PLC法检测牛初乳中IgG含量

HPLC法检测牛初乳中 IgG含量 (中德联合研究院食品科学教育部国家重点实验室，南昌330047) 熊勇华 许 杨 魏 华 曾荣华 ■ 薹：建立了牛初乳中IgG的高效液相色谱检测法，并测定了 初乳中IgG的经时变化过程。结果显示，IgG浓度在0．2～ 15mg／mL的范围 内峰 面积 与浓度呈 现 良好 的线性 关 系， 回收率 实验平均 大于 98．5％。采用本 法测 定 了六头幽 门螺 杆菌免疫牛初乳 中IgG及两头正常牛初乳中IgG的经时 变化过程。母牛分娩后 24h内，初乳中免疫球蛋白IgG平 均含量在 40~?0mg／mL之 间；3d后 ，初乳中免疫球蛋 白 总量下降较快；至第7d，初乳中免疫球蛋白含量平均在 1-Smg／mL之 间。 关■■：牛初乳，IgG Abstract：In this paper，the method of determining the concentration of IgG in bovine colostrum by HPLC was set up and the content of IgG in colostrum changing with time was detected． The result showed that there was a nice Iinear relationship between the peak area and the content of IgG in the range of 0．2—15mg／mL． The average recover rate was 98．5％ ．The change in the content of IgG with time in six immuned bovine colostrum and tw o normaI bovine colostrum were determined using this method． The average co ntent of IgG in co lostrum was in 40 —70mg／mL in the range of 24h after cow delivery， and decreased quickly after three days On the seventh day． the content of IgG in colostrum was 1-5mg／mL． 1 wonlL~：bovine colostrum；IgG 中图分类号：鸭20r7．3 文献标识码：A 文 章 编 号 ：1002-0306(2003)09-0080-03 牛 、马 、羊 、猪 等 哺 乳 动 物 ，由 于 其 胎 盘 结 构 的 特 殊 性 ，母 体 的免疫 物质 不 能 通 过胎 盘 传 送 给下 一 代 ， 子代 只能 在 出生 后 通 过摄 入 母 体 初 乳 来 获 得 免疫 活 性物 质 。牛 初 乳 中 的免 疫球 蛋 白(Ig)是 系 统 免疫 的产 物 ，主要 由脾 脏 和淋 巴结 中 的 B细胞 转 化 发 展 成 浆 细 胞 产 生 的 Ig进 入 血 液 后 ， 通 过 乳 腺 组 织 中 的 主 动 转 移 机 制 到 达 牛 初 乳 之 中 。而 初 乳 中 相 对 较 少 的 IgA 和 IgM 则 是 由乳 腺 细 胞 自身 合 成 进 入 乳 中 的 。在 所 有 的 Ig中 ，IgC 更 易 透 过 毛 细血 管 壁 进 入 组 织 间 隙 ， 发 挥 其生 理 功 能 ，如 通 过促 进胆 汁分 泌 增 加 肝 脏 转 收稿 日期 ：2oo3一o1-22 作者简介：熊勇华，男，讲师，在职博士。 基金项目：国家计委高新技术产业化示范工程项目；江西省主要学科 跨世纪学术和技术带头人培养资助项 目。 化 胆 固醇 为 胆 汁 酸 的数 量 ，提 高抗 感 染 、抑 菌 、预 防 龋 齿及 中和 毒 素等 作 用 。 随着 人 们 对初 乳 中各 种 生 理 活 性 因-T-的逐 步认 识 ，近 几 十 年 初 乳 做 为 免疫 型 功 能 因子 在 食 品 和 保 健 品 中 得 到 了 广 泛 的 应 用 和 发 展 。 Hilpert等 (1977 年 )报 道 了将 牛 初 乳 中 IgC加 到婴 儿 配 方食 品 中 ，使 其 具 有 与人 乳 一 样 的免 疫 特 性 。进 入 90年 代 ，我 国 亦 开 始 了 以 免疫 球 蛋 白作 为 功 能 性 食 品 添 加 剂 的研 究 与 开 发 ，如黑 龙 江 完达 山食 品厂 和 杭 州 食 品 厂 推 出 的 婴 儿 配 方 奶 粉 中也 强 化 了 牛 初 乳 免 疫 球 蛋 白 ； 1995年 北 京 牛 奶 公 司 以 牛 初 乳 作 为 原 料 生 产 出 了 “来 福 粉 ”(含 有 Ig活性 的 巴 氏消 毒乳 )和 含 IgG活 性 的 初乳 粉 。