干酪乳杆菌蛋白酶的性质研究

白酶的性质研究 控制重点 开放 实验 室，南京 210095) 王 俊 黄 明 徐幸莲 周光宏 抑制作 用 ；而 zn 、碘 乙酸 和 B一巯基 乙醇 的抑制作 用较 轻微。 可见，酶 液 中可能含金属酶 、丝氨酸酶 及巯基酶 等 多种蛋 白酶 。 关■诩 ：干酪乳 杆菌 ，蛋 白酶 ，酶 学性 质 A~ et：Through proliferating． sonification． and high speed retrigerated cenInTugatlOn， crude enzyme extracts were extracted fr0m Laetobaeillus co．se 6o33． and the enzyme specificity recovery rate was about 9_71％ after 70％ -80％ saturation ammOn_um sulfate precipitation． The pH and temperature optima of enzy me extracts were 7 0 and 40℃ respectively Co2 ． Mn could enhance enzyme activity greatly Cu“ ， Fe“ ． ED1_A and PMSF had significant inhibition on enzyme activity． while the inhibition of Zn2 ． iodoacetic acid and B—mercaptoethanol was not obvious． These indicated that enzvme extracts C0ntained probably many proteinases． such as metalloproteases， serine proteases． sulfhedryl proteases．and SO on． Kley words：Lactobacillus c~ei；proteinase；characterization 中图分类号：TS20I．2+5 文献标识码：A 文 章 编 号 ：1002-0306(2003)07—0056—03 发 酵 香 肠 发 酵 剂 比 较 常 用 的 微 生 物 包 括 乳 杆 收稿 日期 ：2003一Ol一2l 作者简介：王傻(1971一)，男，博士研究生，研究方向：畜产品加工与质 量控制 。 基金项 目：江 苏省科技 攻 关项 目基金 资助 (No．BE2001400)；已列入 “十五 ”国家高技 术研究发展计 划(863)项 目(2002—2005)。 菌 、片 球 菌 、微球 菌 、霉 菌 和酵 母 等 。乳 杆 菌是 发 酵 香 肠 中主要 的 、也 是 最 早 从 自然 发 酵 肉制 品 中分 离 出 来 的 微 生 物 ，发 酵 香 肠 常 用 的 乳 杆 菌 包 括 植 物 乳 杆 菌 、干 酪乳 杆 菌 、发酵 乳 杆 菌 等 。广 泛应 用 于奶 酪 、发 酵 香 肠 等制 作 的干 酪 乳 杆 菌是 革 兰 氏 阳性 菌 ，最 适 生 长 温 度 30~C，对 食 盐 、硝 酸 盐 、亚 硝 酸 盐 均 有 较 高 的 耐 受 性 ，对 肉 中 的 环 境 适 应 性 也 较 强 ，表 现 为 高 度 的竞 争 性 ，在 发 酵 和成 熟 过 程 中能 达 到 较 高 的 菌数 ； 具 有 很 强 的 发 酵 产 酸 的 能 力 ，并 能 产 脂 酶 和 蛋 白 酶 等 酶 类 。 目前 ，国外 研 究 人 员 已经 从 干 酪 乳 杆 菌 中分 离 纯 化 出 了数 种 蛋 白酶 ，包 括 肽 酶 和 氨 肽 酶 等『|-3]，并 对 其 酶 学性 质 以及 其 在 发 酵 香 肠 成 熟 过 程 中的 作用 进 行 了 研 究 1451。 我 国 学 者 对 这 方 面 的 研 究 很 少 ，研 究 结 果 目前 也 未 见 有 公 开 报 道 。 1 材料与方法 1．