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氟铁龙制备体系中氟尿苷和氟尿嘧啶的HPLC分析研究

2012-08-13 3页 pdf 105KB 17阅读

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氟铁龙制备体系中氟尿苷和氟尿嘧啶的HPLC分析研究 l雹E圃 2002年第1 1期 科技进展((Advances Science&Technology~ 氟铁龙制备体系中氟尿苷和氟尿嘧啶 的 HPLC分析研究 杜迎翔 王志祥 邹志红一 (中国药科大学分析化学教研室,南京 210009 *中国药科大学化工原理教研室,南京 210009,**东南大学化学化工系,南京,210096) 摘要 用反相高效液相色谱法对氟铁龙制备体系中氟尿苷和氟尿嘧啶进行了定量分析。色谱柱为 shim—Pack CI.,C— ODS(150mm×6.0mm)不锈钢柱 ,流动相为甲醇一0...
氟铁龙制备体系中氟尿苷和氟尿嘧啶的HPLC分析研究
l雹E圃 2002年第1 1期 科技进展((Advances Science&Technology~ 氟铁龙制备体系中氟尿苷和氟尿嘧啶 的 HPLC分析研究 杜迎翔 王志祥 邹志红一 (中国药科大学分析化学教研室,南京 210009 *中国药科大学化工原理教研室,南京 210009,**东南大学化学化工系,南京,210096) 摘要 用反相高效液相色谱法对氟铁龙制备体系中氟尿苷和氟尿嘧啶进行了定量分析。色谱柱为 shim—Pack CI.,C— ODS(150mm×6.0mm)不锈钢柱 ,流动相为甲醇一0.02mol/L磷酸二氢钾溶液 (15:85),氟尿苷、氟尿嘧啶和酶催化 反应液中其它组分间均达完全分离。所建方法简便准确,重现性好 ,专属性强。 关键词 氟尿苷 氟尿嘧啶 高效液相色谱 氟铁龙是一种新型的抗肿瘤核苷酸药物 ,可用于 治疗消化系统癌、头颈部癌、肺癌、大肠癌等,具有毒 性低、疗效高、口服易于被吸收和肿瘤组织中血药浓 度高等优点。氟铁龙起初用化学合成法生产,但步骤 多,化学过程复杂,产率低;酶法合成氟铁龙则专业性 强,操作简单、产率高且不易造成环境污染[ 。后者 的关键步骤之一是尿苷和氟尿嘧啶在酶催化下生成 氟尿苷,因此准确测定反应体系中氟尿苷和氟尿嘧啶 的含量,不但可以优化反应条件,达到制备过程控制 的 目的 ,而且还能为氟尿苷的质量控制提供有效的分 析手段。本文建立了上述反应体系中氟尿苷和氟尿 嘧啶的高效液相色谱测定方法,此法操作简便,专属 性强,结果可靠。 口 述 曼 氟尿苷和氟尿嘧啶对照品由中国药科大学微生 物教研室提供 :甲醇、磷酸二氢钾均为分析纯,水为重 蒸馏水;其它试剂除特别注明外均为分析纯。 Lc—l0 AT高效液相色谱仪 (日本岛津),sPD— l0 A紫外检测器 (日本岛津),wDL一95色谱数据工 作站 (大连化学物理研究所 );2100型紫外可见分光 光度计 (日本岛津)。 目 塞堕 2.1 色谱条件 色 谱 柱 :Shim—Pack CLC--ODS (150 mm x 6.0mm)不锈钢柱 ,流动相 :甲醇一0.02 mol/L磷酸二 一 42 一 氢钾溶液 (15:85),柱温:0—5 cI=,进样量:20 ,流 速 :1 mL/min,检测波长 :254 am。 2.2 标准溶液的配制 精密称取氟尿苷和氟尿嘧啶对照品各约 20 mg, 分别用水溶解,并稀释成浓度各约 200 g/mL的氟尿 苷和氟尿嘧啶标准溶液,作为储备液,置冰箱中冷藏 保存。 2.3 样品溶液的制备 将酶催化反应液振荡混匀 ,吸取约 1.5 mL,置 于 离心管 中离心 10 rain,再准 确吸取 上清液 l0— 1 000 置于 1 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇 匀,作为样品溶液。 2.4 样品测定 准确吸取约 200/~g/mL的氟尿苷和氟尿嘧啶储 备液适量,用水稀释成含氟尿苷和氟尿 嘧啶各约 20/~g/mL的标准混合溶液。