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牛初乳乳铁蛋白的分离及纯化

2012-08-22 2页 pdf 124KB 21阅读

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牛初乳乳铁蛋白的分离及纯化 工艺技术 牛 蠢 离 黝 (天津 商学院生物工程 系,天 津 300134) 凌雪萍 庞 广 昌 李 国强 擒 一 乳铁 蛋 白(Lactoferrin,简称 Lf)作 为一 种糖 蛋 白 ,主要 存 在 于哺乳 动物 的各种 外分泌 物 中 ,如 乳 汁 、眼泪 、唾 液等 ,乳 汁尤其 是初 乳 中 Lf的含 量很 高【”。本 文通 过 盐析 法和 有 机 溶 剂沉淀 法从 牛初 乳 中 分 离出乳铁 蛋 白,并 应用 酶联 免疫 法鉴 定各 步骤 中 分 离的乳铁 蛋 白 ,获得 的 乳铁 蛋 白 ...
牛初乳乳铁蛋白的分离及纯化
工艺技术 牛 蠢 离 黝 (天津 商学院生物工程 系,天 津 300134) 凌雪萍 庞 广 昌 李 国强 擒 一 乳铁 蛋 白(Lactoferrin,简称 Lf)作 为一 种糖 蛋 白 ,主要 存 在 于哺乳 动物 的各种 外分泌 物 中 ,如 乳 汁 、眼泪 、唾 液等 ,乳 汁尤其 是初 乳 中 Lf的含 量很 高【”。本 文通 过 盐析 法和 有 机 溶 剂沉淀 法从 牛初 乳 中 分 离出乳铁 蛋 白,并 应用 酶联 免疫 法鉴 定各 步骤 中 分 离的乳铁 蛋 白 ,获得 的 乳铁 蛋 白 的相 对分子 量 为 75,000Da。 关■诩 乳铁蛋白 盐析 有机溶剂沉淀 酶联免疫 Abstract The lactoferrin, an iron-binding glycoprotein,is presented in numerous exocrine secretions of mammaIs,including milk,tears,saliva,and so on M}lk, especially colostrum contains lactoferrin at a much higher IeveI than others.In this paper.Lf was separated and purified by salt-out and organic reagents precipitation fr0m bovine colostrums.and it was measured by enzyme-linked jm munosorbent assay (ELtSA).For the acquired lactoferrin,the molecular weight was estimated at 75.oO0Da.and the purltv was about 45% . Key words lactoferrin (Lf); salt—out;organic reagent precipitation;ELlSA 中图分类号 :TS201,2 1 文献标识码 A 文 章 编 号 :1002-0306(2002)12一OO4O一02 乳 铁 蛋 白 (Laetoferrin,L0又 称 “乳 转 铁 蛋 白 ”,是 一 种 糖 蛋 白 ,属 于 转 铁 蛋 白 家 族 。 因 其 晶体 呈 红 色 , 故 也 有 学 者 称 之 为 “红 蛋 白 ”。 U 具 有 广 谱 的 抗 菌 性 质 ,同 时 还 能 够 增 强 机 体 的抗 病 毒 、抗 癌 能 力 和 免 疫 能 力 ,防 治 感 染 性 疾 病 。最 早 获 得 的 乳 铁 蛋 白 (L0粗 制 品 是 在 乳 过 氧 化 物 酶 (LP)制 备 中 获 得 的 t2l,目前 主 要 有 离 子 交 换 层 析 法 【 、超 滤 法 等 阎。 本 研 究 主 要 通 过 简 单 易 行 的 硫 酸 铵 沉 淀 和 乙 醇 沉 淀 对 新 鲜 牛 初 乳 进 行 分 离 ,以 获 得 一 定 纯 度 的 U。 本 实 验 获 得 的 Lf分 子 量 为 75,000Da,其 纯 度 大 约 为 45% 。 1 材料与方法 1.1 材料 与设备 牛 初 乳 天 津 华 明 乳 业 公 司 ;低 分 子 量 标 准 蛋 收稿 日期 :2002—07—02 作者简介 :凌雪萍(1977一),女 ,研 究生,研 究方向:牛初乳中乳铁蛋 白的分离、纯化及其酶解特性。 