氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的测定方法

氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖 的测定 (江南大学食品学院 ，无锡 214036) 苏 畅 夏文水 姚惠源 ■ 一 对国内外文献报道的几种甲壳素及壳聚糖测定中常用的 还原糖 测定方法进行 了比较 。结果 明 ，DNS法和 改良 Schales法较 为适 合对氨基 糖和 乙酰氨基 糖混合体 系的测 定 ，其 中 DNS法 的测 定 范 围 为还 原 糖 含量 200~1000 mL，改 良 Schal~ 法的测定 范围为还原 糖含量 10-80 p．~mL。 关■词 氨基葡萄糖 乙酰氨基 葡萄糖 测定方法 Abstract We studied and compared a series of common reduced sugar determination methods reported in chitin and chitosan determinations． The results show that DNS method and a modified-Schales method are fit for the determination of glucosamine and N—acetyIglucosamine in mixture． ][6ey words glucosamine； N -acetylglucosamine； determination method 中图分类号 ：TS207．3 文献标识码 ：A 文 章 编 号 ：1002—0306(2003)06—0074—03 甲壳 素 与 壳 聚糖 是 由氨 基 葡 萄糖 与 乙酰 氨 基 葡 萄 糖 组 成 的 一 类 化 合 物 ，其 被 降 解 时 产 生 释 放 氨 基 葡 萄 糖 及 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 ， 因 此 常 用 还 原 糖 的 释 放 量 来 衡 量 反 应 的 进 程 。 综 合 国 内外 文 献 报 道 ，在 甲 壳 素 及 壳 聚糖 测 定 中常 用 的 测定 还 原 糖 的方 法 主要 有 苯 酚 一硫 酸 法 【l】、3，5一二 硝 基 水 杨 酸 法 (DNS法 )[2．31、改 进 的 Schales法 、Elson—Morgan法 等 。 本 文 对 这 几 种 常 用 方 法 进 行 了 比较 ，以 寻 找 一 种 快 速 、准 确 、简 便 的 氨 基 葡 萄 糖 和 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 的 测 定 方 法 。 1 材料与方法 1．1 实验材料 氨 基 葡 萄 糖 、 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 Sigma公 司 提 供 ；6％苯 酚 、硫 酸 、铁 氰 化 钾 、无 水 碳 酸 钠 、对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 、乙 酰 丙 酮 、无 水 乙 醇 、葡 萄 糖 等 试 剂 均 为 分 析 纯 ； 氨 基 葡 萄 糖 标 准 溶 液 配 制 1ms／mL标 准 氨 基 葡 萄 糖 溶 液 ，稀 释 不 同 倍 数 待 用 ； 收稿 日期 作者简 介 基金项 目 2oo3一Ol—O8 苏畅(1975一)，女 ，博士研 究生，研 究方向 ：生物技 术在食 品 中的应用。 教育部高等学校骨干教师资助资助。 乙酰 氨 基 葡 萄 糖 标 准 溶 液 配 制 l rr-s／mL标 准 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 溶 液 ，稀 释 不 同 倍 数 待 用 ； 葡 萄 糖 标 准 溶 液 配 制 lms／mL标 准 葡 萄 糖 溶 液 ，稀 释不 同倍 数 待 用 ； DNS试 剂 酒 石 酸 钾 钠 182g，溶 于 500mL蒸 馏 水 中 ，加 热 ，于 热 溶 液 中 依 次 加 入 3，5一二 硝 基 水 杨 酸 6．3g，NaOH 21g，苯 酚 5g，搅 拌 至 溶 ，冷 却 后 用 蒸 馏 水 定 容 至 100omL，贮 于 棕 色 瓶 中 ，室 温 保 存 ； 铁 氰 化 钾 试 剂 0．5g铁 氰 化 钾 溶 于 1L0．5mol／L 碳 酸 钠溶 液 中 ，贮 存 于 棕 色瓶 中 ； 乙 酰 丙 酮 试 剂 3．5mL 乙 酰 丙 酮 溶 于 50mL1．2mol／L碳 酸 钠 溶 液 中 ，现 用 现 配 ； 对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 试 剂 1．333g对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 溶 于 25mL无 水 乙 醇 及 25mL浓 盐 酸 的 混 合 液 中 ，棕 色 瓶 保 存 ，现 用 现 配 。 1．2 实验方法 1_2．