分别取上述标准混合溶 液和样品溶液各 20 进样,记录色谱图,测定峰面 积,按外标法计算氟尿苷和氟尿嘧啶的含量。 囵 塞堕缝墨 3.1 专属性和 系统适用性试验 按实验方法配制样品溶液,含氟尿苷和氟尿嘧啶 各约 20/~g/mL的标准混合溶液,分别取上述溶液各 20 进样,记录色谱 图,结果显示标准混合溶液和 样品色谱 中,氟尿苷和氟尿嘧 啶的保 留时 间一致 ,分 别为 tR(氟尿苷) 11.4 min,tR(氟尿嘧啶) 5.7 min,两组分间分离完全,且反应液中其它组分对氟尿 维普资讯 http://www.cqvip.com 科技进展(Advances Science&Technology~ 2002年第1 1期 I雹E珊 苷和氟尿嘧啶无干扰,其中酶催化反应样品溶液的 HPLC图谱见图 1。可见 此法的专属性强 ,可用于酶 催化反应体系中氟尿苷和氟尿嘧啶的定量分析。 0 图 1样品溶液的高效液相色谱图 1.氟尿嘧啶 ;2.氟尿 苷 以氟尿嘧啶为标准,按 /7,=5.54(ta/Wl/2) 计算 色谱柱的理论塔板数为 4 700。 3.2 线性范围 准确吸取 200 g/mL的氟尿苷和氟尿嘧啶储备 液适量,用水定量稀释成分别含氟尿苷和氟尿嘧啶均 为 1.0、4.0、7.0、10.0、30.0、60.0、90.0~g/mL的标准 混合溶液,按实验方法进行 HPLC测定,分别以氟尿 苷和氟尿嘧啶的峰面积 A氟尿苷、A氟尿嘧啶对其浓度 c氟尿苷、c氟尿嘧啶进行线性回归,得回归方程分别为 A氟尿苷=50.68+9.997×10 C氟尿苷(r=0.999 7), A氟尿嘧啶=61.12+1.804×104 C氟尿嘧啶(r=0.999 5)。 显然,氟尿苷和氟尿嘧啶在 1~90~g/mL范围内均有 良好 的线性关 系。 3.3 回收率试验 取 己知浓度的酶催 化反应液 ,按“2.3”项 下方法 处理得上清液 ,准确吸取适量 ,置于 1 mL容量瓶 中, 加适量 200~g/mL的氟尿苷和氟尿嘧啶储备液,用水 稀释至刻度,摇匀,按“样品测定”项下方法测定氟尿 苷和氟尿嘧啶的浓度,并计算回收率,表 1显示了上 述回收率试验的结果。显然,此法的回收率较高,符 合定量分析的要求。 表 1 回收率试验结 果 * 1 mL样 品溶液 中氟尿苷和 氟尿嘧啶的浓度 。 3.4 精密度和重现性试验 按 实验方 法配制含氟尿苷和氟尿嘧啶各 为 19.82~g/mL和 20.22~g/mL的标准混合溶液,取 20 止 进样 ,记录色谱图,进行 HPLC测定,得氟尿苷和 氟尿嘧啶的峰面积 A氟尿苷、A氟尿嘧啶,重复测定 5次, 结果分别为 A氟尿苷=1.982×10 ,1.970×10 ,1.995 × los ,2.012×10 ,1.976×10 ,A氟尿苷(平均 )=1.987 ×10 ,RSD =0.84% ,A氟尿嘧啶 =3.628× 10 ,3.631× 10 ,3.666×los ,3.683× 10 ,3.603× 10 ,A氟尿嘧啶 = 3.642×los ,RSD=0.88% 。 取同一批酶催化反应液,按实验方法配制样品溶 液,并进行 HPLC分析,按外标法测定氟尿苷和氟尿 嘧啶的含量,重复测定 5次,结果分别为,氟尿苷 (~g/mL):776.5,783.1,791.4,802.9,782.7,平均值 = 787.3,RSD=1.3%,氟尿嘧啶 (~g/mL):3 330,3 356, 3 341,3 320,3 312,平均值 =3 332,RSD=0.52%。可 一 43 — 维普资讯 http://www.cqvip.com I囵罾圃 2oo2年第”期 科技进展((Advances Science&Technology) 见此法的精密度和重现性良好。 3.5 稳定性试验 按实验方 法配 制含氟 尿苷 和氟尿嘧 啶各 为 19.82 g/mL和20.22 g/mL的标准混合溶液,于 30 d内每 3 d进样一次,测定氟尿苷和氟尿嘧啶的峰面 积,结 果 表明,两者 峰 面积 未发 现 减小,RSD < 0.48%,说明此溶液至少在 30 d内稳定。 