脂肪酶水解壳聚糖作用研究

研 究与探 讨 詹肪酶水解壳聚糖作用研究 (江南大学食品学院，无锡214036) 王丽娟 夏文水 陈小娥 高 博 摘 要：通过还原端基含量测定、粘度测定研究了脂肪酶非专一 性对壳聚糖的降解作用，探索了酶反应过程中温度、pH、 加酶量、底物浓度、反应时间、金属离子等因素对脂肪酶 降解壳聚糖的影响，以及不同脱乙酰度和不同分子量的 壳聚糖与脂肪酶降解反应的关系。结果表明，以壳聚糖为 底物的脂肪酶的一些催化特性为最适温度 5 55℃，最适 pH5～5．5，反应时间在 3~4h范围内；降解作用随着酶用量 和底物 浓度 的增加而增加，水解反应不符合 Michaehs- Menten方程 ；3mmol／L的 Cu ，lOmmol／L的 M 、Ca 对 脂肪酶有一定的激活作用，10nu'nol／L的Ba 、Zn 、Fe3 对 该酶有一定的抑制作用，随着底物壳聚糖脱乙酰度的提 高，降解速度 降低。 关键词：壳聚糖，脂肪酶，降解 Abstract：The effects of reaction temperature． DH． amount of enzyme substrate concentration and tIme on the hydrolysis of chitosan by lipase were studied． The relationship between hydrolysis and structure of chitosan by Iipase was discussed The optimum temperature and optimum pH were 5O～55。C and 5 0-5 5 respectively The reaction did not COnform to the Michaelis--Menten．1 OmmOl／L Mg“．Ca“．and 3mmOI／L CU could increase enzyme activity． but 1OmmOI／L Fe ．Zn“．Ba2+inhibited enzyme activity The increasing of N—acetylate chitosan jeaded to the slowdown of deg radation． Key words：chitosan；Jipase；deg rade 中图分类号：1、S201．2 5 文献标识码：A 文 章 编 号 ：1002-0306(2004)05-0051-03 壳 聚 糖 被 水 解 生 成 的 甲 壳 低 聚 糖 (chit0ol osaccharides)是 水 溶 性 产 物 ，可 被 人 体 、动 物和植 物 吸收 ，有 很 高的免 疫调 节功能 及抗 肿瘤 、抗 菌等生理 活性 。 甲壳 低 聚糖 的制备 中酶法 水解 由于 收稿 日期 ：2()03—09—02 通讯联 系人 作者简介：王丽娟(1977一)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程。 基金项目：国家自然科学基金资助(20271023)。 其 条 件温 和 ，易 控 制而受 到广泛 关注 。据报 道 ，甲壳 素 和 壳 聚糖除 被 甲壳 素酶 、壳 聚糖酶 和溶 菌酶 降解 外 ，还 能 被葡 萄糖 酶 、蛋 白酶 、脂 肪 酶 、纤 维素 酶 、淀 粉酶 、半 纤维 素酶 和果胶 酶等 非专 一性 酶有效 地水 解【l1，非 专一 性酶 由于Fr格 便宜 、易制 得 等 优点 而倍 受关 注 ，而 且有 些非专 一性 酶甚 至 比专 一性酶 更 加 有效 『2_31，例如脂 酶。Pantaleone【21等研究 了脂 酶 的非专 一 性 作 用 ，发 现 来 自猪 胰 腺 的 脂 肪 酶 对 壳 聚 糖 有 强 烈 的水 解作用 。国内夏文 水教授【41等人也有相关 的报 道 ：壳 聚 糖 很 容 易 被 麦 胚 脂 肪 酶 水 解 ，相 对 分 子 质 量 从 700000降为 13000。 脂肪 酶是 水解三 脂酰 甘油 的水解 酶类 。