金属离子对蒜氨酸酶活性的影响

食品添加剂 (山东农业大学食品科学与学院，泰安 271018) 王 伟 乔旭光 秦晓春 摘 要：旨在对大蒜中的蒜氨酸酶和蒜氨酸进行提取的基础上，研 究不同金属离子对蒜氨酸酶活性的影响。研究表明，大多 数金属 离子对蒜氨酸酶活性有影响，其 中Mge 、Fe”、 Ca”、Fe”、Mna+对蒜氨酸酶有明显的激活作用，且这种激 活作用在有甘油、葡萄糖、蔗糖等多羟基化合物存在的条 件下激活效果更好；Cu! 对蒜氨酸酶有抑制作用。 关键词：蒜氨酸，蒜氨酸酶 ，抑制，激活，金属离子 Abstract：Based on the extract of alliinase and alliin， the effect of different metal ions on alliinase activity was studied． 1t shows that most metal ions． including Mg ，Fe ，Ca2+．Fe ，Mn2 have activation effect on alliinase The activation iS better with the existence of polyhydric compounds such as glycerin，glucose， and sucrose．CU2~iS an Inhibitive factor． Key words：alliin：alliinase；inhibation；activation；metal ion 中图分类号：l"S201、2+5 文献标识码：A 文 章 编 号 ：l002—0306(2004)09-01 18-03 大蒜 的风味前体物 s一烯 丙基一L一半胱氨 酸 ，即 蒜氨酸(A11iin)，在蒜 氨酸酶的作用下 ，依靠磷酸吡哆 醛 的协 同 作 用 ，分 解 为 大 蒜 素 和丙 酮 酸 ，具 有 鲜 大蒜 的风 味 l】1。 由 于大 蒜 素 不 稳 定 ，因而 分 解 形 成 了大蒜 复杂 的风 味 物 质 。本 实 验 主要 研 究 了影 响 蒜 氨 酸酶 活性 的一 些 因素 ， 以期 对蒜 氨酸 酶 的活 性 中心 及催 化 机 理 有 一 定 的 初 步 了解 ，从 而为 大 蒜 加 工 中保 持 甚 至 提 高蒜 氨 酸酶 活 性有 所 帮 助 。 1 材料与方法 1．1 实验材料 新 鲜大 蒜 泰 安 产 ；磷 酸 吡 哆醛 分 析 纯 ，Sigma 公 司 ；PE08000 分 析纯 ，北 京 欣经 科 生 物 技 术公 司 ； 三 氯 乙 酸 分 析纯 ，天 津 市 科 密 欧 化 学试 剂 开 发 中 心 ；2，4一二硝 基 苯肼 分 析纯 ，上 海 试 剂三 厂 。 TGL一16G—A 高速 冷 冻 离 心 机 ，UV一2000紫外 分 光 光 度计 ，冷室 (4oC)，磁力 搅 拌 器 ，组 织 捣 碎 机 。 1．2 实验方法 收稿日期：2003一ll一17 通讯联系人 作者简介：王伟(1980一)，男，在读研究生，研究方向：功能性食品。 基金项目：本研究受国家自然科学基金(C02021005)和国家“863”计 划(2001AA248021)资助。 1．2．1 蒜 氨 酸 的 提 取 圆 将 甲 醇 、氯 仿 、水 按 12：5：3 的比例配成 50mL的体系 (MCW)，混匀后称取 10g 大 蒜放 入 其 中 ，置 于一20oC低 温下 放 置 48h，然 后 按 每 10mL MCW 加 4．5mL氯 仿 、5．5mL水 的原 则 分 别 加 ／k 22．5mL氯仿 和 27．5mL水 。在 分 液 漏 斗 中振 荡 混 匀后静置分层 ，取上层水溶液于旋转蒸发器 中蒸发 至 10mL，然后 加 水稀 释 至 60mL备 用 。 ’ 1．2．2 蒜 氨 酸酶 的提 取 大蒜在 4℃冷室中预冷一组织 捣碎机捣碎一粗过滤一 离心(12000r／rain，40min)一上清液 中 加 PEG8000搅拌均匀(60mm)--~离心(12000r／min，20min)一取 沉淀，用 pH6．54缓冲液溶解一搅拌(3on1in)一 离心(12000r／min， 2on1in)一取上清液。 酶 的 稀 释 ：上 清液 lmL一10I1lL缓 冲 液混 匀后取 lmL--qOmL缓冲液混匀取 2mL--*10mL缓冲液混匀备用。 1、2．3 蒜 氨 酸 酶 活 性 的测 定 方 法 嘲 底 物 0．5mL中 加 入 0．5mL酶 液 ，反 应 1min，立 即 加 入 1mL 10％三 氯 乙 酸 终 止反 应 ，加 入 0．5mL 2，4一二 硝 基 苯肼 反 应 5min， 再 加 入 2．