1 苯 酚 一硫 酸 法 [L01 lmL样 液 加 入 lmL 6％苯 酚 、5mL浓 硫 酸 ，振 荡 混 匀 ，静 置 30 min，以 蒸 馏 水 为 空 白 ，490nm 下 测 定 吸 光 度 值 。 1．2．2 DNS法 【“】 lmL样 液 加 1．5mLDNS试 剂 ，沸 水 浴 5min，立 即 冷 却 后 用 蒸 馏 水 稀 释 定 容 至 25mL，以 蒸 馏 水 为 空 白 ，520nm 下 测 定 吸 光 度 值 。 1．2．3 改 良 Schales法 『l2】 2mL铁 氰 化 钾 试 剂 与 1．5mL样 液 混 合 ，沸 水 浴 15min，试 管 口 用 铝 箔 封 口 ， 冷 却 后 420nm 下 测 定 吸 光 度 值 ，以 蒸 馏 水 为 空 白 。 1．2．4 Elson—Morgan法 【”】 2mL样 液 与 lmL 乙 酰 丙 酮 试 剂 混 合 ，沸 水 浴 30min，冷 却 后 加 入 2mL无 水 乙 醇 ，lmL对 二 氨 基 苯 甲 醛 试 剂 ，振 荡 ，再 加 入 4mL无 水 乙 醇 ，60oC保 温 lh，530nm 下 测 定 吸 光 度 值 ， 以蒸 馏 水 为 空 白 。 2 结果与讨论 2．1 苯酚一硫酸法 苯 酚 一硫 酸 法 是 一 种 较 为 常 用 的 测 定 游 离 的 或 寡 糖 、多 糖 中 的 己 糖 、糖 醛 酸 的 方 法 。 从 它 对 三 种 还 原 糖 测 定 的 标 准 曲 线 来 看 ，苯 酚 一硫 酸 法 对 于 葡 萄 糖 维普资讯 http://www.cqvip.com 0 还原糖 含量( g) 图 2 DNS法测定还原糖 含量曲线 DNS法 tO．是 一 种 较 为 常 用 的 测 定 还 原 糖 的 方 法 ，在 一 定 范 围 内 还 原 糖 的 量 与 反 应 液 的 颜 色 强 度 成 比 例 关 系 。 图 中 ， 葡 萄 糖 的 标 准 曲 线 为 Y= 0．0009X-0．0105，R =0．9988；氨 基 葡 萄糖 的标 准 曲线 为 Y=0．Oo07X+0．0177，RZ=0．9934；乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 的 标 准 曲 线 为 Y=0．0007X-0．0318，R =0．9934。 DNS试 剂 对 于 这 三 种 还 原 糖 都 有 较 好 的 显 色 效 果 ， 测 定 范 围 在 200-1000 tLg之 间 。 2．3 改良 Schales法 { 8 萄糖 0 20 40 60 80 100 还原糖含量 ( g) 图 3 改 良Schales法测定还原糖 含量标准 曲线 改 良 的 Schales法 是 根 据 绿 色 的 铁 氰 酸 离 子 能 被 还 原 糖 还 原 成 无 色 的 亚 铁 氰 酸 离 子 ， 使 还 原 糖 含 量 与 反 应 液 的 颜 色 强 度 成 比例 关 系 ， 高 浓 度 的 碳 酸 钠 可 以 抵 消 样 品 溶 液 中 缓 冲 液 的 效 应 。 图 中 ，葡 萄 糖 的 标 准 曲线 Y=0．011X+0．0283，R2=0．9913； 氨 基 葡 萄 糖 的标 准 曲线 Y=0．0098X+0．0077，R =0．9974；乙 酰 氨 糖 在 碱 性 条 件 下 与 乙 酰 丙 酮 缩 合 形 成 生 色 原 2一甲 基 一3一二 乙 酰 吡 咯 衍 生 物 ， 生 色 原 再 与 对 一二 甲 氨 基 苯 甲醛 在 浓 盐 酸 乙 醇 溶 液 中 生 色 。 N一乙 酰 氨 基 糖 需 预 先水 解 为 氨基 糖 才可 测 定 。 图 中tO．可看 出 ，Elson- Morgan法 对 于 葡 萄 糖 不 显 色 ， 氨 基 葡 萄 糖 的 标 准 曲 ． 线 Y=0．0074X+0．0165，R2=0．9941；乙酰氨基葡萄糖 的 '：， 标准曲线Y：0·0032X一0·0092，R2=0·9949。氨基葡萄糖 析 茎 言 裹 柏 基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖混合的体系情况下使用 _ 此法会发生较大误差。 丽 3 结论 本 文 对 于 目前 壳 聚 糖 水 解 产 物 测 定 中 常 用 的 还 原 糖 测 定 方 法 进 行 了 比较 ，得 出 以 下 结 论 ： 3．1 苯 酚 一硫 酸 法 对 氨 基 葡 萄 糖 及 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 不 显 色 ，不 适 于 氨 基 糖 及 乙 酰 氨 基 糖 类 物 质 的 测 定 。 3．2 DNS法 对 于 葡 萄 糖 、氨 基 葡 萄 糖 和 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 都 有 较 好 的 显 色 效 果 ，氨 基 葡 萄 糖 与 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 的 标 准 曲 线 较 为 接 近 ，可 用 于 测 定 氨 基 糖 与 乙酰 氨基 糖 混合 的体 系 。