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金属螯合色谱分离提取初乳免疫球蛋白和乳铁蛋白

2012-08-22 3页 pdf 173KB 46阅读

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金属螯合色谱分离提取初乳免疫球蛋白和乳铁蛋白 研究与探讨 叁 兮电 魂 Vo 1 2 —0 1,2oO2 提取初乳免疫球蛋白和乳铁蛋白 (江南大学食品 学院,无锡 214036) 徐榕榕 周 培江 杨严俊 摘 要 对金 属螯合 色谱 分 离提取 初 乳免 疫球 蛋 白和乳 铁 蛋 白的 新 工 艺进 行 了研 究 ,并采 用 SDS-PAGE电 泳分析 法测 定 了分 离得 到的免 疫球 蛋 白和 乳铁 蛋 白的含 量 :试验 结 果 表 明 ,采 用金 属 螯合 色谱 可较好 地 分 离提取 免 疫球 蛋 白, 其 纯度 可达 89% 同时...
金属螯合色谱分离提取初乳免疫球蛋白和乳铁蛋白
研究与探讨 叁 兮电 魂 Vo 1 2 —0 1,2oO2 提取初乳免疫球蛋白和乳铁蛋白 (江南大学食品 学院,无锡 214036) 徐榕榕 周 培江 杨严俊 摘 要 对金 属螯合 色谱 分 离提取 初 乳免 疫球 蛋 白和乳 铁 蛋 白的 新 工 艺进 行 了研 究 ,并采 用 SDS-PAGE电 泳分析 法测 定 了分 离得 到的免 疫球 蛋 白和 乳铁 蛋 白的含 量 :试验 结 果 表 明 ,采 用金 属 螯合 色谱 可较好 地 分 离提取 免 疫球 蛋 白, 其 纯度 可达 89% 同时还 可分 离得 到g,iJ产品乳 铁 蛋 白,但 含 量较低 ,仅 为 33%一另外还 对影 响螯合 色谱 分 离的 因素 进 行 了初 步 的 探 讨 、 关 键词 免疫球 蛋 白 乳铁 蛋 白 金 属螯合 色谱 初 乳 分 离 Abstract Isolation Of ImmunogIobulin (Iq) and Lactofe r rin (Lf) f『Om colos rt rum whey by metaI chelate Interaction ch romatog raphy (MCIC) was studIed The contents Of Ig and Lf were dete rmined by SDS-PAGE analysis, respectively The results showed that the purity of Immunoglobulin Isolated bv MCIC was 89% . meanwhIle Lactofe rrIn was obtained with relative IOW content (33%) The factors affecting the sepa ration Of metaI chelate interaction chromatography also were studied Key words immunogIobuIin: Iactofe r rin: metaI chelate Interaction ch romatog raphy;colosrtrum; isolation 中图 分类 号 :TS201-2 文献 标识 码 :A 文 章 编 号 :1002—0306(2002)l1—0035—03 现 代 食 品 科 学 研 究 表 明 , 初 乳 富 含 免 疫 球 蛋 白 (Ig)、乳 铁 蛋 白 (U )、溶 菌 酶 、乳 过 氧 化 物 酶 等 生 物 活 性 因 子 。其 中 免 疫 球 蛋 白能 与 病 原 微 生 物 及 毒 素 等 抗 原 结 合 , 从 而 保 护 新 生 幼 仔 在 自身 免 疫 系 统 发 育 成 熟 前 免 遭 病 原 侵 袭 ⋯。而 乳 铁 蛋 白 的 主 要 功 能 为 广 谱 抗 菌 ,促 进 淋 巴 细 胞 生 长 ,增 强 人 体 免 疫 功 能 ;促 进 婴 幼 JLx~铁 的 吸 收 ,防 止 贫 血 ;另 J'l-还 可 促 进 新 生 JL4,肠 的 生 长 ,防 止 婴 幼 儿 发 生 短 肠 综 合 症 ,增 加 对 营 养 物 质 的 吸 收I J。 因此 ,初 乳 可 以说 是 乳 功 能 性 食 品 的代 表 性 资 源 ,食 品科 学 家 一 直 围绕 着 如 何 充 分 利 用 丰 富 的 初 乳 资 源 进 行 研 究 。 