食用合成色素的测定

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 食用合成色素的测定 核心提示：天然食品及食品原料多数本身具有特有的色泽和香味，人们在长期的生活习惯中也 认识了各种食品应有的色泽，食品的色泽已经成为食品 天然食品及食品原料多数本身具有特有的色泽和香味，人们在长期的生活习惯中也认识 了各种食品应有的色泽，食品的色泽已经成为食品的一个重要感官指标。然而，食品在保存及 加工过程中，其色泽往往会有不同程度的变化，为了改善食品的色泽，使食品尽可能恢复原来 的颜色，除采取一定护色外，往往还得添加一定量的食用色素，进行着色。 食用色素就来源可分成两大类：天然色素和合成色素 天然色素的优缺点： 1、优点： ⑴ 其色素是从一些动物、植物组织中提取出来； ⑵ 安全性高； 2、缺点： ⑴ 稳定性差（对光、热、酸、碱等条件敏感）； ⑵ 着色能力差； ⑶ 难以调出任意的色泽； ⑷ 资源短缺，不能满足食品工业的需求； ⑸ 价格昂贵。 合成色素优缺点： 1、优点： ⑴ 资源十分丰富（来自于煤焦油及其副产品）； ⑵ 稳定性好、色泽鲜艳、着色力强、能调出任意颜色； ⑶ 价格低廉； ⑷ 应用广泛； 2、缺点： ⑴ 毒性较大（因为属合成所以毒性大，有的甚至致癌）； ⑵ 食用剂量加以限制。 对合成色素在测定时采用的几大步骤如下： 样品前处理→提纯→分离→鉴别（何种色素）→定量（此色素含量是否超标） ⑴ 前处理方法有：前处理不外乎是将样品打浆或者将着色部分用刀刮下，定容、吸附、解吸等 方法处理； ⑵ 提纯的方法 （1） 羊毛染色法：此法应用较广泛，主要是简单，材料容易弄到，操作也方便。缺点为：要 在热的酸性条件下吸附色素，用氨溶液解吸色素时，往往色素起变化。当溶液中含量低时（色 素含量低），用羊毛染色法吸附色素不完全，回收率低； （2） 聚酰胺粉法：此法是分离两种以上的色素，是目前比较理想的方法，因为食品中大多数 使用拼色。聚酰胺粉在酸性溶液中能与人工合成色素牢固地结合，并能在很稀的溶液中吸附色 素，但对天然色素的吸附不紧密，能被甲醇-甲酸洗脱下来； 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 （3） 离子交换法 （4） 分子筛分离法 ⑶ 目前分离方法 （1） 滤纸层析法；（2） 薄层层析法；（3） 柱层析法；（4） 电泳法 ⑷ 色素鉴定方法 （1） 采用纸层析法进行定性（与样进行对照 Rf）； （2） 采用薄层层析、比色的方法进行定量。 在食品中添加色素，经常是由两种以上的色素配合而成的拼色，对色素的测定，先处理、提纯， 然后把每一种色素要分离开，再对每一种色素的量进行定量。 目前，在食品行业中使用单一色素已经比较少，大多数使用复合色素方可达到比较满意色泽， 因而给分析工作者带来一定困难。目前合成色素的测定方法主要有：(1)薄层层析法；(2)高效 液相色谱法。 一、薄层层析法（聚酰胺粉法） 1、原理 聚酰胺是具有二极性的化合物，在酸性条件下与水溶性酸性染料结合，而与天然色素、蛋白质、 脂肪、淀粉等物质分离，然后再在碱性条件下解吸色素，再在薄层层析法进行分离鉴别，与标 准比较定性、定量（纸层析进行定性，薄层层析进行定量）。 2、操作步骤 食品其形态是千变万化的，添加在食品中的色素方式亦是各种各样的，有的拼色加入，有的加 在食品的层几个色素点，有的覆盖一层色素, 有的用色素和鸡蛋，很形象地作成传说中的故 事、动物、花卉以及象征丰收、延年益寿、节日愉快、生日快乐等附在食品的最显眼的地方， 属于这类食品的有中式糕点、西式糕点，还有饮料、小食品等色素的测定。