地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化方法

第 21卷 第 5期 2002年 9月 无 锡 轻 工 大 学 学 报 Journal of W uxi University of Light Industry V01．21 No．5 Sep 2002 文章编号 ：1009—038X(2002)05—0460—04 地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成 及其高效电转化方法 唐雪 明， 邵蔚蓝， 王正祥， 方惠英， 诸 葛健 (江南大学 工业 生物技 术教 育部 重点实验室，江 苏 无锡 214036) 摘 要 ：通过体外处理诱导地衣 芽抱杆菌产生感受态性能，同时调整参数，建立了感受态细胞对质 粒 pAPR的 高效 电转化 方法 ．当质粒 DNA 为 1．5 g／mL、转化 时 电压 为1 750 V时，可得 到 261个 转化子，经 鉴定均 为阳性 克隆子 ．此为 以 芽抱杆 菌为宿 主进 行 高效 电转 化及 为建立 适合 工 业应 用 的分泌型达载体提供 参 考． 关键词：地衣芽孢杆菌；感受态细胞；高效电转化 中图分类号 ：Q 785 文献标识码：A Formation of Competent Bacillus licheniformis Cell and High Efficiency Electrotransform ation for Vectors TANG Xue—ming， SHAO W ei—lan， WANG Zheng-xiang， Fang Hui—ying， ZHUGE Jian (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Southern Yangtze University，Wuxi 214036，China) Abstract：Bacillus licheniformis was induced tO form competent cells in vitro，and by changing pa— rameters，a method of high efficiency electrotransformation for plasmid pAPR was established ． W hen DNA concentration was 1．5~tg／mI and the voltage was 1 750 V，261 transformants were obtained on screen plates．By the identification，all of transformants were positive clones ． W ith ordinary electro— transformation method，20 transformants were obtained on screen plates．The experiments provided a model for high efficiency electrotransformation with Bacillus strains as host cells ， and constructed a foundation for looking for adaptable secretory expression vectors in industry ． Key words：Bacillus lichen iform is；competent cells；efficiency electrotransformation 研究转化首先要考虑宿主细胞感受态(compe— tent)的形成能力 ．对于 大肠杆 菌宿 主细胞，经 过 CaC12处理后可使大肠杆菌得到较好的感受态性能， 每微克质粒转化得到 10 个转化子．而对于革兰 氏 阳性菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌要使其经过特殊 处理得到较好的感受态性能并非易事 ．因为革兰 氏 阴性菌和革兰氏阳性菌在感受态细胞形成和 DNA 转化的机制上有很大的不同，目前有关机理知道的 还很少，所以用于处理革兰 氏阴性菌的方法并不适 用于革兰 氏阳性菌[ ．然而，在工业生物技术的研 收稿日期：2002—04—15； 修订 日期 ：2002—07—10． 基金项 目：教育部高等学校骨干教师资助项 目课题 ． 