白 上 海 东 风 试 剂 厂 生 产 ;硫 酸 铵 、无 水 乙 醇 、SDS— PAGE 试 剂 、ELISA 试 剂 生 化 实 验 室 提 供 ;标 准 乳 铁 蛋 白 (Laetoferrin bovine)(ICN Biomedicals Ine),酶 标 乳 铁 蛋 白抗 体 (Goat anti-Bovine Lactoferrin HRP Conjugated)(Bethyl Inc)。 FS一1型 实 验 搅 拌 机 , 电 泳 仪 (B10一RAD), BECKMEN 离 心 机 ,40孑L酶 标 板 (浙 江 省 玉 环 县 康 佳 医 化 器 械 厂 ),稀 释 棒 (25tx1)。 1-2 Lf的分 离 采 集 奶 牛 产 牛 犊 后 前 两 天 的 新 鲜 初 乳 进 行 分 离 ,其 分 离 过 程 见 图 1。 新鲜初 乳 1 室 温 ,3000r/min,离心 30min脱 脂 脱 脂 乳 1 用 lmo1/L HCI调 pH 于 4.6,室温放 置 20min 4℃ ,10000r/min,离心 30min除 去酪蛋 白 酸 乳清 1 半饱 和硫 酸铵 沉 淀 20min 4℃ ,10000r/min,离心 30min除 去球蛋 白 上 清液 1 pH 8.5.85%饱和硫 酸铵 沉 淀 20min 4℃ ,10000r/min,离心 30min收 集沉 淀 沉 淀 (以蒸馏 水溶 解 ) 1 pH 8.5,终 浓度 为 65%的 乙醇沉淀 4℃ ,10000r/min。离心 30min收集 沉淀 沉淀 (以蒸馏 水溶 解 ) 图 1 牛初乳 中 Lf的分 离过程 图 1.3 Lf的鉴定 该 实 验 通 过 ELISA 法 鉴 定 t 。 标 准 U 用 碳 酸 盐 缓 冲 液 配 置 ,其 浓 度 为 0.02mg/ml。对 脱 脂 乳 、硫 酸 铵 沉 淀 和 乙 醇 沉 淀 分 离 得 到 的 上 清 液 及 溶 解 后 的 沉 淀 液 均 进 行 鉴 定 ,其 测 定 结 果 见 1。 1.4 SDS—PAGE 电泳[741 采 用 非 连 续 性 SDS—PAGE 电 泳 , 凝 胶 浓 度 为 7.5% 。 其 电 泳 图 谱 见 图 2。 维普资讯 http://www.cqvip.com 工艺技木 表 1 ELISA测定数据表 Vo 1.23,No.1 2,2(3(32 2 结果与分析 采 用 ELISA 方 法 测 定 两 次不 同浓 度 的硫 酸 铵 沉 淀 和 一 次 乙 醇 沉 淀 分 离得 到 的 含 有 Lf的 组 分 ,其 效 价 见 表 1。 由 表 l可 知 ,最 终 分 离 得 到 的 样 品 中 IJf的 效 价 和脱 脂 乳 中相 同 ,这 说 明 在 分 离 过 程 中 Lf活 性 和 含 量 损 失 都 很 小 。 .I● ■■● 再工 2∞ I7口● ■ 图 2 电泳图谱 SDS—PAGE 非 连 续 凝 胶 电 泳 显 示 , 最 终 分 离 液 中 存 在 6种 成 分 。通 过 凝 胶 成 像 系 统 分 析 获 知 ,Lf的 纯 度 大 约 为 45% , 和 中 分 子 量 的 标 准 蛋 白 相 比 较 估 计 获 得 的 Lf分 子 量 为 75,000Da。 3 讨 论 目前 国 内 对 Lf的 研 究 不 多 , 主 要 是 因 为 其 分 离 过 程 繁 琐 ,纯 化 困 难 ,难 于 工 业 化 生 产 。 本 实 验 的 目 的 是 探 索 出 一 条 适 合 工 业 化 生 产 乳 铁 蛋 白 的路 径 , 因 此 必 须 兼 顾 大 规 模 和 高 效 两 个 特 点 。 目前 已有 几 种 较 为 成 熟 的 乳 铁 蛋 白 生 产 方 法 ,如 吸 附 色 谱 法 、离 子交 换 色 谱 法 、亲 和 色 谱 法 、固定 化 单 克 隆 抗 体 法 和 超 滤 法 。其 中 ,亲 和 色 谱 法 和 固 定化 单 克 隆 抗 体 法 能 够 产 生 出 纯 度 很 高 的乳 铁 蛋 白 ,一 般 运 用 于 医药 行 业 ,而 其 价 格 昂 贵 ,技 术 要 求 高 ,所 以 并 不 适 用 于 工 业 化 生 产 。 此 外 ,超 滤 法 简 便 费 用 低 ,易 形 成 工 业 化 生产 ,但 乳 铁 蛋 白纯 度 低 ,膜 需 要 经 常 清 洗 。 我 们 目 前 选 用 的 有 机 溶 剂 和 盐 沉 淀 法 恰 恰 考 虑 到 了 工 业 化 生 产 的需 求 :采 用 两 次 硫 酸 铵 沉 淀 和 一 次 乙 醇 沉 淀 分 离 纯 化 Lf,最 终 纯 度 达 到 45%左 右 ,相 对 于 目前 报 道 所 用 的 离 子 交 换 层 析 和 凝 胶 层 析 方 法 比 较 简 单 , 易 于 操 作 ,而 且 成 本 相 对 也 低 ,适 用 于 保 健 品 和 食 品 添 加 剂 等 纯 度 要 求 不 高 的 行 业 ,但 对 于 医 药 行 业 高 纯 度 的 要 求 还 有 一 定 的 距 离 , 可 考 虑 通 过 凝 胶 层 析 分 离 获 得 纯 Lf。 