1 材料与设备 干 酪 乳 杆 菌 购 自 中 国 食 品 发 酵 工 业 研 究 所 ，编 号 6033；酪 蛋 白 USB，美 国 ；硫 酸铵 AMRESCO，美 国 ；三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 ( 蹦 s)、PMSF、牛 血 清 白蛋 白 (BSA) 均 为 Sigma公 司产 ，美 国 ；其 它 试剂 均为 国 产 分 析 纯 。 插 入 式 pH 计 HANNA HI9025，葡 萄 牙 ；高 速 冷 冻离 心 机 Beckman Allegra 64R，美 国 ；紫 外 分光 光 度 计 UV一754，上 海 ；超 声 波 细 胞 破 碎 仪 VCX一 600，美 国 ；磁 力 加 热 搅 拌 器 国华 78—1，深 圳 ；电泳 仪 等 。 以 8％ 的 速 度 增 加 。 随 着 新 技 术 的 不 断 应 用 ，以 及 对 聚 甘 油 酯 的 不 断 研 究 ，聚 甘 油 酯 的 应 用 将 越 来 越 广 。 参考文献： 【1] 汪多仁．聚甘油脂肪酸酯的合成应用与市场开发【J]_表面 活性剂工业．1998(2)：1-2．10． 【2] 沈金玉．食品乳化剂一聚甘油脂肪酸酯【J]．中国食品用化学 品．1997(5)：1-4． -+ - ■一- -+一 【3] 吕恩雄．聚甘油脂肪酸酯[JJ．精细石油化工，1993(6)：59—61． 【4] 苑进忠，程恩．聚甘油脂肪酸酯的开发及应用【J】．精细与专 用化学品，1992(11)：8-12． 【5] 裴培．聚甘油脂肪酸酯在食品加工中的应用实例[J】．辽宁 食品与发酵，1990(3)：69—71,7． 【6] 山下政续，金郁静．聚甘油脂肪酸酯的开发和工业化【J】．日 用化学工业译丛。1990(2)：21-26． 【7] 张万福．食品乳化荆【M]．中国轻工业出版社，1993，9． 奠 品添加 两 维普资讯 http://www.cqvip.com 1．2 试验方法 1．2．1 增 菌 培 养 1．2．1．1 最 佳 增 菌 培 养 基 的 选 择 将 干 酪 乳 杆 菌 6033分别 接 种 于 MRS、10％脱 脂 牛 奶 、马 丁 汤 和 营养 肉 汤 四种 液 体 培 养 基 中 ， 于 3OoC培 养 24h，选 择 pH6．1、含有 0．2％山梨 酸 钾 的 MRS固体培 养基 进 行 计 数 I6l。 1．2．1．2 最 佳 增 菌 时 间 的确 定 将 经 过 两 次 活 化 的 菌 悬 液 分 别 按 2％的 接 种 量 接 入 MRS液 体 培 养 基 ， 于 3OoC分别 培 养 4、8、12、16、20、24、28h。分 别计 数 ， 确 定 最 佳 增 菌 时 间 。 1-2．1_3 增 菌 培养 及 菌 体 收获 按 2％的接 种 量 将 菌 种 接 入 IOLMRS液 体 培 养 基 ，经 30℃ 、最 佳 增 菌 时 间 培 养 。 培 养 物 经 4'12、10000r／rain离 心 15min，弃 去 上 清 液 ，沉 淀用 0．05mol／L、pH7．0的 PBS洗 涤 三 次后 混 悬 于 两倍 体 积 的 Tris—HCI缓 冲液 (pH7．5)中 。 1．2．2 粗 酶 液 制 备 上 述 菌 悬 液 进 行 超 声 波 破 碎 ， 菌 细 胞 裂 解 液 经 4℃ 、l2o0Or／min离 12-30min，取 上 清 液 即 为 粗 酶 液 。 1-2．3 酶 液 初 步 提 纯 分 别 以 30％ 、40％ 、50％ 、 60％ 、70％ 、80％ 、90％ 、100％饱 和 度 的硫 酸 铵 提 纯 粗 酶 液 ，测 酶 活 力 ，以 确 定 最 适 硫 酸 铵 饱 和 度 范 围 。 1．2．4 部 分 酶 学 性 质 鉴 定 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 过 的 酶 液 经 透 析 后 进 行 部 分 酶 学 性 质 的 鉴 定 。 1．2．5 蛋 白 质 浓 度 测 定 采 用 Bradford检 测 法 m测 定 蛋 白质 浓 度 。 l-2．