牛初乳乳铁蛋白的分离及纯化
工艺技术
牛 蠢 离 黝
(天津 商学院生物工程 系,天 津 300134) 凌雪萍 庞 广 昌 李 国强
擒 一 乳铁 蛋 白(Lactoferrin,简称 Lf)作 为一 种糖 蛋 白 ,主要 存 在
于哺乳 动物 的各种 外分泌 物 中 ,如 乳 汁 、眼泪 、唾 液等 ,乳
汁尤其 是初 乳 中 Lf的含 量很 高【”。本 文通 过 盐析 法和 有
机 溶 剂沉淀 法从 牛初 乳 中 分 离出乳铁 蛋 白,并 应用 酶联
免疫 法鉴 定各 步骤 中 分 离的乳铁 蛋 白 ,获得 的 乳铁 蛋 白 ...
工艺技术
牛 蠢 离 黝
(天津 商学院生物
系,天 津 300134) 凌雪萍 庞 广 昌 李 国强
擒 一 乳铁 蛋 白(Lactoferrin,简称 Lf)作 为一 种糖 蛋 白 ,主要 存 在
于哺乳 动物 的各种 外分泌 物 中 ,如 乳 汁 、眼泪 、唾 液等 ,乳
汁尤其 是初 乳 中 Lf的含 量很 高【”。本 文通 过 盐析 法和 有
机 溶 剂沉淀 法从 牛初 乳 中 分 离出乳铁 蛋 白,并 应用 酶联
免疫 法鉴 定各 步骤 中 分 离的乳铁 蛋 白 ,获得 的 乳铁 蛋 白
的相 对分子 量 为 75,000Da。
关■诩 乳铁蛋白 盐析 有机溶剂沉淀 酶联免疫
Abstract The lactoferrin, an iron-binding glycoprotein,is
presented in numerous exocrine secretions of
mammaIs,including milk,tears,saliva,and so on M}lk,
especially colostrum contains lactoferrin at a much
higher IeveI than others.In this paper.Lf was
separated and purified by salt-out and organic
reagents precipitation fr0m bovine colostrums.and it
was measured by enzyme-linked jm munosorbent
assay (ELtSA).For the acquired lactoferrin,the
molecular weight was estimated at 75.oO0Da.and
the purltv was about 45% .
Key words lactoferrin (Lf); salt—out;organic reagent
precipitation;ELlSA
中图分类号 :TS201,2 1 文献标识码 A
文 章 编 号 :1002-0306(2002)12一OO4O一02
乳 铁 蛋 白 (Laetoferrin,L0又 称 “乳 转 铁 蛋 白 ”,是
一 种 糖 蛋 白 ,属 于 转 铁 蛋 白 家 族 。 因 其 晶体 呈 红 色 ,
故 也 有 学 者 称 之 为 “红 蛋 白 ”。 U 具 有 广 谱 的 抗 菌 性
质 ,同 时 还 能 够 增 强 机 体 的抗 病 毒 、抗 癌 能 力 和 免 疫
能 力 ,防 治 感 染 性 疾 病 。最 早 获 得 的 乳 铁 蛋 白 (L0粗
制 品 是 在 乳 过 氧 化 物 酶 (LP)制 备 中 获 得 的 t2l,目前 主
要 有 离 子 交 换 层 析 法 【 、超 滤 法 等 阎。
本 研 究 主 要 通 过 简 单 易 行 的 硫 酸 铵 沉 淀 和 乙 醇
沉 淀 对 新 鲜 牛 初 乳 进 行 分 离 ,以 获 得 一 定 纯 度 的 U。
本 实 验 获 得 的 Lf分 子 量 为 75,000Da,其 纯 度 大 约 为
45% 。
1 材料与
1.1 材料 与设备
牛 初 乳 天 津 华 明 乳 业 公 司 ;低 分 子 量 标 准 蛋
收稿 日期 :2002—07—02
作者简介 :凌雪萍(1977一),女 ,研 究生,研 究方向:牛初乳中乳铁蛋
白的分离、纯化及其酶解特性。
白 上 海 东 风 试 剂 厂 生 产 ;硫 酸 铵 、无 水 乙 醇 、SDS—
PAGE 试 剂 、ELISA 试 剂 生 化 实 验 室 提 供 ;标 准 乳
铁 蛋 白 (Laetoferrin bovine)(ICN Biomedicals Ine),酶
标 乳 铁 蛋 白抗 体 (Goat anti-Bovine Lactoferrin HRP
Conjugated)(Bethyl Inc)。
FS一1型 实 验 搅 拌 机 , 电 泳 仪 (B10一RAD),
BECKMEN 离 心 机 ,40孑L酶 标 板 (浙 江 省 玉 环 县 康
佳 医 化 器 械 厂 ),稀 释 棒 (25tx1)。
1-2 Lf的分 离
采 集 奶 牛 产 牛 犊 后 前 两 天 的 新 鲜 初 乳 进 行 分
离 ,其 分 离 过 程 见 图 1。
新鲜初 乳
1
室 温 ,3000r/min,离心 30min脱 脂
脱 脂 乳
1 用 lmo1/L HCI调 pH 于 4.6,室温放 置 20min