5mL 10％ Na0H 反 应 10min，在 420nm 波 长处 比色测 定 oD值 。 1-2-4 丙酮酸钠标准曲线 的制作[41 准确称取 110mg 丙 酮 酸 钠 溶 于 100mL蒸 馏 水 中 ，制 成 0．01mol／L的 丙 酮 酸 钠 溶 液 ，取 七 只 100mL容 量 瓶 ．分 别 加 入 0、 1、2、3、4、5、6mL的丙 酮 酸 钠 溶 液 ，用 蒸 馏 水 定 容 至 100mL。分别 从 各 容量 瓶 中取 3mL丙 酮酸 钠 溶液 ，加 入 lmL 0．005mol／L的 2，4一二 硝 基 苯 肼 溶 液 ，25℃下 反 应 5min， 然 后 依 次 加 入 2．5mol／L NaOH 溶 液 5mL，室 温 下 反应 10min，然 后 在 420nm 处 比色测 oD 值(空 白以蒸馏水代替丙酮酸钠溶液 )。 其 标 准 曲线 回归方 程 为 ：y=57．5257x一0．5737 r=0．9996扣 X--吸 光度 值 (OD4~o) y一丙 酮 酸 含量 ( g) 酶 活 单 位 定 义 ：在 25oC条 件 下 ，蒜 氨 酸 酶催 化 的 反应 中 ，每 分 钟 产 生 1i．zg丙 酮 酸 定 义 为 一 个 酶 活单 位 (unit)。 1．2．5 最 佳 反 应 时 间 的 确 定 取 12支 试 管 ，分 别 加 入蒜氨酸和蒜氨酸酶进行反应 ，各个试 管反应 时间 依 次 为 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5、5．0、5．5、 维普资讯 http://www.cqvip.com 6．Omin，三氯乙酸终止反应后进行显色 ，测 OD值 ，结 果 见 图 1。 时间(rain) 图 1 OD值随时间变化曲线图 从 图 1可 以看 出 ，该 酶 促 反 应 在 前 3min内基 本 呈 直 线关 系 ，为 了 更 好地 反 映酶 的催 化 特 点 ，将 酶 促 反 应 时 间定 为 1min，温度 为 25℃。 2 结果与 2．1 不同金属离子对蒜氨酸酶活性的影响 为 了测 定 不 同金 属 离 子 对 蒜 氨 酸 酶 活 性 的 影 响 ，取 相 同 阴 离 子 C卜，而 阳离 子 不 同 ，浓 度 均 为 1Ommol／L的物 质进 行 测 定 。 表 1 不同金属离子对蒜氨酸酶活性的影响 从 表 1可 以 看 出 ，以上 几 种 金 属 离 子 对 蒜 氨 酸 酶 活性 有 影 响 。Mg 、Fe 、Ca 、Fe 、Mn 对 蒜 氨 酸 酶 有 激活 作 用 ，其 中 Mn“、Fe 的 激 活效 果 最 好 ，Cu。 抑 制 酶 的活性 。 2．2 Mn 不同浓度对蒜氨酸酶活性的影响 将 Mn／~~lJ入蒜 氨酸 酶 液 中 ，使 Mn。 的浓 度 分 别 达 至U 2．5、5．O、7、5、1O、12．5、15、17．5、2O、22．5、25mmol／L， 测定 蒜 氨酸 酶 的 活性 。 Mn。 对 蒜 氨 酸 酶 在 15mmol／L浓 度 时 有 最 大 的 激活 能 力 ，但 当浓 度超 过 15mmol／L时 激 活 程 度 逐 渐 降低 ，达 到 22．5mmol／L时 表 现 为 抑 制作 用 。原 因 可 能是 高浓 度 的离 子 影 响 了 酶 促 反 应 体 系 的 pH 和 酶 食品添加荆 30 0 25 量 20 垂·1 0 浓度(mmol／L) 图2 不同浓度 Mn“对蒜氨酸酶活性的影响 活 性 中心 的 必 需 基 团 的解 离 状 态 ，从 而 影 响 了酶 的 活 性l5．61。 2．3 甘油、葡萄糖、蔗糖对蒜氨酸酶活性的影响 在 酶 液 中分 别 添 加 甘 油 、葡 萄糖 、蔗 糖 、镁 ，浓 度 均 为 5mmol／L进行 酶 促 反应 ，观 察 酶促 反 应 速度 。 甘 油 、葡 萄 糖 、蔗 糖 等 多 羟 基 化 合 物 对 蒜 氨 酸 酶 有 一定 的激 活作 用 ，但 不 明 显 。当这种 激 活 作用 在 有 金属离子存在的情况下效果很 明显 ，且高于单独使 用 金 属离 子 的 激活 效 果 。 2．4 M9 、甘油对蒜氨酸酶活性保持的影响 通 过 在 酶液 中分 别 加 入 Mg2~、甘 油 、M +甘 油 各 1Ommol／L，连 续 5d测 其 酶 活 的 变 化 ，结 果 如 图 3 所 示 8 7 0 6 ‘芑 5 4 蛏 3 龌 2 1 0 时间(d) 图3 Mg2+、甘油对蒜氨酸酶活性保持的影响 由 图 3可 以看 出 ，刚 加入 金 属 离 子 和 甘 油 时 ，他 们 对 酶 活 的 影 响很 大 ，但 1d后 这 四种 情 况 下 酶 活 几 ,qz相 同 ，即金 属 离 子 、甘 油 对 蒜 氨 酸 酶 活 性 的 保 持 没 有 显 著影 响 。 