6 酶 活 力 测 定 根 据 文 献 【81 的 方 法 并 略 加 改 动 ， 以 酪 蛋 白 为 底 物 ， 取 1mL 酶 液 于 37oC预 热 lOmin，加 入 37℃ 预 热 的 1％Casein(pH7．0的 PBS配 制 )2mL，反应 30min，加入 0．4mol／L的 TCA3mL终 止 反 应 (对 照 先 加 TCA 后 加 底 物 )， 静 置 30min， lO000r／min离 心 15min，上 清 液 测 oD275值 。以 37'12、 pH7．0条 件 下 ，1mg蛋 白酶 30rain水 解 酪 蛋 白 ，oD 值 变化 0．O1个 光 吸 收 单 位 为 1个 酶 活 单 位 (u)，记 为 U／ragf比 活 力 )。 2 结果与 2．1 最佳增菌培养基的确定 干 酪 乳 杆 菌 6033在 MRS、10％ 脱 脂 牛 奶 、 马 丁 汤和 营 养 肉汤 四种 液 体 培 养 基 中 的生 长 情 况见 表 1。 由 表 1可 见 ， 干 酪 乳 杆 菌 6033在 MRS和 10％ 脱 脂 牛 奶 中长 势 均 较 好 ，本 研 究 选 择 MRS液 体 培 养 基 作 为 增 菌 培 养 基 。 表 1 干酪乳杆菌在 四种培养基 中的生 长情 况 注：+++ _+表示好一差。 2_2 最佳增菌时间的确定 干 酪 乳 杆 菌 6033在 20h左 右 达 到 最 高 菌 数 ，因 此 选 择 20h为 菌 体 最 佳 收 获 时 间 ，见 图 1。 g ＼ 0 b0 培养 时间(h) 图 1 Lc最佳增菌时间的确定 2．3 硫酸铵最适饱和度的确定 硫 酸铵 饱 和 度 为 80％时 酶 活 力 回 收率 最 高 ，故 选 择 80％ 为 最 佳 硫 酸 铵 饱 和 度 ，见 表 2。 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 后 ，蛋 白 酶 的 进 一 步 纯 化 试 验 本 课 组 目前 正 在 进 行 之 中 。 2．4 部分酶学性质鉴定 2．4．1 pH 对 酶 活 力 的 影 响 分 别 用 pH2．2的 碳 酸 氢 钠 一柠 檬 酸 缓 冲 液 、pH7．5的 s—HCI缓 冲 液 、 pHl1．0的甘 氨 酸 一氢 氧 化 钠 缓 冲 液 配 成 pH 分 别 为 5．0、5．5、6、6．5、7、7．5、8、8．5、9．0的 缓 冲 液 ， 分 别 加 入 等 量 的酶 液 ，于 4'tl2放 置 24h后 测 相对 酶 活 。从 图 2 可 见 ，酶 液 在 37oC时 ，适 合 pH 范 围 为 6．0～7．0，最 大 酶 活 力 出现 在 pH6．5附 近 ，pH5．0时 相 对 酶 活 下 降 到 47％ ，而 pH9．0时仅 保 留 12％。 表 2 最佳硫酸铵饱和度范围的确定 硫酸铵饱和度(％) 活力回收率(OD： ) 30 40 50 60 70 80 9o 10o 0 0．07 1．30 5．9o 3．91 9．71 5 3．囝孽 l00 — 80 恤 60 溢 莨 40 20 0 5 6 7 8 9 pH 图 2 pH对酶活力的影响 2．4．2 温度 对 酶 活 力 的影 响 其 它 条件 相 同 的情 况 寞品爱加 精 维普资讯 http://www.cqvip.com 2．4．3 金 属 离 子 对 酶 活力 的影 响 在 其 它 条 件 相 同 的情 况 下 ，分 别 向酶液 中加 人 不 同浓 度 的 金 属离 子 ， 测 相 对 酶 活 。 由 表 3可 见 ，Co 、Mn“能 显 著 增 强 酶 液 活力 ，Cuz+、Fe +贝U明 显 抑 制 了其 活 性 ；而 Zn 对 其 有 中等 的抑 制 作用 。 表 3 金属离子对酶活力的影响 2．4．4 抑 制 剂 对 酶 活力 的影 响 将 各 种 抑 制 剂 与 酶 液 混合 ，测 相 对 酶活 。 由表 4可看 出 ，EDTA 和 PMSF 对 酶 液 有 较 强 的抑 制 作 用 ，而碘 乙酸 和 13一巯 基 乙醇 的抑 制 作用 较 轻 微 ，可见 酶 液 中可 能 含 有 金 属 酶 、丝 氨 酸 酶 以 及 巯 基 酶 等 多 种 蛋 白 酶 。 