脂 肪酶 的一 个最 显 著 的特点 是 该酶 作用 于水 一有 机界 面 间 不溶 性 底物 。虽 然涉 及脂肪 酶和 甲壳素 的文 献 中已 有一 些 报道 ，但对其 水解作用 机理还不 十分清楚 。本 研 究 旨在 用脂肪 酶非 专一性 降解壳 聚糖 ，研 究其 水 解 动力 学及酶 促反应特性 。 1 材科与 1．1 实验材料 壳 聚糖 粘均 分子量 1．84xl06，脱 乙酰度 92％； 脂 肪 酶 为 NoVo 公 司 提 供 ， 由 菌 种 Aspergillus oryzae经 基 因 改 造 后 深 层 发 酵 而 成 的 Fusarium oxysporum纯化 提取 的 ，酶活 为 25KLU／g，将 其配成 酶 活为 25U／mL的溶液待用 ；其 它试剂 均为分 析纯 。 1．2 实验方法 1．2．1 粘均 分 子 量 测定 参 照文 献 [5】，以 0．1mol／L CH3COONa+0．2mol／L CH3COOH 为溶 剂 ，将待测壳 聚 糖 配成 0．1％的溶 液 ，此溶液 经 3号砂 芯漏斗 过滤 ，用 乌 氏粘 度计 于 30~0 5℃下 测 定 特性 粘 度 h]，代人 f4J管敦仪．啤酒工业手册(中 ．北京：中国轻工业出版社，140． [5】 李期颁．大麦中B一葡聚糖及其控制对策[J1．中国啤酒通讯， 1991(3)． (6I 侯力行，柳冰行．麦芽烘干过程中物质变化的探讨[J】．中国 啤酒通讯，1991(2)． + 一 —●一 —●一 —+一 —●一 —+— 【7】 浦福良．啤酒的色泽及其控制fJ]．上海食品科技，1985(3)． [8】 齐志道．啤酒生产指南(酿酒特-11)．1986．149～150． 【9] J S Hough The bioteehnology of matting and brewing [MI．Cambridge Press，1985．30~32， 【l0】 金玉来．麦芽中内B一葡聚酶的研究【J】．大麦科学，1994(1)， 丽 5J 维普资讯 http://www.cqvip.com Schence and Techno／ogy oyFood Industry Mark—Houwink方 程 (fxlI=KM“) 不 同脱 乙酰度 的壳 聚 糖 Mark—Houwink方 程 所 对 麻 的 常 数 K 和 OL不 同 ， K=1．64xl0一 ×DD ．d=1．02xl0 ×DD+1．82【 1．2．2 脱 乙酰度测 定 电位 滴 定法 I? 1．2．3 粘 度 的测定 用 Haake粘度 仪(Rv～20，M5)由 计 算 机控 制 ?取 受试 溶液 40mL，加 入粘度 仪转 筒 中 ， 剪 切速 率 设 定 为 256／s，在达 到设 定 温 度 后 ，用 注射 器 向溶 液 中注 射 lmL脂肪 酶溶液 ，测 量立 即 始 一在 lOmin内 自动 记 录 读 数 ，计 算 其 酶 解 初 速 度 v．，以 n Pa·s／min为单 位 ，用 水代 替 配液作 对照 实验 ：粘度 降 低 百 分 比(VDP)计 算 按 下 式 进 行 ：VDP=(v 厂v．)／v 其 中 v ，为初 始 粘 度 值 ，v 为 酶 解 5min后 的 粘 度 值 ， 并减 去 窄 白对照 的相应 值I I： 1．2．4 还 原 糖 含量测 定 用 Imoto法 并改 进如 下 ：在 试 管 中加 入 2rnL经 脂 肪 酶 降 解 后 的壳 聚 糖 溶 液 和 3mL 0．5mol／L碱性 铁 氰 化钾 溶 液 ，摇匀 ，用 铝箔 封 住 试管 口 ，在 沸 水浴 中加 热 l5min后 ，立 即用 冰 水冷 却 ，在 波 长 42Ohm处 比色 ，以蒸 馏 水 为 窄 白 ，并 测 出 2mL蒸 馏 水 加 3mL铁 氰 化 钾 的 吸光 度 A ，算 出 △A ∞=A ， A 20，用 △A ∞作 为酶 的相 对 活性 ，同时 做 底物 卒 白和酶空 白 ，以氨基葡 萄糖作 曲线 1l2．5 脂 fj方酶活 性 测 定 按 QB／Tl803-93A4测 定 ， 酸 碱 滴 定 法 一 2 结果与讨论 2．1 作用时间对酶促反应的影响 将 0．