样品不同，处理方 法则就不一样。 ⑴ 样品表面色素的测定 如中式、西式、生日蛋糕、节日寿糕一类，首先将代表性的样品整体称重，重量，然后分 别取下相同着色部分，进行提取和分离，不要将部分着色样品和整个或大部分不着色样品混在 一起。如果这样，分离就困难，而且增加分离误差，使结果偏差大，例如一块蛋糕重500g，取 下色素部分经测定是50mg，表示500g 重的含量即万分之一。 ⑵ 样品外皮色素的测定 如儿童食品中的糖豆、朱古力豆、红心果等样品，只需将外表皮色素用少量的水溶下来（在用 水溶解之前，先称重量并记录），并定容一定体积（将没有色素的样品弃去），供检验用，其计 算与上面一样。 ⑶ 非酒精性饮料中色素的测定（各种汽水、桔子汁等） (1) 吸附 吸50ml 样→与烧杯中→在电炉上加热至沸→不断搅拌除 CO2→加1g 聚酰胺粉（60℃活化1小时） →充分搅拌→使色素完全被聚酰胺粉吸附→用布氏漏斗过滤→用80℃热水20ml 洗沉淀物→用 甲醇-甲酸（6︰4）20ml 再洗沉淀物（除天然色素）→直到滤下来溶液无色→再用80℃热水150ml 分次洗沉淀物。 (2) 解吸 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 在不抽滤条件下，将9︰1乙醇氨液加在沉淀物中使吸附在聚酰胺粉上的色素全部解脱下来，收 集于蒸发器中，水浴中浓液到5ml 左右，加3滴20%柠檬酸溶液（使色素稳定），定容10ml，供薄 层点样用。 (3) 注意事项 样品在加入聚酰胺粉之前，要用20%的柠檬酸调节 pH=4（聚酰胺粉末在弱酸性溶液中对色素吸 附力强，吸附亦完全）。 如果样品不含天然色素，除 CO2后直接加聚酰胺吸附。 ⑷ 对各种糖果色素的测定 1) 样品处理 a. 硬糖（不含蛋白质、淀粉）粉碎→称样3g→加50ml 水溶解→再加30%柠檬酸3滴调 pH=4 b. 软糖（含淀粉高果饴）除外层冰糖屑→切碎→加50ml 热水溶解→用20%柠檬酸调 pH=4 →加淀粉酶1ml（消化淀粉）→90℃水浴15分钟→溶液中出现沉淀物直到变清 c. 奶糖→加9︰1乙醇氨溶液溶解→用1︰10H2SO4调 pH→加1%钨酸钠使蛋白质沉淀，奶脂凝 集沉淀→布氏漏斗抽滤 2) 吸附色素 1g 聚酰胺粉+糖液→70℃水浴→搅拌使之充分吸附→用布氏漏斗抽滤→用80℃水洗漏斗上的沉 淀物→再用丙酮洗（除油脂，硬糖不必）→再用80℃水洗沉淀物→洗到 pH 与原水相同 3) 解吸色素 沉淀物用乙醇氨解吸液全部解吸→收集于蒸发皿中→水浴浓液到4ml→加20%柠檬酸3滴→用水 定容10ml→留做点样用（单一色素直接比色，拼色要分离，先定性后定量） ⑸ 肉和肉制品中色素的测定 1) 前处理 称处理样→加海砂3g 和20ml 丙酮→于研钵中一起研→除去脂肪和水分→除去丙酮 2) 解吸样液中的色素 将上面沉淀物放入布氏漏斗→用解吸液从肉蛋白中使色素全部解吸下来→加热到70℃→用1︰ 10H2SO4调 PH 再加1ml10%钨酸钠→使蛋白质全部凝聚沉淀→用布氏漏斗抽滤→用70℃水20ml 洗 漏斗→收集全部滤液 3) 吸附样液中的色素 称1g 聚酰胺粉+上面的滤液→搅拌→抽滤→用水洗漏斗中沉淀物→直到滤水与原水 PH 相同 4) 解吸样液中色素（与非酒精性饮料相同） ⑹ 果脯类色素的测定 1) 处理 取样研碎后称2g→加50ml 水→加热70℃使溶解 2) 吸附 吸附剂1g+上述液→抽滤→用70℃热水洗沉淀物 3) 除天然色素 用甲醇-甲酸（6︰4）混合液解吸天然色素→直到滤液无色为止→再加甲醇10ml 进一步除天然 色素→70℃热水洗，不断搅拌 4) 解吸 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 用解吸液解吸样品沉淀物中全部人工合成色素→浓液解吸液（甲醇、氨）直到无甲醇、氨时→ 用1︰10H2SO4调 pH=4→再按上述加吸附剂操作重复1-2次，把天然色素全部去净为止，最后解吸、 定容同上。 ⑺ 各种加工蔬菜中色素的测定 这一类色素测定按理论应该以蜜饯的操作来处理，但在实验中这些样品胶体过多，使解吸、过 滤等操作非常困难，所以我们应该按下述方法进行：取样20g（干菜2g），加入100ml 80%的乙醇 溶液，浸泡2小时，再以含有1%氨水的70%乙醇反复浸出，合并浸出液，直到色素全部被洗脱下 来，置70-80℃水浴上，将全部浸出液浓缩，待氨全部逸出去（没有氨味），调 pH=4，加1g 聚酰 胺吸附，然后用布氏漏斗过滤，以200ml 70-80℃水洗涤漏斗的聚酰胺粉，然后用甲醇-甲酸洗 脱天然色素。以上操作同蜜饯中色素的测定方法。 ⑻ 提纯色素溶液的纸层析定性 为了判断样品中存在有几种色素以及是什么色素，必须进行纸层析进行鉴定。 经浓缩后样品色素溶液→于新华中速层析滤纸上点样→点样量3-5微升（若样品含量低可取出 1ml 在浓缩至0.2ml 再点样）→点样点的直径应不超过2毫米为宜→点样线距底边2厘米→样点间 距离以及左右纸边各距2厘米→用展开剂展开→测量各色素点的 Rf值→于标准色素 Rf值对照→ 确定何种色素（以标准色素斑点Rf值衡量样品各色素斑点的Rf值是否于标准点在同一条直线上， 色素的颜色是否完全一致，就可确定样品色素属于何种色素）。 Rf（比移值）=斑点移动距离/溶剂前沿距离 所使用的展开剂有： 1)正丁醇︰无水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3 2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4 3)异丁醇︰无水乙醇︰水 = 3︰2︰2 ⑼ 提纯色素溶液的薄层分离和定量 经过纸层析定性之后，含有一种色素的样液定容之后，离心即可定量；含有两种以上的复合色 素的样品溶液，需要经过薄层分离为单色素后，再用比色法分别定量，测定出各种色素的含量。 具体步骤是：薄层板制板→点样层析→比色→标准曲线绘制→计算含量 1) 薄层板制备 聚酰胺粉1g 于研钵中→加15ml 75%甲酸→搅拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g 硅胶 G→研磨1分 钟→立即涂板（玻璃板光滑平整，先用水洗净，干燥后用酒精擦拭干净，涂板时可用涂本 器或手工玻璃涂布）→可涂15×10厘米玻璃板三块（厚度为0.25-0.3毫米）→玻璃板放入盛有 少量水的大玻璃缸中→盖好盖子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小时→取出玻璃 板→于空气中风干→于60-65℃烘箱30分钟→放入干燥器中备用 2) 点样层析 用点样管（毛细管、微量注射器）将浓缩并定容的样液点在薄层板上→基线距底边2厘米→点成 与底边平行的条状→两端距边各为2厘米，点样量一般为0.4ml→点样时要用电吹风机边点边吹 干→然后进行展层析 展层缸先用溶剂系流30分钟→再把点好样的薄层板放入展析缸用上行法展开→薄板下端浸入溶 液0.5-1厘米→大约1小时看色素已明显分开后→即可取出薄板→晾干 对溶剂系流的选择是：a) 分离胭脂红、苋菜红、新红、柠檬黄、桔黄、靛蓝等用正丁醇︰吡啶 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 ︰5%氨水=6︰6︰4（这种展开剂主要分离靛蓝，因为靛蓝上升很快，其它上升很慢）；b) 分离 柠檬黄、胭脂红、苋菜红、柠檬黄、桔黄等时用展开剂为2.5%柠檬酸钠︰氨水=4︰3（柠檬黄上 升很快，其它上升慢）；c) 对于分离两种红色素（苋菜红、胭脂红）的食品用甲醇︰乙二胺︰ 氨水=10︰3︰4（主要是苋菜红与胭脂红上升快，其它色素上升慢）。 