作者简介 ：唐雪 明(1970一)，男，湖南道县人，博士研究生，讲师 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 5期 唐雪明等：地衣芽孢杆 菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化方法 461 究和应用中，十分 需要 以分 泌型 革兰 氏阳性 菌 为宿 主的菌株，这对产品的后提取和精制很有意义，特 别是在以基 因工 程手 段 进行 的新 菌 种 的构 建 过程 中更是十分必要 的 ．目前 以分 泌型 革兰 氏 阳性 菌作 为表达宿主已经成为工业生物技术领域的研究热 点 ．将 外源 DNA转 入 宿 主必 须 面对 宿 主 细胞 的 感 受态性能问题，以及需要寻找到高效转化的途径 ． 有学者以枯草杆菌为宿主制备成感受态细胞，并成 功进行了转化，但转化效率很低，均在 10个转化子 以下_2 J．在 以地衣芽孢杆菌为宿主时，往往难 以寻 找到好的感受态细胞处理方法而选择原生质体融 合的方 法，但 成 功 的 情 况 并 不 多 ，且 过 程 较 为 烦 琐 [3 J．作者在研究构 建整 合型 碱性 蛋 白酶 工程菌 的 过程 中，以地 衣 芽孢 杆 菌 为宿 主 ，诱 导 培养 使其 形 成具有感受态性能的细胞，并通过摸索，建立了适 用于地衣芽孢杆菌的电转化条件，得到了较好的结 果 ． 1 材 料 和 方法 1．1 材 料 1．1．1 菌株 和质 粒 Bacillus licheniformis 2709 突变侏由本实验室保存；质粒 pAPR为含有碱性蛋 白酶基因的整合型载体，并含有卡 那霉素抗性基 因，由作者构建 ，另文发表 1．1．2 试剂 5倍的微量盐溶液(1 000 mI )：10 g (NH4)2SO4，74 g K2HPO4，27 g KH2PO4，9．5 g MgSO4·7}{，O，pH 7．0；质量分数为 20％的葡萄糖 溶液，质量分数为 20％的酪氨酸溶液；所用试剂均 为纯 ． 1．1．3 培 养基 I B液体培养基：常规方法配制，在液体培养基 中添加质量分数为 1．5％的琼脂即为 LB固体培养 基．I B固体培养基和液体培养基在需要时加入卡 那霉素至 30 g／mI ． 芽孢杆菌基本培养基(100 mI )：20 mL 5倍的 微量盐溶液，2．5 mI 质量分数为 20％的葡萄糖，1 mI 质量分数为 20％的酪氨 酸溶液 ． 芽孢杆 菌饥 饿 培 养 基 (诱 导 芽 孢 生成 培 养基 ) (100 mI )：20 mI 5倍的微量盐溶液，2．5 mI 质 量分数为 20％的葡萄糖． 酪素固体培养基(1 000 mI )：干酪素 8 g，酵母 臂 2 g，K2HPO4 14 g，KH2PO4 6 g，(NI-I4)2SO4 2 g， 琼脂 12 g，pH 7．2～7．4． BY液体培养基(1 000 mI )：牛肉膏 5 g，酵母 膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaC1 5 g，葡萄糖 5 g，pH 7．2～ 7．4． 1．2 方 法 1．2．1 Bacill“s licheni r，，zis感 受 态细胞 的诱 导 形成 接种新鲜 Bacillus licheniformis 2709单菌落 至 10 mI 芽孢杆菌基本培养基中，37℃ 剧烈振荡 培养 16～18 h，250 r／min，培 养 至 OD6oo为 1．0时， 取 1．5 mI 培 养液 加入 到 10 mI 37℃ 水浴 预热的 40 mI 新鲜芽孢杆菌基本培养基 中．37℃剧烈振荡 培养 4 h，250 r／min．加入 10 mI 芽孢 杆菌饥 饿培 养基，37℃剧烈振荡培养 4 h，250 r／rain．将细菌在 冰水浴冷却 15 min，分装于 0．5 mI Eppendorf管 中，于 4℃ 10 000 g离心 10 min，沉淀物 用预 冷的 水轻轻溶解悬浮，可直接进行实验，也可于 一70℃ 冻存 ． 1．2．2 非诱 导型 Bacillus licheniformis转化 前 细 胞(对照)的制备 接种新鲜 BacilluS licheniformis 2709单菌落至 10 mI I B液体培养基中，37℃ 剧 烈振荡培养 16～18 h，250 r／min，培养至 OD6oo为 1．0时，取 1．5 mL该培 养液加入到 50 mI 37℃ 水 浴预热的新鲜 I B液体培养基中．37℃剧烈振荡培 养 4 h，250 r／min．将细菌在冰水浴冷却 15 min，分 装于 0．5 mI Eppendorf管 中，于 4℃ 下 10 000 r／min离 心 10 min，沉 淀物 用 预 冷的 水 轻轻 溶解 悬 浮 ，可直接进行实验 ，也 可于 一70℃ 冻存 ． 1．2．