2．5 醋酸酐对蒜氨酸酶活性的影响 用 醋 酸 酐 (CH CO)2O处 理 酶 液 ，由图 4可 见 ，随 ， 3 ．= 至 2 、-， 妲 1 龌 0 0 2 4 6 8 10 体积( L) 图4 醋酸酐对蒜氨酸酶活性的影响 表2 甘油、葡萄糖、蔗糖对蒜氨酸酶活性的影响 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品添加剂 着醋酸酐加入量的增加 ，酶活急剧下降 ，推测 Lys可 能是 酶 活 性 中心 的 氨基 酸【7l，其化 学 修饰 反 应 如下 ： Lys-(CH2)4一NH2+(CH3co)2O---+Lys-(CH2)4一NH—C f0)一CH3 这 与相 关 报 道 以磷 酸 吡 哆醛 为辅 基 的 酶 的 活 性 中心 多数 含 有赖 氨 酸 的结 论相 一 致 。 3 结论 3．1 金属离子激活蒜氨酸酶 金 属 离子 ，如 Mg 、Fe3+、Ca“、Fe 、Mn 对 蒜 氨 酸 酶 有很 好 的激 活作 用 ，其 中 Mn 、Fe 的激 活 效 果最 好 ，显 著地提高 了蒜氨酸酶 的活性 ，而 Cu 强烈抑制 酶 的活 性 。 3．2 甘油等多羟基化合物对蒜氨酸酶活性有影响 甘油 、葡萄糖 、蔗糖等多羟基化合物有利于蒜 氨 酸 酶 活 性 的提 高 ，且 在 有 金 属 离 子 ，如 Mg 存 在 的 前提下效果更好 ，明显优于单独使用金属离子时的 效 果 。 3．3 蒜氨酸酶的活性中心可能含有赖氨酸 4 讨论 4．1 金属离子激活蒜氨酸酶活性的分析 金 属 离子 能 够 激 活 蒜 氨 酸 酶 的 活性 可 能 是 以下 作 用 机 制 造 成 的 ：1963年 ，Schwimmer证 实 了蒜 氨酸 酶 含 有 辅 基 磷 酸 吡 哆醛 ，此 辅 基 对 蒜 氨 酸 酶 的 活性 非 常 重要 【31。磷 酸 吡 哆醛参 与 了蒜 氨酸 酶催 化 蒜 氨酸 的酶 促 反应 。磷 酸 吡 哆醛 作用 于 底 物后 ，与底 物形 成 了一 个 结 合 ，在 连接 键 上 包 含 底 物 和 一个 金 属 离 子 (M)的静 电相 互 作 用 ，形 成 E—M—S三 元 络合 物 ，金 属 离 子 (M)起 到 了连 接 E、S二 者 的桥 梁作 用 。然后 ，酶 上 的 一 个碱 性 基 团一Lys一￡氨 基 从底 物 上 脱 去一 个 质 子 ， 由此 引 发 了 底 物 的 崩 溃 ， 释 放 出 一 个 次 磺 酸 RS0H和 丙酮 酸[51。 4．2 甘油等多羟基化合物对蒜氨酸酶作用效果分析 甘 油 、葡 萄 糖 、蔗 糖 等 多 羟 基 化 合 物对 蒜 氨 酸 酶 有 一定 的激 活作 用 ，但 不 明显 。当这 种 激 活作 用 在有 金属离子存 在的情况下效果很明显 ，且 高于单独使 用金属离子 的激 活作用 。甘油等多羟基化合物 的这 种 作 用 可 能 是这 些 多羟 基 物 质 能 够 大 量 与 水分 子 结 合 ，降低酶蛋 白与水分子的相互作用 ，促进 分子 内疏 水 键 的 结 合 ，有利 于蒜 氨 酸 酶 疏 水性 活性 中心 的形 成 ，稳定 了酶蛋 白的构象 ，使酶 的活性 中心能够更好 地 与底 物 结合 ，有利 于 酶促 反 应 的进 行[8,91。 参考文献： [1] 乔旭光．蒜氨酸酶动力学特性研究【JJ．山东农业大学学报， 1999，30(1)：42-46． [2] Jane E Lancaster，Kathleen E． Kelly． Quantitative Analysis of the S-alk(en)yl—L—cysteine Sulphoxides in Onion (Alliumcepa L．)【J1．Sci Food A c，1983，34：1229-1235． 【3] Ffiedemann T E．Pyruvic acid(II)the determination of keto acids in blood and urine[J]．J Bio Chem，1943，147：415— 442． 【4】 张振华．蒜氨酸酶酶学性质及提高大蒜 出油率的酶调控技 术研究[DI．山东农业大学硕士研究生论文，1999． [5] 谢周芳，等．大蒜加工[M]．北京：中国轻工业出版社，2001． [6] Schwimmer S．Characterization of Allium Cepa L(onion) 【J】．Arch of Biochem and Biophys，1963，100：765~771． [7] 林琳．金属 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