我 国 约 有 420万 头 牛 ,除 喂 养 牛 犊 外 ,富 余 牛 初 乳 应 在 8-10万 t以 上 。 因 此 , 生 产 乳 铁 蛋 白 的 原 料 (初 乳 )廉 价 、丰 富 ,在 我 国 有 生 产 利 用 乳 铁 蛋 白的 基 础 ,经 过 广 泛 和 深 入 的 研 究 ,可 望 实 现 乳 铁 蛋 白 的 工 业 化 生 产 。 同 时 ,Lf酶 解 得 到 的 短 肽 ,具 有 广 谱 抗 菌 活 性 , 它 们 有 望 作 为 一 种 天 然 抗 菌 组 分 获 得 广 泛 应 用 [9-“]。它 们 可 以用 作 食 品 和 化 妆 品 的天 然 防腐 剂 ,也 可 作 为 新 一 代 疗 效 性 食 品 的功 能 组 分 ,防 治 感 染 性 疾 病 。 因 此 ,牛 初 乳 中 乳 铁 蛋 白 的 开 发 利 用 具 有 重 要 意 义 和 广 阔 的 开 发 前 景 。 参考文献 1 Yamauchi,K.Tomita,M.Giehl,T.and Ellison,R.Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment.Infection and Immunity,1993,61(2):719-728 2 曹劲松.初乳功能性食品.北京:中国轻工业出版社,20o0 3 Ye,Xiuyun.Yoshida,Shigeru. and NG,T.B. Isolation of lactoperoxidase,lactoferrin,d —lactalbumin,B —lactoglobumin B and B—lactoglobumin A from bovine rennet whey using ion exchange chromatiography. e International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2000,32:1 143-1 150 4 王 崇道,强 亦忠.乳铁 蛋 白(U)的提 纯及其 放 射 免疫 分 析在 肺癌诊 断中的应用.同位素,1999,12(1):5-9 5 Dionysius,D.A.Herse, J.B.and Grieve,P.A. Extration of lactoperoxidase and lactoferrin from whey using batch ion exchange techniques.The Australian Journal of Dairy Technology,1991(9):72-75 6 于长青,等.超滤技 术制备乳铁蛋 白制品工艺的研究.黑龙江 八一农垦大学学报,1999,11(3):56~61 7 庞广昌、生物化学实验技 术.河南科学技术出版社.1994 8 郭晓君.蛋 白质电泳实验技术.科 学出版社,1999 9 Bellamy,W .Takase,M. W akabayashi,H. Kawase,K. an d Tomita,M.Antibacterial spectrum of lactoferricin B,a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin.Applied Bacteriology,1992,73:472-479 10 Shim,K. Yamauchi,K. et a1. Antibacterial activit、r of bovine lactoferrin and its peptides against enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7、 e society for Applied Microbiology ,1998,26:407-41 1 l1 Wakabayashi,Hiroyuki.Bellamy。W ayne. et a1. Inactivation of Listeria monocytogenes by lactoferricin,a potent antimicrobial peptide derived from COW’S milk. Food Protection,1992,55(4):238~240 {l重 ≮ 维普资讯 http://www.cqvip.com
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