3 电转化 将新鲜制备的转化前细胞 0．5 mI 在 4℃ 下 10 000 r／min离心 10 min，弃去上清液， 加入 0．5 mI 冰水悬浮，如此反复洗涤细胞 3次，轻 柔操作 ．冰浴 10 min后分别加入不同质量浓度的质 粒 DNA，混匀，将溶液转移到预冷的无菌电转化池 中，吸干池表面水分，将 电转化池放入电转仪的样 品槽 中，在 不 同 的电场 强 度 下 电击转 化 ．迅 速取 出 电转化池，加入 1 mL BY液体培养基 稀释细胞， 37℃ 水浴摇床培养 1．5 h，取 200 I，涂布于 I B固 体卡那霉素抗性平板上，37℃培养． 1．2．4 阳性转化子的筛选 将阳性转化子点种于 酪素固体卡那霉素抗性平板上筛选，观察透明圈． 2 结 果 2．1 不同电压下诱导型感受态细胞的电转化 选择 1 g质粒 DNA在不 同的 电压下对诱导 型 感受态细胞进行 电转 化 (取平 均值，P<0．05，下 同)，结果如图 1所示．在 1 000，1 250，1 500，1 750， 2 000，2 500 V电压下分别平均得到了 11，57，102， 235，46，6个转 化子 ．以 1 750 V 电压 下的转 化效率 最高 ． ‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com 462 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 21卷 <' 梓 500 l 000 l 5O0 2 000 2 5O0 电压／V 图 1 诱 导 型 感 受 态 细 胞 在 不 同 电 压 下 的 转 化 (1 pLg DNA) Fig．1 The electrotransformation of induced com petent cells with 1 Ixg DNA 2．2 不同电压下非诱导型转化前细胞的电转化 选择 1 g质粒 DNA在不同电压下对非诱导型 转化前细胞进行电转化，结果如图 2所示 ．在1 000， 1 250，1 500，1 750，2 000，2 500 V 电压下分别平均 得到了 1，6，11，18，2，0个 转化 子 ．以 1 750 V 电压 下的转化效率最高，但是转化效率远远低于应用诱 导型感受态细胞进行电转化的效率． 图 2 非诱导型感受态细胞在不同电压下的转化(1}Lg DNA) Fig．2 The electrotransform ation of non·induced compe· tent cells with 1 Ixg plasm id DNA 2．3 不同 DNA质量浓度下诱导型感受态细胞的 电转化 选择不同质量浓度的质粒 DNA在 1 750 V电 压下对诱 导型感 受态 细胞 进 行 电转 化，结 果如 图 3 所示．在质粒 DNA质量浓度( g／mI )为 0．5，1．0， 1．5，2．0，2．5时分别平均得到 了 93，235，261，149． 71个转化子．以质粒 DNA质量浓度为 1．5 g／mI 的转化效率最高． 2．4 不同 DNA质量浓度下非诱导型转化前细胞 的电转化 选择不同质量浓度的质粒 DNA在 1 750 V电 压下对非诱导型转化前细胞进行电转化，结果如图 4所示．在质粒 DNA质 量浓度 ( g／mI )为 0．5， 1．0，1．5，2．0，2．5时分 别平均 得 到 了 7，18．20，11． 4个转化子，以质粒 DNA质量浓度 为 1．5／~g／mI 的转化效率 最高，但是 转化 效率 远远 低于应 用诱 导 型感受态细胞进行 电转化的效 率 ． DNA质 量浓度／(u g／mL) 图 3 不同质量浓度 DNA在 1 750 V电压下的电转化 Fig．3 The electrotransform ation of induced com petent cells with different concentration of plasmid DNA质量 浓度／(u g／mL) 图 4 不 同质量浓度 DNA在 1 750 V电压下的电转化 Fig．4 The electrotransformation of non·induced com pe· tent cells with different concentration of plasmid DNA at 1 750 voltage 2．5 阳性克隆子的筛选鉴定 将质量 浓 度 为 1．5 g／mL 的质粒 DNA 在 1 750 V下对诱 导型感受态 细胞 电转化转 化子进 行 挑选，点种转移至酪素固体卡那霉素抗性平板上筛 选，37℃培养 2 4 h，可以观察到这些转化子周围均 产生明显的透明圈，如图 5所示．