表 4 抑制剂对酶 活力的影 响 3 讨论 在 发 酵 香 肠 成 熟 期 间 ，由 于 蛋 白 酶 的 存 在 ，蛋 白 质 会 发 生 降 解 产 生 小 肽 、游 离 氨基 酸 、胨 等 物 质 ，部 分 氨基 酸 随 后脱 羧 、脱 氨 或 进 一 步代 谢 成 醛 、酮 等其 它 小 分 子 物 质 ，提 高 了 发 酵 香 肠 的 风 味 和 营 养 。部 分 研 究认 为 ，发 酵 香肠 中蛋 白质 分 解 主 要 是 由于肌 肉 中 的 内源蛋 白酶 引起 。但 近 年来 很 多研 究 证 明 ，乳 杆 菌 (包 括 干 酪 乳 杆 菌 、植 物 乳 杆 菌 、清 酒 乳 杆 菌 等 )能 分 泌 肽 酶 和 氨 肽 酶 『1-3]，它 们 能 将 多 肽 分 解 成 小 肽 和 氨 基 酸 。此外 ，又 有研 究 发 现 ，乳 杆 菌 细 胞 壁 结合 蛋 白 酶 对 肌 浆 蛋 白质 和 肌 原 纤 维 蛋 白 质 均 有 一 定 的 分 解 作 用『5．1Ol。还有 学 者 在 发 酵香 肠 制作 中添 加 了乳 杆 菌 蛋 白酶 ，使 其 干燥 和成 熟 时 间减 少 了 50％左 右 ， 并 获 得 了 较 好 的 产 品 风 味 l。 因 此 ，有 学 者 认 为 ， 尽 管 乳 杆 菌 中 蛋 白 酶 量 较 少 ，但 因 为 乳杆 菌在 发 酵 香 肠 发 酵 和 成 熟 过 程 中始 终 保 持 较 高 浓 度 ，所 以其 蛋 白酶 在 肌 肉蛋 白质 降解 过 程 中 所 起 的 作 用 不 可 忽 视 ， 故 肌 肉 中 蛋 白 质 的 分 解 是 内 源 蛋 白 酶 与 微 生 物 (乳 杆 菌 、微 球 菌 等 )协 同 作 用 的 结 果 。 本 文 对 干 酪 乳 杆 菌 蛋 白 酶 进 行 了 初 步 纯 化 及 部 分 酶 学 性 质 研 究 ，结 果 表 明 ， 酶 液 中 可 能 含 有 金 属 酶 、丝 氨 酸 酶 以 及 巯 基 酶 等 多 种 蛋 白酶 。 参考文献 ： 【1】 M D Femtndez-Espla， et a1． Purification and Chara— cterization of a Novel Sefine Aminopeptidase from Lac— tobaeillus easel Ssp．casei IFPL 73 1 叨．Asdc Food Chem， 1997，45：1624-1628． 【2】 M D Femdndez-Espla， et a1． Purification and Characterization of a Prolidase from Lac-tobaciUus casei Subsp． casei IFPL 731[J】． Applied and Environ—mentaL Microbiology，1997：314-316． 【3】 G ARORA， et a1． Purification and Characterization of Aminopeptidase from Lactobacillus casei Ssp．easel LLG [J】． Dairy Sci，1992。75：70o～710． [4] Hagen， et a1． Bacterial Pmteinase Reduces Maturation Time of Dry Fermented Sausage[J】．Food Sci， 1996， 61(5)： 1024～1029． [5】 Molly K， et a1． The Importance of Meat Enzymes in Ripening and Flavour Generation in Dry ferm ented Saus— ages， First Results of an European Project[J】．Food Chemis— try，1997，59：539-545． 【6】 徐伟民，周光宏，等．干发酵香肠发酵剂选择及其研究 南京农业大学硕士2OOl，8． 【7】 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