3) 比色定量 将薄层板展开后→用小刀分别将各条色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽滤→于水 浴上蒸发到无氨味→定容10ml→分别测出消光值 E（根据各种色素的最大吸收波长测定其光密 度）→从标准曲线上查出相应的各色素含量. 4) 标准曲线的制备 先配成标准色素贮备液（100微克/ml），称0.1g 标准色素加水稀释至1000ml 10ml 比色管 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 标准应用液 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 加水 分别加水至10ml 相当于μg/ml 0 1 5 10 20 30 40 50 60 70 分别测出 EO-E9的消光值以水为参比，以色素浓度为横生标，消光值为纵坐标，绘制标准曲线。 以水为参比，pH 值为6，各色素的最大吸收波长为下： 胭脂红 508纳米；柠檬黄 428纳米；苋菜红 520纳米； 晚霞黄 485纳米；赤藓红 528纳米；靛蓝 610纳米； 注意事项 1） 上述两个公式若乘以1/100，即由 mg/㎏变为几/万。例如胭脂红含量为80mg/㎏即0.8/万； 2） 聚酰胺粉吸附要求预先活化，并要求在一定的温度、pH 和一定的作用时间下进行，操作时 要注意。聚酰胺在酸性条件下吸附色素牢固，用水洗涤聚酰胺粉以除去可溶性物质，要求水偏 酸性（pH=4），防止聚酰胺上色素在洗涤过程中脱落下来； 3）样品的前处理和提纯过程很重要，要充分去除杂质（油脂、蛋白质、淀粉、糖）以免影响吸 附及层析效果。 一般能溶解在水中的物质，如食盐、糖、味精、香精等，在用酸性水洗涤聚酰胺粉时都能除去， 还有明胶、果胶也可以通过大量水除去；对油脂类可以用丙酮或石油醚洗涤脱脂，如果油脂含 量很高，可在研钵中用丙酮、海砂研磨除去；对于样品中蛋白质、淀粉含量高时，可用蛋白酶 或钨酸钠、淀粉酶水解后除去；对于天然色素可用6︰4甲醇-甲酸除去； 4） 纸层析定性时不可皱折，边缘应剪齐，不可有毛边，而且要注意纸的横、竖向，应顺纹上 行，展开较好，否则结果不规律； 5） 在浓缩样液时应控制水浴温度70-80℃，应使缓慢蒸发，勿溅出皿外，防止色素干结在蒸发 皿的壁上（应经常摇动蒸发皿）； 6） 靛蓝褪色由深兰色→浅兰色→黄色→无色。靛蓝褪色是由于光、氧、温度高、PH 等多种因 素的影响，测定靛蓝时要注意上述因素的影响； 7） 展开剂使用时最好2天换一次，以保证分离效果，放置时间过长造成浓度和极性都起变化， 影响分离效果； 8）漏斗用完后要洗净，先用浓 HCl20ml 少量多次洗，然后用水多次冲洗，否则影响下一个样品 的吸附或解吸作用； 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 9） 聚酰胺粉可回收使用。使用过的聚酰胺收集于干净的烧杯中，用0.5%NaOH 溶液浸泡24小时 之后水泵抽干，倒回烧杯，加0.1N HCl 泡30分钟，然后再用水泵抽干，用水洗至中性，置60℃ 烘箱烘干备用； 10） 比色时样液要求清晰，若混浊使 E增大，影响结果，如果混浊可离心也可放置。