为 了确 保 添 加 IgG 的婴 儿 配 方 食 品 以及 初 乳 粉 的质 量 ，本 实验 采 用 了 HPLC法 建 立 了一 种 快 速 、灵 敏 、简便 的牛 初乳 中 IgG 的检 测方 法 。 1 材料与方法 1．1 材料与仪器 奶 牛 分 娩 前 花 白奶 牛 8头 ，其 中实 验 组 6头 ， 对 照 组 2头 ，均 由 江 西 省 英 雄 乳 业 有 限 公 司 第 二 牧 场提 供 ；Bovine IsG Sigma公 司 ；其余 试 剂 均 为分 析 纯 。 J2-21高 速 离 心 机 Beckman公 司 产 品 ；X1-80 超 速 离 心机 Beckman 公 司产 品 ；752型紫 外 分 光 光 栅 光 度计 ，Waters 810高 效 液相 色 谱 仪 。 1．2 色谱条件 色 谱柱 为 TsK—G3000SW 凝 胶 色谱 柱 ，流 动相 为 0．1mol几 PB+0．1mol几 Na2SO~+0．05％ NaN3(pH6．7)； 流 速 1．0mLVmin；紫 外 检 测 波 长 为 280nm，操 作 温 度 25~1．5~C。 1．3 工作液的配制 Bovine IgG标 准 贮 备液 15mg／mL，工 作 液按 梯 度 稀释 至所 需浓度 ，加 0．O1O~l"qaN3置 于冰 箱保 存备 用 。 1．4 初乳中 IgG的检测 1-4．1 母 牛 的免 疫 以幽 门螺 杆 菌 全 菌抗 原 与 等 体 积 完 全 福 氏佐 剂 充分 乳 化 后 ，采 用 颈 部 肌 肉注 射 方 式 免 疫 健 康 母 牛 6头 。 预 产前 70d左 右 进 行 第 一 次 维普资讯 http://www.cqvip.com 在 测 定 范 围 0．2-15mg／mL浓 度 范 围 内峰 面 积 与浓 度 呈 现 良好 的线 性 关 系 ，结 果 见 图 2。 回归方 程 为 Y= (1．684e+O7)X+104791．78，相 关 系数 R=O．9915。 0．0 1．5 3．0 4．5 6．0 7．5 9．0 10．5 l2．O l3．5 l5．O (min) 图3 牛初乳免疫球蛋白粗提物 HPIC图谱 表 1 不同时间内初乳中IgG的含量变化(mg／mL) 时间 实验组 1 实验组 2 实验组 3 对照组 1 对照组 2 实验组 4 实验组 5 实验组 6 ld(8h) ld(16h) ld(24h) 2d(32h) 2d(40h) 2d(48h) 3dC56h) 3d(64h) 3d(72h) 21．8737 28．6o899 39加 6ll 29．75629 35．56274 23．19656 18．69322 6．9 徭86 9．746244 42．67493 51．02592 41．99524 17．61419 22．75373 18．75317 7．466193 4．35O645 1 4．6837 43．66781 19．35716 5．756845 7．611647 10．61693 0．689658 1．940398 1．447218 1．16587 72．93085 46 ．4l354 15．93187 5．184加 3 5．026613 2．958402 2．419223 2．294592 3 4O57O2 45．50267 24．08345 4．548691 7．325822 3．577693 3．o7o7O4 2．1 17214 1．36752 0国0830 2．4O864 51．61624 16．65537 7．876915 7．585829 3． l3039 1．84704 1．332 1．2∞‘9o6 33．53558 22．83244 13．80399 4．331309 4．3I 5 1．9 l9： 5．593734 2．16 l势 1 Q囊 2 64．20178 70．45658 87．80147 47．6386 21．69384 28．30145 32．72347 6．51863 9．0【 4O●l 4d 4．137562 7．379391 1．391984 2．122017 1．09224 1．~S773 4 朝翻露 62441 5(t 6．134 26 2．57964 1．383164 1．37674 0．339068 Z 瞎 晒 翻圈离国 1．7688／4 6(1 4．28887 2．563064 0．576075 0．96721 0．6549 1鼻弼 舛 翻目 尊嚏 1l330岛 ! !： 竺 ： ! ： ： !： 一 矍墼． 卷豳曼 竺堕 维普资讯 http://www.cqvip.com 超声波提取法测定午餐肉中脂肪含量 ■ ■：通过对午餐肉的脂肪含量进行测定，采用超声波提取技 术对国标 GBS009．6—1996(食品中脂肪测定方法》的第二 法酸水解 法进行 了改进 。本方法样 品处理 简便 、快速 、规 范 ，可 对大批 量样品的脂肪含 量进行 同时测定 。 