5％的 壳 聚 糖 乙酸 盐 溶 液 与脂 fj方酶 于 45o【二 反应 ，每隔 一定时 间取 样 ，测 定还 原糖 释放量 。 0 0．8 0．7 兰 0 6 三 0．5 0．4 0．3 蠢 0．2 蚕0．01 时间 (h) 图 l 酶促反应随时间的变化曲线 从 图 1可看 出 ，前 2h的还 原 糖浓 度增 长较 快 ， ’ 反 应随 时 问 的延 长还 IN．糖 的浓 度 增 长缓 慢 ，5h以后 反 应 趋 于平 缓 ，从节 约 能 源 、提高 效 率 的角 度 考 虑 ， 选 择 3～4h为较 合适 的反应 时间 。还 原糖 浓度 增加 随 时 间 延 长 变慢 的原 因 可 能 是 随 酶解 反 应 的进 行 ，底 物 减 少使 得 酶解 速 度降 低 ，以及酶 长 时 间在 热环 境 中可能 逐 渐 失 活 ，加之 水 解产 物 的积 累 反过 来抑 制 ’ 了酶反 应 的进行 。 2-2 温度对酶促反应的影响 在 不 同 温 度 下 ，脂 肪 酶 与 0．5％的 壳 聚 糖 反 应 30rain，然后 测定 还原 糖释 放量 。 52 ] 一 0 14 0．12 E 0．1 0．08 0．06 蒌 0．04 0．02 0 温度( ) 图 2 温度对酶促反应的影响 由 图 2可 看 出 ，随 着 温 度 的 升 高 ，在 40~55℃范 围 内 ，还 原糖 的浓 度 增 加 ；当 温度 超 过 55℃时 ，由于 酶部 分 变性 失 活 ，产 物还 原 糖 的浓 度 下降 ，故 脂 肪酶 降解 壳聚 糖 的最适 温度 为 50~55℃： 2．3 pH对酶促反应的影响 配制 不 同 pH的壳 聚糖乙酸盐 溶液 ，分 别与脂 肪 酶溶 液在 50℃反应 30rain，测定还 原糖释放量 ： 一 0 巨 巨 一 避 蛰 pH 图3 pit对酶促反应的影响 由图 3可 以看 出 ，在 pH 范 围 为 5～5．5时 ，还 原 糖 的浓 度 达 到最 高 ，说 明此 酶 的 水解 最适 pH 为 5～ 5．5；当溶 液 pH>6．0时 ，由于壳 聚糖 的溶 解 性下 降 ，壳 聚糖 的链 分 子不 能充 分展 开 ，反应难 以进 行完 全 ： 2．4 加酶量对酶促反应的影响 在 0．5％的壳 聚糖 乙酸 盐溶液 中 ，分 别加 入 不 同 量 的脂 肪酶 液 ，50 反应 30rain，测 定 释放 出的还 原 糖 含量 。 一 0．4 0l35 呈 0．3 量 0．25 姒 0．2 0．15 舞 0．1 0．05 0 酶底比(U／mL) 图4 酶底比对酶促反应的影响 从 图 4可 以看 出 ，当底 物 浓度 一 定 时 ，加 酶量 越 多 ，降解 产 生 的还 原糖 也 越多 ，两 者 基本 线性 关 系 维普资讯 http://www.cqvip.com (y=O 0379x—O．1225．R =0．9923) 2 5 底物浓度与酶解的关系 保 持 酶 婊 度 一 定 ，改 变 底物 浓 度 ，在 50 反 应 30rain，然 后测 定 还 原槠 释 放量 160 号140 ： ． 80 三 60 4 20 0 0 0 0 05 0．1 0 】5 0．2 0 25 0．3 1／ISIt L．／g J 圈 5 底物浓度耐酶促压应的彰啊 由 5可 看 出 ，还 原 精 乍 成 量 随 底 物 浓 度 的增 大 而增 大 但 足 并不 符 台 Miehaelis—Menlen力 程 ，这 与 Ⅵuzzarel|iI 等 的研 究 结 果一 致 2．6 酶促反应过程粘度的变化 ： 三 垫 时间f nII丌) 图6 酶促反应过程巾粘度的变化曲线 由 图 6可 看 出 ，前 5rain 加 酶 溶 液 牯 度 F降 到 73mPa·s．为最 初 的 55ok·．粘度 下 降很 快 ，由 此 请 测 脂 盼酶 罐 化壳 聚 精 降解 可 能 足 内 切 方 式 作 用 于壳 聚 糖 ．还 需 进 一 步验 证 、其 酶解 初 逮度 为 27mPa· ／lI1'n 2．7 不同金属离子对酶解的影响 配置 含 一定 浓 度 的金 属 离 子溶 液 分 别加 ^ 酶 液 中 ．静 置 3q'emin． 