这表明整合型质粒 pAPR成功转入宿主细胞，并将碱性蛋白酶基因插入 到宿主染色体中成功表达，转化子均为阳性克隆子、 图 5 阳性克隆子的鉴定 Fig．5 Identification of positive clones 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 5期 唐 雪明等 ：地衣 芽孢杆 菌感受态细胞 的诱 导形成及 其高效 电转化方法 463 3 讨 论 目前，细菌感受态产生的机制有两种假说：一 是局部原生质化假说．支持这种假说的现象是发芽 的芽孢杆菌相对 于营 养体 更加 容 易转 化 ，适 当的溶 菌酶处理可 以提高转化率 ；二是酶受体假说 ．支持 这种 假说 的现 象是 枯 草 杆菌 、链球 菌 、肺 炎 双球 菌 中都分离到相对分子质量为 5 000～10 000的感受 态因子_4 J．最新对转化机制的研究认 为，革兰氏阳 性菌中首先产生感受态因子，双链 DNA吸附于细 胞壁后，单链 DNA进入细胞，细胞中特定的蛋白质 包裹住外源 DNA防止被降解，最后重组产生稳定 的分子 ．而革兰氏阴性菌未发现感受态因子，且外 源 DNA是 以双链形式进 入细胞的 ， 在细菌中能够形成感受态的细胞是很少的，一 般认为 0、1％～1，0％，而且细菌处于感受态是短暂 的，肺炎双球菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等属于这 类菌，一般认为，感受态是在细菌生长到对数后期 产生的，有学者认为，芽孢杆菌在营养缺乏的饥饿 状态下，细胞易产生感受态因子，处于生长芽孢时 期的芽孢杆菌更容易产生感受态_5 J，作者在实验中 正是利用芽孢杆菌极限营养培养基，使地衣芽孢杆 菌处于 产生 感 受态 因子状 态 ，结 合 电转 化 ，同时探 索了影响 电转化效率的有 关参数 ． 参考文献 ： 一 般影响 电转 化的 因素有 细 胞培 养的 时间 、电 压的选择、DNA质量浓度、转化液的离子强度等，作 者选取的电压和质粒 DNA质量浓度作为基本考察 对象 ．处理后 的 转 化前 ．细 胞 由于 经过 冰水 反 复洗 涤 ，溶液 中离子强 度 已经很 低 ．对于 电转 化而 言，并 非 电场强 度 越 高转 化 率越 高，因 为 随着 电压升 高， 细胞在瞬 间高压下 死亡 率就 越高 ．不 同的细 胞对 电 压耐受力有 一个 限度，在 本 实验 中，当 电压达到 2 500 v时．细胞 已经 大量 死 亡，转化率 极低 ．但是 ， 所选 择 电压也不 能太 低，如果 细胞 表面 的动作 电位 处于不应期的时间较长，转 化率也将很低．另外，并 非质粒 DNA质 量 浓 度越 高 转 化率 就 越 高，对 于大 肠杆菌 常 规转 化 以及 其 他细 菌 的转 化 研 究中都 证 实 了这 一点 _6 J，本 实验 得 出的结 果 也是 如此 ．有关 详细机制 目前 尚不 明确，是否高质量浓度的质粒 DNA影响了细胞表面的电位变化或是封闭了 DNA 进入的通道还有待进一步研究， 本实验得到的转化率远远低于常规大肠杆菌 为宿主转化所得到的转化率(这与革兰氏阴性和阳 性菌的生理 状 态 和 细胞 结 构 有很 大 关 系)，但是 比 之常规方法处理的地衣芽孢杆菌的转化率提高 了 13倍，转化子经过鉴定均为阳性克隆子，很好地满 足了进一步实验的需要，本实验的结果为以芽孢杆 菌为宿主 进行 高 效 电转 化 以及 为建 立 适合 工业 应 用的分 泌型表达载体提供 了参考 ， [1]李育阳．基因表达技术 [M]．北京：科学 出版社，2001． [2]MATI I，SADAIE Y，KADA T．DNA Repair in competent cell of bacillus subtilis，J Bacteriology，1983，155(2)：933—936． 【3】SAMBROOK J，FRITSCH E F，MANIATIST，Molecular Cloning：A laboratory Manual[M]．New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989． [4]盛小禹．基因工程实验技术教程[M]．上海 ：复旦大学出版社．1999． 【5]HARWOOD C R，CUTTING S M，Molecular Biological Methods for Bacillus[M]．New York：John Wiley Press，1990． 【6]彭秀铃，袁汉英，谢毅 等．基因工程实验技术[M1．长沙：湖南科学技术出版社，1998． (责任 编辑 ：杨 勇) 维普资讯 http://www.cqvip.com