关■霸：超声波提取，脂肪测定，午餐肉，酸水解法 中图分类号： 207_3 文献标识码 ：A 文 章 编 号 ：10o2一O3O6(20o3)o9—0o82一O2 午 餐 肉 中 脂 肪 含 量 的 测 定 可 采 用 国 家 标 准 检 验 方 法 GB5oo9．6—1996~ t品 中脂 肪 测 定 方 法 》中第 二 法 酸 水 解 法 ，只 是 该 法 样 品 消 化 处 理 是 经 70-80℃水 浴 加 热 约 40-50rain后 ，手 摇 提 取 脂 肪 ，操 作 费 时 繁 琐 ，人 为 因素 影 响 较 大 ，而 且 操作 在 后半 部 分 叙 述 比 较 笼统 ，不 易掌 握 和规 范 。我 们利 用 超声 波 所 特有 的 高 频 率 以 及 超 声 波 在 媒 质 中 高 速 传 播 为 212作 原 理 ， 对 酸 水 解 测 定 午 餐 肉 中 脂 肪 含 量 的 方 法 进 行 了 改 进 。 本 方 法 测 定 时 样 品 不 需 加 热 ， 经 超 声 波 提 取 脂 肪 ，缩 短 了样 品消 化 时间 ，改进 了后半 部 分 的操 作 。方 法 相 对 标 准 偏 差 为 o．70％ 。本 方 法 样 品 处 理 简 便 、快 速 、规 范 ，可 对 大 批 量 样 品 的 脂 肪 含 量 进 行 同 时 测 定 。 1 材料与方法 1．1 材料与仪器 ． 盐 酸 、95％ 乙 醇 、 乙 醚 分 析 纯 ；石 油 醚 分 析 纯 ，沸 程 30-60℃ 。 收稿 日期 ：20o3一O1—1O 作者简介：彭爱红(1~．968一)，女，硕士，讲师，研究方向：食品及食 品新 资源开发。 (集美大学生物工程学院，厦门361021) 彭爱红 超 声 波 清 洗 器 SB3200型 ，18ow，上 海 新 芝 生 物 技 术 研 究 所 生 产 ；100mL具 塞 刻 度 量 筒 。 I．2 测定方法 1．2．1 样 品 的 选 取 午 餐 肉罐 头 由厦 门 古 龙 罐 头 厂 提供 。 1．2．2 测 定 精 密 称 取 约 2g捣 碎 均 匀 的 样 品 ，置 于 100mL 具 塞 刻 度 量 筒 内 ， 加 8mL 水 ， 混 匀 后 再 加 10mL盐 酸 ，将 量 筒 放 入 超 声 波 清 洗 器 的 水 槽 中 (超 声 波 水 层 深 度 为 量 筒 的 40mL 处 ) 超 声 2min；加 lOmL 乙 醇 和 30mL乙 醚 ，超 声 3min；再 加 入 10mL 乙 醚一石 油 醚等 量 混合 液 ，继续 超 声 3min。取 出具 塞 刻 度 量 筒 室 温 放 置 30mln，分 层 清 晰 后 读 取 醚 层 总 体 积 ，再 吸 取 醚 层 部 分 20．00mL于 已 恒 重 的 小 烧 杯 中 ， 水 浴 挥 去醚 液 ，将小 烧 杯 于 95-105℃干 燥 至 恒 重后 称 重 ，计 算脂 肪 含量 。 2 结果与讨论 2．1 超声提取条件的正交试验 由 于 测 定 结 果 受 超 声 波 水 层 深 度 、 消 化 时 间 、超 声 时 间 、乙醚 、乙醚一 石 油 醚 等量 混合 液 用 量 的影 响 ， 应 用 了正交 试 验法 确 定各 因素 的最佳 条件 。确定 每个 因素作 以下 四个 水平 的试 验 ，正 交试 验 结果 见表 1。 表 1表 明 ，超 声 波 水 层 深 度 为 40mL、消 化 时 间 2min、超 声 时 间 3min、乙 醚 30mL 用 量 及 乙 醚 一石 油 醚等 量 混合 液 用 量 10mL即可得 到 满 意 的结 果 。 2．2 与国标方法精密度和测定结果的比较 取 上述 样品 ，用本法和 国标 方法分别平行 测定 5次 (下 转 第 85页) 降 趋 势 ，在 第 5、6、7d，IgC 含 量 呈 明 显 下 降 趋 势 ，直 至 第 7d 的 1-5mg／mL之 间 。 在 这 段 时 间 内 ，从 免 疫 球 蛋 白的加 工 角 度 看 ，初 乳 已没 有 多 大 的 利 用价 值 。 因此 ，为 了获 得 高 品 质 的 初 乳免 疫 球 蛋 白 ，初 乳 的收 集应 在产 犊 后 的前 2d进 行 为佳 。同时从 实 验 数据 可 知 ，不 同 牛在 泌 乳 初 期 ，初 乳 中免 疫 球 蛋 白存 在 着 显 著 的 个 体 差 异 。实 验 组 有 个 别 牛 在 泌 乳 初 期 (0-24h) 免 疫 球 蛋 白 含 量 明 显 偏 低 ，其 原 因 是 否 与 免 疫 过 程 有 关 还 不能 下 肯定 结 论 。同 时本 实验 结 果 显示 ，对 照 组 母 牛 初 乳 中免 疫 球 蛋 白含 量 普 遍 高 于 实 验 组 ，但 由于 对 照组 只 收集 了两 头 牛 的 初 乳数 据 ，数 据 相 对 偏 少 ， 由此 判 断母 牛分 娩 前 接 种 幽 门螺 杆 菌 对 分娩 后 初 乳 中 免 疫 球 蛋 白含 量 有 负 面 影 响 还 缺 乏 强 有 力 的 证 据 。 参考文献：略 维普资讯 http://www.cqvip.com