高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄

[标签:标题1] 【摘要】 ：目的 建立同时测定双黄连口服液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素含量的高效液相色谱法。方法 采用VP-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：278 nm。结果 绿原酸在0.44～6.60 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为97.0%；黄芩苷在0.52～6.18 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为98.98%；连翘苷在0.20～2.04 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 3),平均回收率为103.55%；汉黄芩素在0.13～1.76 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为96.49%。结论 本方法简便可行、准确、快速,可用于双黄连口服液中上述4种成分的含量测定。 【关键词】 双黄连口服液　绿原酸　黄芩苷　连翘苷　汉黄芩素　高效液相色谱法　含量测定 　　Abstract：Objective To establish a HPLC method for the determination of chlorogenic acid, baicaliin, forsythin and wogonin in Shuanghuanglian oral liquid. Methods The column was VP-ODS C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid with gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was at 278 nm. Results The calibration curves were linear within the range of 0.44～6.60 μg (r＝0.999 1) for chlorogenic acid, 0.52～6.18 μg (r＝0.999 1) for baicaliin, 0.20～2.04 μg (r＝0.999 3) for forsythin (r＝0.999 3) and 0.13～1.76 μg (r＝0.999 1) for wogonin, respectively. The average recovery of them were 97.0% (RSD＝1.1%), 98.98% (RSD＝1.1%), 103.55% (RSD＝1.1%) and 96.49% (RSD＝1.1%), respectively. Conclusion The method is simple, practicable, accurate and rapid. It can be applied to content determination of chlorogenic acid, baicaliin, forsythin and wogonin in Shuanghuanglian oral liquid. 　　Key words：Shuanghuanglian oral liquid；chlorogenic acid；baicaliin；forsythin；wogonin；HPLC 　双黄连口服液由金银花、黄芩及连翘经提取精制而成,具有辛凉解、清热解毒功效,对于上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、病毒性肺炎等细菌和病毒感染性疾病有一定疗效。其中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素是其主要活性成分。2005年版《中华人民共和国药典》(一部)采用高效液相色谱法只测定了绿原酸、黄芩苷、连翘苷的含量[1],而且是采用包括甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸-水的不同流动相分别测定。本试验参照文献[2],通过优化色谱条件,建立了不经提取分离,利用梯度洗脱法同时测定上述4种成分含量的高效液相色谱法,具有简便可行、准确、快速的特点,减少了配制流动相的步骤和进样次数,提高了工作效率,取得了满意效果。 　　1 仪器与试药 　　岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪；SPD-10Avp紫外可见检测器；CLSS-VP色http://www.jhlyzz.cn/qiyecaiwuguanlilunwen.html谱工作站；CTO-10ASvp柱温箱；7725i手动进样器。绿原酸对照品(批号110753-200212)、黄芩苷对照品(批号110715-200514)、连翘苷对照品(批号110821-200609)、汉黄芩素对照品(批号110514-200403)均由中国药品生物制品检定所提供。双黄连口服液由中国人民解放军252医院药剂科提供,批号20070115、20070121、20070212。甲醇、乙腈均为色谱纯,磷酸为分析纯,水为三蒸水。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件与系统适应性试验 　　色谱柱：岛津VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)(A＋B＝100%)作梯度洗脱, t＝0→6 min,A：27%；t＝6→10 min,A：30%；t＝10→15 min,A：60%；t＝15→25 min,A：90%；流速：1.0 mL/min；检测波长：278 nm；柱温：25 ℃；进样量20 μL。在上述色谱条件下,4种待测组分与邻近组分达到了基线分离,理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3 000。 　　2.2 溶液的制备 　　2.2.1 对照品溶液的制备 　　精密称取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品适量,置10 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别制成浓度为1.10、1.03、0.51、0.44 mg/mL的对照品母液。 　　2.2.2 供试品溶液的制备 　　精密吸取双黄连口服液1.0 mL,置50 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。 　　2.2.3 阴性对照溶液的制备 　　按处方比例及制备工艺,分别制备缺金银花、黄芩、连翘的阴性对照样品,按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。 　　2.3 线性关系考察 　　分别精密吸取绿原酸对照品母液0.20、0.40、0.75、1.50、3.0 mL,黄芩苷对照品母液0.25、0.50、1.0、2.0、3.0 mL,连翘苷对照品母液0.20、0.40、0.60、1.20、2.0 mL,汉黄芩素对照品母液0.15、0.25、0.50、1.0、2.0 mL,对应加入10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成5个浓度的混合对照品溶液,进样测定,色谱图。