尽 管 牛 初 乳 本 身 是 一 种 功 效 显 著 的纯 天 然 功 能 性 食 品 的 原 料 ,但 由 于 初 乳 为 生 理 异 常 乳 ,特 别 是 产 收稿 日期 :2o02—08—23 作者 简 介:徐 榕榕 ,女 ,本科 ,助 工 犊 3d 内 的 最 为 明 显 , 它 除 了 富 含 功 能 性 因 子 外 ,同 时 也 含 有 无 益 甚 至 有 害 的 成 分 。 而 由 于 仞 乳 成 分 复 杂 ,分 离 十分 困难 。因 此 如 何 利 用 现 代 分 离 技 术 分 离 提 取 初 乳 中 重 要 的 活 性 物 质 一 免 疫 球 蛋 白 和 乳 铁 蛋 白 ,就 成 为 开 发 初 乳 产 品 的 关 键 。 本 文 的 主 要 工 作 是 采 用 生 物 分 离 新 技 术 一 金 属 螯 合 色 谱 , 从 初 乳 中 分 离 提 取 免 疫 球 蛋 白 和 乳 铁 蛋 白 ,从 而 为 初 乳 分 离 重 组 产 品 的 开 发 打 下 基 础 : 1 与方法 1.1 材料与仪器 初 乳 无 锡 市 马 山 牛 奶 公 司 ;Chelating Sepharose Fast F1OW Pharmacia公 司 ;SDS—PAGE 电 泳 用 试 剂 均 为 Sigma 公 司 ; 其 它 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 ..DYY一Ⅲ 电 泳 仪 北 京 六 一 仪 器 厂 ;梯 度 混 合 仪 上 海 沪 西 仪 器 厂 ;蠕 动 泵 海 西 仪 器 厂 ; BSZ一1O0 部 分 收 集 仪 上 海 沪 两 仪 器 厂 ;760 双 光 束 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 上 海 第 三 分 析 仪 器 厂 一 1.2 实验方 法 1.2.1 初 乳 清 的 制 备 新 鲜 初 乳 经 纱 布 过 滤 后 ,离 12"分 离 3000r/min,30min,弃 去 上 层 的 残 余 油 脂 和 底 部 的 沉 淀 物 ,得 到 去 脂 初 乳 ,然 后 再 以 去 脂 初 乳 :生 理 盐 水 =1:3的 比 例 稀 释 。调 节 pH 至 4.6,住 34 下 恒 温 培 养 30min 后 离 心 4o0Or/min,20min,弃 去 上 层 的 残 余 油 脂 和 底 部 的 酪 蛋 白沉 淀 ,得 到 初 乳 清 = 1.2,2 金 属 螯 合 色 谱 柱 的 制 备 取 Chelating Sepharose Fast Flow 16ml 装 柱 (1,6 x2Oem),用 0.05mol/L CuC12溶 液 上 柱 , 使 柱 子 上 端 1/2至 2/3 部 分 成 为 载 Cu 树 脂 。再 用 5倍 柱 体 积 的 去 离 子 水 洗 涤 , 去 除 未 吸 附 的 Cu , 最 后 再 用 0.05mol/L Tris— HAc/O.5mol/L NaC1起 始 缓 冲 液 平 衡 色 谱 柱 ,待 用 : 1.23 金 属 螫 合 色 谱 分 离 组 分 的 收 集 和 分 析 自 E 样 起 ,用 自 动 收 集 仪 收 集 洗 脱 液 ,每 管 5ml,在 280nm 下 测 定 其 吸 光 度 值 (0D ),并 绘 制 洗 脱 曲 线 相 关 组 分 用 SDS—PAGE 电 泳 分 析 其 成 分 、 ll 。 一一 氯√ ~ 维普资讯 http://www.cqvip.com 1.2.4 脂 肪 的 测 定 脂 肪 的 提 取 与 测 定 采 用 索 舳 提 法 进 行 I 1.2.5 sI)S—PAGE 电 泳 方 法 金 属 螯 合 色 各 分 离 组 分 采 用 SI)S—l AGE 法 测 定 I I 2 结果与讨论 2.1 初乳清 的分 离提取 初 乳 由 于 含 有 大 量 的 蛋 白 质 和 脂 肪 ,所 以 其 粘 度 远 大 于 常 乳 : 离 心 分 离 后 的 脂 肪 残 留 高 达 o.5% 左 右 针 对 卞玎乳 较 不 稳 定 的 特 性 ,我 们 在 制 备 初 乳 清 果 ”j去 脂 初 乳 :牛 理 盐 水 =1:3 的 比 例 侨 释 后 ,冉 调 擎 pH 至 4.6,然 后 离 心 去 除 酪 蛋 白 ,这 样 既 最 大 限 度 地 上 除 J 酪 蛋 白 . 又 减 少 了 在 制 备 初 乳 清 时 因 免 疫 球 蛋 白 或 乳 铁 蛋 Fj与 酪 蛋 白 发 生 共 沉 淀 而 造 成 的 损 夫 .