolhuis A, Jongbloed JDH, Bron S, Dijl JM (2000) Signal Peptide-Dependent Protein Transport in Bacillus subtilis: a Genome-Based Survey of the Secretome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 515–547.），利 用好这些有用的元件，就可以完成目的蛋白的高效分泌表达，从而避免讨厌的包涵体的形成！ 第四节 芽孢杆菌基因表达的主要特点 1、对数生长期后进入芽孢形成期，不同的芽孢形成阶段所表达的基因不尽相同。 2、多 Sigma 因子：RNA 聚合酶全酶由 5 个亚基（α 2 β β’ ）组成。 σ 因子的主要功能 是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后就不起作用了。芽孢 杆菌中已发现的 σ 因子有 7 种，而大肠杆菌只有 2 种。因而，大多数阴性菌的基因不能够在 芽孢杆菌中直接表达而需要更换启动子等元件。 3、核糖体结合为点（RBS）：枯草杆菌最典型的 SD 序列是―GGAGG‖，而大肠杆菌的 为―AAGGA‖。 4、大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，而芽孢杆菌只有一层细胞膜，因而 可以大量分泌蛋白至培养基中。通过计算机分析，枯草杆菌有将近 300 个 N 端具有信号肽 用来跨膜的蛋白。不过用来表达和分泌克隆基因的信号肽主要来自蛋白酶、淀粉酶和细胞壁 表层蛋白等。 总的来讲，人们选择不同种的芽孢杆菌作宿主，一般都有着极强的应用研究的目的。目 前许多实验室现在也在自主开发野生的芽孢杆菌表达系统，一是看中了其高效分泌表达的能 力；另外，对于菌剂产品来讲，将外源基因在芽孢杆菌中表达，可以大大延长产品的货架期。 第四章 枯草芽孢杆菌的转录翻译系统 构建表达载体常用的启动子序列比较 启动子名称 －35 区 间隔序列长度 －10 区 Ptrp TTGACA 17 TTAACT Ptyr-tRNA TTTACA 16 TATGAT Plac TTGACA 17 TATGTT PrecA CTGATG 17 TATAAT Para TTGACA 17 TACTGT λ PL TTGACA 17 GATACT λ PR TTGACA 17 GGTAAT SPO1 TTGACT 17 CATAAT P43 AGAAAT 15 GCGATT GTGAAA 17 TAAAAT 10 SacB TTGCAA 17 TAGAAT consensus TTGACT 17 TATAAT 枯草芽孢杆菌中的σ 因子 σ factor Gene(s) Function -35 spa cer -10 σ A(σ43,σ 55) sigA,rpoD Housekeeping/earlysporul ation TTGACA 17 TATAAT σ B(σ37) sigB General tress response RGGXTT RA 14 GGGTAT σ C(σ32) unknown Postexponential geneexpression AAATC 15 TAXTGYTTZT A σ D(σ28) sigD,flab Chemotaxis/autolysinflage llar gene expression TAAA 15 GCCGATAT σ H(σ30) sigh,spoOH Postexponential geneexpression;competen ce andearly sporulation genes RWAGGA XXT 14 HGAAT σ L sigL Degradative enzyme geneexpression TGGCAC 15 TTGCANNN σ E(σ29) sigE,spoIIGB Early mother cell geneexpression ZHATAX X 14 CATACAHT σ F(σ SPOIIAC ) sigF,spoIIAC Early forespore cell geneexpression ZHATAX X 15 CATACAHT σ G sigG,spoIIIG Late forespore cell geneexpression GHATR 18 GGHRARHTX σ K sigK,spoIVCB :spoIIIC Late mother cell geneexpression AC 17 CATANNNTA 其中 H 指 A/C;N 指 A/G/C/T;R 指 A/G;W 指 A/G/C;X 指 A/T;Y 指 C/T;Z 指 T/G. 第一节：转录系统 枯草芽孢杆菌σ A 因子所识别的启动子-35 区和-10 区与大肠杆菌类似，保守序列分别 为“TTGACA”和“TATAAT”。σ A 因子识别的启动子两区域之间的间距为 17~18bp，而其 他 RNA 聚合酶的则不定，多为 15~16bp。一般来说，当该距离偏离 17bp，无论大或小时， 启动子都会变弱。 在枯草芽孢杆菌中，许多启动子的-35 区上游富含 AT，该 AT 丰富区被称为转录增强区， 对基因转录非常重要；在-10 区的上游含有一个重要的 TGTG 基序（-16），这个区域的突变 会显著的减弱启动子的强。 另外，在-10 区到+1 之间通常也富含 AT，该特点主要是便于转录起始时促进 DNA 的局 部解链。对很多依赖于σ A 因子的枯草