以峰面积为纵坐标,分别以绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素进样量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程。绿原酸：Y＝1.04×107X＋1.40×105, r＝0.999 6；黄芩苷：Y＝3.87×106X－1.26×104,r＝0.999 9；连翘苷：Y＝6.44×105X＋1.74×104,r＝0.999 9；汉黄芩素：Y＝6.30×106X＋1.45×105,r＝0.999 9。结果表明,绿原酸进样量在0.44～6.60 μg范围内,黄芩苷进样量在0.52～6.18 μg范围内,连翘苷进样量在0.20～2.04 μg范围内,汉黄芩素进样量在0.13～1.76 μg范围内,线性关系良好。 　　2.4 精密度试验 　 精密吸取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素混合对照品溶液注入液相色谱仪,连续进样5次,绿原酸峰面积RSD＝1.12%,黄芩苷峰面积RSD＝0.86%,连翘苷峰面积RSD＝0.72%,汉黄芩素峰面积RSD＝0.58%。结果表明,所选方法精http://www.zidir.com/html/zzlw/mzzy/密度良好。 　　2.5 稳定性试验 　精密吸取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样,测定样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的峰面积,结果绿原酸RSD＝1.74%,黄芩苷RSD＝2.04%,连翘苷RSD＝1.81%,汉黄芩素RSD＝2.38%,表明样品溶液在24 h内稳定。 　　2.6 重复性试验 　 精密称取同一批号5份样品,按供试品溶液制备方法制备,进样,记录峰面积,结果绿原酸RSD＝1.48%,黄芩苷RSD＝1.53%,连翘苷RSD＝1.34%,汉黄芩素RSD＝1.58%,表明方法重复性良好。 　　2.7 阴性对照试验 　 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,绘制色谱图。结果阴性对照溶液在供试品溶液及对照品溶液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素保留时间相应位置上均无吸收峰出现,表明阴性对照无干扰。 　　2.8 加样回收率试验 　　精密量取同一批号0.2 mL双黄连口服液4份于50 mL容量瓶中,分别加入绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品溶液适量,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤。按“2.1”项下色谱条件进样测定其含量,计算加样回收率,结果见表1。表1 绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素回收率测定结果(略) 　　2.9 样品含量测定 　　取3批样品,按“2.2.2”项下方法分别制成供试品溶液,精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,用外标法计算样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的含量,结果见表2。表2 样品含量测定结果(略) 　　3 讨论 　　3.1 供试品溶液制备方法的选择 　　2005版《中华人民共和国药典》(一部)高效液相色谱法测定绿原酸的含量时对供试品溶液处理采用加水稀释样品的方法,测定黄芩苷的含量时采用50%甲醇超声处理20 min,测定连翘苷的含量时采用过中性氧化铝柱洗脱。文献报道也多采用上述方法[3-6]。我们在试验中观察到：50%甲醇超声处理20 min与50%、100%甲醇溶解、过滤所得色谱峰的峰面积结果无明显区别,而溶解过滤操作更为简便易行,所以,选择甲醇溶解过滤供试品。制备供试品溶液使用纯甲醇和50%甲醇做溶剂所得色谱峰的峰形、峰面积均无明显区别,从节约成本的角度出发,本试验最终选择50%甲醇溶解、过滤制备供试品溶液。 　　3.2 检测波长的选择 　 本试验对绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素4种对照品进行了200～400 nm紫外光谱扫描,结果表明,绿原酸在218 nm处有较强的吸收,在240 nm和295 nm处有次强吸收；黄芩苷在278 nm处有较强的吸收,在315 nm处有次强吸收；连翘苷在228 nm处有较强的吸收,在278 nm处有次强吸收；汉黄芩素在278 nm处有一个最大吸收峰。考虑到连翘苷和汉黄芩素在样品中含量较低,而绿原酸和黄芩苷在样品中含量较高,为了http://www.zidir.com/html/lglw/gysj/提高连翘苷和汉黄芩素检测灵敏度,以选择汉黄芩素的最大吸收波长278 nm作为检测波长,提高汉黄芩素的检测灵敏度,减少4个成分峰之间峰高的差别。 　　3.3 流动相的选择 　　我们在试验中发现,甲醇与水混合压力明显增高,而乙腈同样与水混合并不如此。与甲醇相比,乙腈的洗脱能力强,且粘度较小,柱压大小比较合适,可以满足色谱系统流速在1.0 mL/min条件下检测的要求,并且系统分离效果较好,峰形对称,柱效高,保留时间适宜。因此,综合来看,乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。试验中观察到,乙腈-磷酸比乙腈-水做流动相所得的色谱峰要稍微敏锐,拖尾减少。而且,我们曾经尝试对磷酸的浓度进行0.1%～1.0%调节,发现在此范围内对峰形的变化无明显影响,从保护色谱柱的角度考虑,决定采用乙腈- 0.2%磷酸溶液作为流动相。 　　3.4 洗脱方式的选择 　　本制剂为中药复方,成分较复杂,且黄芩苷与汉黄芩素分别为黄酮苷和黄酮苷元,极性差别较大,采用等度洗脱法难以达到有效分离。曾选用乙腈-0.2%磷酸(30∶70)的色谱条件,绿原酸与邻近组分分离效果不佳,而汉黄芩素的对照品在40 min左右出峰,保留时间明显延长,样品溶液在同一保留时间里未发现相应的色谱峰。采用梯度洗脱的方法,在检测过程的前6 min保持乙腈的比例为27%,使绿原酸与邻近组分达到基线分离；6～25 min将乙腈的比例逐步提高到90%,一方面缩短汉黄芩素的出峰时间,更重要的是通过大幅度增加乙腈的浓度来提高洗脱效果,结果汉黄芩素对照品在22.5 min左右出峰,供试品与对照品在同一保留时间里有一相应的色谱峰,分离效果较好,峰形对称。在此条件下,黄芩苷和连翘苷的保留时间适宜,峰形对称,分离度好,从而可以将上述4种成分同时测定。 【参考文献】 　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.405－406. 　　[2] 金永新,要林青,杨晓冬,等.RP-HPLC法同时测定复方鱼腥草片中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量[J].中国药师,2004,7(7)：524－526. 　　[3] 刘 芳.高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸的含量[J].湖北中医杂志,2003,25(9)：46－47. 　　[4] 陈玉谊.HPLC测定双黄连口服液中黄芩苷的含量[J].海峡药学,2003, 15(4)：47－48. 　　[5] 张玉洁,黄海欣.HPLC测定双黄连口服液中连翘苷的含量[J].华西药学杂志,2005,20(4)：360－361. 　　[6] 方崇波.高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J].医药导报,2004,23(12)：951－952