同 时 也 进 一 步 降 低 了 脂 肪 的 残 余 含 量 2_2 金属 螯合 色谱分 离免疫球蛋 白和乳铁蛋 白 金 属 螫 合 色 谱 是 一 种 利 用 金 属 离 子 与 蚩 白 质 {, 的 某 螳 氰 基 酸 . 如 组 氨 酸 等 特 有 的 亲 和 力 进 行 分 离 纯 化 的 新 型 色谱 分 离 技 术 ,它 具 有 条 件 温 和 ,分 离 的 蛋 白 质 活 性 回 收 率 较 高 。 同 时 操 作 较 为 简 单 ,具 有 较 高 的 处 能 力 ,使 用 寿 命 也 较 长 ,适 宜 于 生 物 活 性 蛋 白 的 分 离 纯 化 本 实 验 尝 试 用 于 分 离 提 取 初 乳 清 中 的 免 疫 球 蛋 白 和 乳 铁 蛋 白 。 2.2.1 离 子 强 度 的 影 响 在 pH8.0~2.8 的 连 续 梯 度 洗 脱 时 ,洗 脱 液 含 0.5mol/L NaCI的 条 件 下 ,共 得 到 网 个 冼 脱 组 分 ,分 别 为 UB,P.,P2和 P 经 电 泳 分 析 证 实 ,其 中 UB 主 要 含 B一乳 球 蛋 白 、 一乳 白 蛋 白 及 牛 m 清 白 蛋 白 (BSA);P.主 要 为 乳 铁 蛋 白 ,牛 ff『L清 白 蛋 白 和 免 疫 球 蛋 白 ;而 P 、 则 为 免 疫 球 蛋 白 ( 网 1) 洗 脱 液 不 含 NaC1时 分 离 能 力 大 大 下 降 ,除 J’ L_B 峰 外 ,仅 得 到 一 个 组 分 ,免 疫 球 蛋 白 与 乳 铁 蛋 Fj 完 伞 没 有 得 到 分 离 (数 据 末 发 表 )。 由 此 可 见 , 离 子 强 度 的 适 当 增 加 可 提 高 洗 脱 液 的 分 离 能 力 ,有 利 于 在 分 离 免 疫 球 蛋 白 的 同 时 也 僻 到 乳 铁 蛋 白 但 如 果 洗 脱 液 离 子 强 度 过 大 町 能 会 将 所 有 蛋 白 都 不 加 选 择 地 洗 脱 下 来 , 从 而 导 致 分 离 能 力 F 降 , 另 外 还 会 造 成 待 分 离 样 品 中 的 蛋 白 发 牛 沉 淀 ,导 致 色谱 柱 的 污 染 。综 合 两方 面 的 影 响 .在 此 实 验 中 采 用 0.5mol/L NaC1的 浓 度 较 为 合 适 。 2.2.2 (:·11 应 用 量 的 影 响 将 Cu 应 用 量 从 1Oral降 至 7ml时 ,任 相 同 加 样 量 的 情 况 下 ,洗 脱 得 到 的 未 吸 附 峰 的 峰 面 积 变 大 (见 图 1和 图 2中 的 UB峰 ),这 _『 能 是 冈 为 Cu 的 减 少 使 柱 上 町结 合 蛋 白 的 位 点 减 少 . 导 致 柱 结 合 能 力 下 降 ,从 而 造 成 未 吸 附 蛋 白量 的 增 加 另 外 ,洗 脱 下 来 的 免 疫 球 蛋 白 组 分 峰 (图 2 中 的 P 峰 )则 没 有 什 么 变 化 ,但 乳 铁 蛋 白 组 分 峰 (即 图 2 中 的 P 峰 )中 乳 铁 蛋 白 的 含 量 则 略 有 提 高 ,从 24% 升 高 至 33% (见 图 3)一 2.2.3 卡玎乳 清 佯 量 的 影 响 乳 清 中 各 组 分 与 Cu 36 食i·|I斜岐 2002.11 研究与探讨 洗 脱体 积(m1) 图 1 初乳 清金属 螯合 色谱分 离图 样 :20ml初乳 清 ;Cu 应用 量 :10ml 0.05mol/L CuC1 溶液 洗脱方法 :pH8.0--2.8 O.05n~)L/L Tris-HA~、/0.5mol/L NaC1梯度洗脱 洗脱 体积 (m1) 图 2 初 乳清金 属螯 合色谱 分离 图 上样 量 :20ml初 乳清 ;Cu 应用量 :7ml O.05mol/L CuC1 溶 液 ; 洗脱方法 :pH8.0--2.8 0.05mol/L Trks-HAc/0.5mol/I NaC1梯度洗脱 一 I-r — BSA — Ig HC — Ig LC l 2 3 4 5 6 7 8 3 色谱 分离组 分 的 DSD—PAGE 电泳 图谱 1=初 乳清 ;2=UB组 分 ;3=图 1中 的 P 、P 合并 组 分 ;4=图 2中的 P 组 分 ;5= 1中的 PI组 分 ;6=I-r标样 ;7=牛 IgG标样 ;8= BSA 标样 : 螯 合 色 谱 柱 亲 和 力 的 大 小 可 按 如 下 顺 序 排 列 :B一乳 球 蛋 白 < 一乳 白 蛋 白<牛 血 清 白 蛋 白 <乳 铁 蛋 白
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