但 此 法 的灵 敏度 略低 ，测 定 范 围 在 200-1000lxg之 间 。 3．3 改 良的 Schales法 对 于葡 萄 糖 、氨 基葡 萄 糖 和 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 tO．有 较 好 的 显 色 效 果 ，氨 基 葡 萄 糖 与 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 的 标 准 曲线 较 为 接 近 ，可 用 于 测 定 氨 基 糖 与 乙 酰 氨 基 糖 混 合 的 体 系 ， 且 此 法 的 测 定 范 围 在 10-801xg之 间 灵 敏 度 较 高 ，稳 定 性 好 ，重 复 性 好 。 3．4 Elson—Morgan法 虽 然 是 测 定 氨 基 糖 的 特 征 显 色 法 ，但 由 于 乙 酰 氨 基 糖 需 预 水 解 成 游 离 的 氨 基 糖 才 可 被 测 定 ，两 者 的 标 准 曲 线 相 差 较 远 ，不 适 用 于 氨 基 糖 与 乙 酰 氨 基 糖 混 合 的 体 系 。 参考文献 1 何新益．甲壳低聚糖的制备及放大试验研究．硕士学位论文，1998 (下 转 第 77页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 中 加 5OmL蒸 馏 水 ，再 加 5mLFolin-ciocalteu试 剂 ，摇 匀 后 再 加 入 15mL20％ 的 Na2CO 溶 液 ， 于 3O℃ 反 应 2h。按 上 述 方 法 配 制 空 白溶 液 ，在 76Onm 波 长 处 测 定 样 品 溶 液 吸 光 度 ，从 标 准 曲 线 上 读 出 相 当 于 水 皂 角 提 取 物 中 总 多 酚 的 量 ，计 算 即 得 。 2．6 稳定性试验 取 一 样 品 按 上 述 样 品 配 制 及 测 定 方 法 ，分 别 在 样 品 与 Folin—ci0calteu试 剂 反 应 完 全 (2h)后 O、1、2h 测 定 吸 光 度 值 ，吸 光 度 值 RSD=O．63％(n：3)，证 明 水 皂 角 提 取 物 总 多 酚 在 3h 内测 定 结 果 均 稳 定 。 2．7 精密度试验 取 一 样 品 按 上 述 样 品 配 制 及 测 定 方 法 测 定 吸 光 度 值 ，共 测 5次 ，结 果 RSD=0．19％ 。 2．8 重复性试验 取 一 样 品 称 取 5份 ，测 定 含 量 ，结 果 多 酚 含 量 的 RSD=0．81％ 。 2．9 回收率试验 采 用加 样 回收 法 ，精 密 称 取 1Omg表 儿 茶 素 ，依 法 用 蒸 馏 水 溶 解 ，定 容 到 1OOmL。另 定 量 称 取 水 皂 角 提 取 物 lOmg，依 法 用 蒸 馏 水 溶 解 ，定 容 到 lOOmL，各 取 0．5mL分 置 5个 25mL容 量 瓶 中 ，再 加 入 上 述 对 照 品 溶 液 O．5mL，按 上 述 样 品 测 定 方 法 测 定 吸 光 度 ，平 均 回 收 率 为 99．5％ ，RSD=1．02％。 2．10 样品测定 按 样 品 配 制 及 测 定 方 法 测 定 了 6个 样 品 中 的 总 多 酚 含 量 ，结 果 见 表 1。 表 1 样 品水皂角 总多酚含量测定结果 样品 1 2 3 4 5 6 水皂角总多酚含量 (％)19．56 19．89 19．78 19．73 19．46 19．82 3 讨论 3．1 水皂 角 主要 有 效成 分 为原 花青 素 、二 聚 黄烷 醇 等 多酚 类 化 合 物 ，由 于这 些 物 质 的标 准 品很 难 购买 得 到 ，且 分 离 困 难 ，无 法 利 用 HPLC，LC—MS等 现 代 手 段 进 行 定 量 分 析 ， 用 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 水 皂 角 总 多 酚 含 量 是 简 单 可 行 的 好 方 法 。 3_2· 样 品 在 水 中 的 溶 解 度 不 大 ，所 以 称 样 量 控 制 在 lO-20mg，并 需 要 加 热 才 能 完 全 溶 解 。 参考文献 1 Shimura S，Tsuzuki W，Itoh Y，et a1．Lipase Inhibitors in C 5 mirr~soides L． I)o1． nomaln~ Makino． Nippon Nogeikagaku Kaishi，1993，67(1 1)：1583 2 Shimura S，Tsuzuki W， Itoh Y， Kobayashi S． Inhibitory Eflfect of Tannin Fraction from Cassia mirr~soides L． I)o1． noman'te Makino on Lipase Activity． Norin Suisansho Shokuhin Sogo Kenkyujo Japan Nihon Shokuhin Kogyo Gakkai，1994，41(8)：561 3 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