3.6 样品分析 取酶催化反应液 4批,分别按实验方法处理,配 制样品溶液,用外标法测定氟尿苷和氟尿嘧啶的含 量,重复测定 5次,4批样品的测定结果见表 2。 褒 2 氟尿苷和氟 尿嘧啶的测定 结果 (,l=5) 批 氟尿苷 次 含量/(ttg/mL)RSD/(%) 氟尿嘧啶 含量/( mL)RSD/(%) ■ 过 迨 4.1 色谱体系的选择 本文考察了 Spherisorb Cl8(150 mill×4.6 mm)和 Shim--Pack CLC--ODS(150 mm×6.0mm)两种色谱柱 中,酶催化反应液中各组分的分离情况,发现以前者 作为色谱柱时,氟尿嘧啶峰和相邻的样品中其它组分 峰分离不完全,而以 Shim--Pack CLC--ODS为色谱 柱,则不但氟尿苷、氟尿嘧啶和酶催化反应液中其它 组分间均能完全分离,而且一次进样所需的分析时间 较短,故本文选择后者作为色谱柱。此外,流动相中 甲醇比例对分离的影响结果表明,氟尿苷和氟尿嘧啶 两组分保留时间均随甲醇比例的增加而缩短,最后确 定流动相最佳配比为甲醇一0.02 mol/L磷酸二氢钾 溶液 (15:85)。 4.2 柱温的影响 氟尿苷、氟尿嘧啶和酶催化反应液中其它组分的 保留时间均随柱温的升高而缩短,柱温越高,各组分 间的分离度就越小,故本文采用冰浴控制柱温在 0— 5 cI=,可确保氟尿苷、氟尿嘧啶和酶催化反应液中其它 组分间完全分离。 参考文献 [1] Hori N,Uehara K,Mikami Y,et a1.Biosci Biotech Biochem,1992,56(4):580 (收稿 日期 2002—08—13) Quantitative Analysis of Fluorouracil and Fluorourdine in The Enzymatic Synthesis System of Futielong By RP—-HPLC Du Yingxiang Wang Zhixiang Zou Zhihong (Department of Analytical Chemistry,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009 * Department of Chemical en~neering,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009, **Department of Chemistry and Chemical engineering,Southeast University,Nanjing 210096) Abstract A RP—HPLC method for the determination of fluorouracil and fluorouridine in the enzymatic synthesis system of Futielong Was established.A 1 50mm ×6.0mm Shim—Pack CLC—ODS column with a mobile phase consisting of methanol一0.02 mol/L KH2PO4(15:85)Was used.Fluorouracil,fluorouridine and the other components in samples can be separated completely.The propo sed method is simple,accurate,reproducible and selective. Key words fluorouracil fluorouridine HPLC 一 44 — 维普资讯 http://www.cqvip.com
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