4℃ ,10000r/min,离心 30min除 去酪蛋 白
酸 乳清
1 半饱 和硫 酸铵 沉 淀 20min
4℃ ,10000r/min,离心 30min除 去球蛋 白
上 清液
1 pH 8.5.85%饱和硫 酸铵 沉 淀 20min
4℃ ,10000r/min,离心 30min收 集沉 淀
沉 淀 (以蒸馏 水溶 解 )
1 pH 8.5,终 浓度 为 65%的 乙醇沉淀
4℃ ,10000r/min。离心 30min收集 沉淀
沉淀 (以蒸馏 水溶 解 )
图 1 牛初乳 中 Lf的分 离过程 图
1.3 Lf的鉴定
该 实 验 通 过 ELISA 法 鉴 定 t 。 标 准 U 用 碳 酸 盐
缓 冲 液 配 置 ,其 浓 度 为 0.02mg/ml。对 脱 脂 乳 、硫 酸 铵
沉 淀 和 乙 醇 沉 淀 分 离 得 到 的 上 清 液 及 溶 解 后 的 沉 淀
液 均 进 行 鉴 定 ,其 测 定 结 果 见
1。
1.4 SDS—PAGE 电泳[741
采 用 非 连 续 性 SDS—PAGE 电 泳 , 凝 胶 浓 度 为
7.5% 。 其 电 泳 图 谱 见 图 2。
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工艺技木
表 1 ELISA测定数据表
Vo 1.23,No.1 2,2(3(32
2 结果与分析
采 用 ELISA 方 法 测 定 两 次不 同浓 度 的硫 酸 铵 沉
淀 和 一 次 乙 醇 沉 淀 分 离得 到 的 含 有 Lf的 组 分 ,其 效
价 见 表 1。
由 表 l可 知 ,最 终 分 离 得 到 的 样 品 中 IJf的 效 价
和脱 脂 乳 中相 同 ,这 说 明 在 分 离 过 程 中 Lf活 性 和 含
量 损 失 都 很 小 。
.I● ■■● 再工
2∞
I7口● ■
图 2 电泳图谱
SDS—PAGE 非 连 续 凝 胶 电 泳 显 示 , 最 终 分 离 液
中 存 在 6种 成 分 。通 过 凝 胶 成 像 系 统 分 析 获 知 ,Lf的
纯 度 大 约 为 45% , 和 中 分 子 量 的 标 准 蛋 白 相 比 较 估
计 获 得 的 Lf分 子 量 为 75,000Da。
3 讨 论
目前 国 内 对 Lf的 研 究 不 多 , 主 要 是 因 为 其 分 离
过 程 繁 琐 ,纯 化 困 难 ,难 于 工 业 化 生 产 。 本 实 验 的 目
的 是 探 索 出 一 条 适 合 工 业 化 生 产 乳 铁 蛋 白 的路 径 ,
因 此 必 须 兼 顾 大 规 模 和 高 效 两 个 特 点 。 目前 已有 几
种 较 为 成 熟 的 乳 铁 蛋 白 生 产 方 法 ,如 吸 附 色 谱 法 、离
子交 换 色 谱 法 、亲 和 色 谱 法 、固定 化 单 克 隆 抗 体 法 和
超 滤 法 。其 中 ,亲 和 色 谱 法 和 固 定化 单 克 隆 抗 体 法 能
够 产 生 出 纯 度 很 高 的乳 铁 蛋 白 ,一 般 运 用 于 医药 行
业 ,而 其 价 格 昂 贵 ,技 术 要 求 高 ,所 以 并 不 适 用 于 工
业 化 生 产 。 此 外 ,超 滤 法 简 便 费 用 低 ,易 形 成 工 业 化
生产 ,但 乳 铁 蛋 白纯 度 低 ,膜 需 要 经 常 清 洗 。 我 们 目
前 选 用 的 有 机 溶 剂 和 盐 沉 淀 法 恰 恰 考 虑 到 了 工 业 化
生 产 的需 求 :采 用 两 次 硫 酸 铵 沉 淀 和 一 次 乙 醇 沉 淀
分 离 纯 化 Lf,最 终 纯 度 达 到 45%左 右 ,相 对 于 目前 报
道 所 用 的 离 子 交 换 层 析 和 凝 胶 层 析 方 法 比 较 简 单 ,
易 于 操 作 ,而 且 成 本 相 对 也 低 ,适 用 于 保 健 品 和 食 品
添 加 剂 等 纯 度 要 求 不 高 的 行 业 ,但 对 于 医 药 行 业 高
纯 度 的 要 求 还 有 一 定 的 距 离 , 可 考 虑 通 过 凝 胶 层 析
分 离 获 得 纯 Lf。
我 国 约 有 420万 头 牛 ,除 喂 养 牛 犊 外 ,富 余 牛 初
乳 应 在 8-10万 t以 上 。 因 此 , 生 产 乳 铁 蛋 白 的 原 料
(初 乳 )廉 价 、丰 富 ,在 我 国 有 生 产 利 用 乳 铁 蛋 白的 基
础 ,经 过 广 泛 和 深 入 的 研 究 ,可 望 实 现 乳 铁 蛋 白 的 工
业 化 生 产 。 同 时 ,Lf酶 解 得 到 的 短 肽 ,具 有 广 谱 抗 菌
活 性 , 它 们 有 望 作 为 一 种 天 然 抗 菌 组 分 获 得 广 泛 应
用 [9-“]。它 们 可 以用 作 食 品 和 化 妆 品 的天 然 防腐 剂 ,也
可 作 为 新 一 代 疗 效 性 食 品 的功 能 组 分 ,防 治 感 染 性
疾 病 。 因 此 ,牛 初 乳 中 乳 铁 蛋 白 的 开 发 利 用 具 有 重 要
意 义 和 广 阔 的 开 发 前 景 。
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