以 不 蜘 金 属 离 子 的 酶 的 话 为 100％，然后 按 照 测定 还 原 晴 的 靠 法检 测 、 表 1 不同金属离子对脂防酶水解壳聚糖作用的影响 由 表 1可 以清 楚 地 看 出 ．加 入 Cu 、Mg 的 酶 所 进 行 的 酶 促 反 应 产 生柏 还 原 糖 浓 度 远 大 于 对 照 厦 直 所 产生 的 还 『泉精 ， 见 Cu 、M 对 酶 有 明 艘的 激 活 作 用 ．同样 Ca 也有 一 定 的激 活 作用 而 其它 几种 离 子 则 是表 现 出 了 对 酶 的抑 制 作 用 ，使 得 水 解 产 生 的 还 原糖 大 大 减 少 ， Vo1．25,No．量2004 2．8 不同结构壳聚糖对酶促反应的影响 选 取 儿 种 不 同 脱 己 酰 度 和 粘 均 讣 f-世 的 壳 聚 精 作 为 底 物 ，在脂 肌酶 作 用 F进 行水 解 ，其 结果 见表 2 表2 不同结构壳聚糖对脂肪酶求解作用的影响 J^ 表 2可 以 看 出 ，粘 均 分 子 量 为 l 045x1 o^ 和 1．088~1 的 两 个底 物 ．脱 己 酰 度较 小 的 底物 水 解 产 牛 的迂 愿 特较 多 ；而牯 均 分 子量 较 小 的 4xl 0=}和 4．3x 10 两 个底 物 ，也 是脱 乙 酰度 鞍 小 的 底物 所 产 生 的还 原 _懒较 多 可 见 ，底物 的 粘 均分 子 量在 棚 同范 围 的情 下 ，脂 肪酶 主要 水 解脱 乙酰 度 较 低 的底 物 ，可初 步 推 测脂 肪酶 主 要 水解 含 GL~,NAc籀 团的 精苷 键 3 结论 睛 肪 酶降 解 壳 聚糖 的 最适 条件 ：黼崖 50～55t ， I，H5～5．5．反 应 时 问 狂 3—4h范 围 内 ，此 条 件 下 壳 聚 赭在 前 5mi．内 枇度 迅 速 下 降 一半 ，推 崩?／It酶 很 可能 足 以 内 切 方 式 作 用 于 壳 聚 糖 ：lOmmol／L的 M 、Ca'- 对脂 腑酶 有 一定 的激 活 作 用 ．3mmol／I 的 Cu“有 明 显 的澈 活 作 用 ．10mmol／L的 B 、Z~124、n h对谈 酶 有 一 定 的抑 制 作 用 ；脂 肪 酶 主 要 作 用 于 脱 己 酰 度 低 的 壳 聚 糖 ． 说 明 脂 肪 酶 主要 水 解 含 GLcNAc基 团 的 糖 苻 谜 参考文献 [11 夏文母 酶法改性壳聚糖的研究连展l_『1毛碍轻z-太学学 报．2001．20[5)：550-554 『2】Pantaleone D．~alpani M．"5collar M Unusual susceptibility c c}litosan to e rlzytll[C hydrolysis[J]Cabobydr Res．1992．237： 325—332． 【31 Muz．zarelli R A ^Terhojevich M，C~ani A．Unspecific activiLies f¨ lIIms岛 ard amyla,~es on chitc~m¨ ]Chitin D n 孔 l996『 自9—8l _4l 夏文水．Muz．~arelli I{A A．脂肪酶解聚壳聚糖盟其衍生特 妁研究_J_ 羌锝轻工业大学学报 I996，15(I1：l～5 【5】 蒋挺大壶聚糖【MJ．化学工业出棱社．20[]i．3 [6】 Rong H,eiChen"& Horng—Dar Hwa F~ffect 0f molecular weight chitosm~~*ilh the ㈣ degree of deaeetylatio． on the Ihcnna1．m~rhanica1．mid perme．ahili~, properties of Lhe prepared membranelj|．Carbohydrate P0 『lers l996、29：353— 358 _7】 lrm~to r．Yagishita K．A simple activity measurement of lysozyme[,I J Agn Biol Chem，l971．37(7)：1 I54~l】56． 维普资讯 http://www.cqvip.com